本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种人粪便中肠道菌群固定液及其制备方法。
背景技术：
基于粪便样本的人肠道菌群研究，是指通过采集人体粪便样本，对粪便中的菌群进行研究，其应用主要包括：(1)研究肠道菌群与人体疾病的关系，因为部分疾病受到肠道菌群代谢物影响，比如肥胖、高血压、糖尿病等；部分疾病发生之前肠道菌群会有变化，从而可在一定程度上进行预测；(2)研究用药物后肠道菌群的变化，如使用不同抗生素后肠道菌群的变化情况，以及是否某些抗生素作用比较低；或者使用激素类药物肠道菌群的变化等；可以研究到达肠道的药物作用情况；(3)研究肠道菌群与儿童营养吸收的关系，因为肠道菌群会帮助食物消化，产生人体需要的物质比如氨基酸，维生素，短链脂肪酸等，用来提高食物消化并对人的营养作用。
通过粪便来研究肠道菌群常见的方法有：基于细菌16s扩增子方法和基于细菌全基因metagenome研究方法，其过程主要包括：(1)采集粪便样本；(2)提取粪便中的微生物dna；(3)对dna进行高通量测序；(4)分析高通量测序获得的数据获得肠道菌群情况。其中第(1)步采集粪便样本，为了保证其中微生物(肠道菌群)各种微生物组成的不变，通常会进行冰冻保存，即将采集好的粪便在尽可能短的时间内放到尽可能-80℃低温冰箱进行保存。因为脱离了肠道内环境，在常温中停留时间越久，则肠道菌群越会发生改变，比如某些菌数量会变多，某些菌数量会变少，甚至全部死亡。由于实验条件和实验周期等限制，一般情况不可能立即进行第(2)步的dna提取。所以当提取时，粪便中的微生物组成已经与正常肠道环境中不同，研究也就没有办法获得真实结果。因此，需要开发新型的固定人粪便中肠道菌群的方法。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种人粪便中肠道菌群固定液及其制备方法，以在保证保存品质的基础上，延长收集的人体粪便在常温下的保存时间，避免将收集的人体粪便进行低温冻存所带来的不便；制备方法简单，应用范围广。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种人粪便中肠道菌群固定液，每1000ml固定液中，原料组分包括：400～600mmoltris-hcl、3～7molnacl、50～150mmoledta和/或edta-na2，余量为水。
在本发明的进一步实施方式中，原料组分还包括：1～3mol乙醇。
在本发明的进一步实施方式中，每1000ml固定液中，原料组分包括：500mmoltris-hcl、100mmoledta和/或edta-na2、5molnacl、2mol乙醇，余量为水。
在本发明的进一步实施方式中，tris-hcl的ph值为8.0。
在本发明的进一步实施方式中，水为去离子水。
第二方面，本发明提供了上述人粪便中肠道菌群固定液的制备方法，包括如下步骤：将所有的原料组分混合均匀，得到固定液。
第三方面，本发明提供了上述人粪便中肠道菌群固定液的使用方法，包括如下步骤：将采集的粪便加入到固定液中，避光保存。需要说明的是，将采集的粪便加入到固定液中，固定液的加入量，只需要浸没粪便即可。
在本发明的进一步实施方式中，保存的时间为0～30天。
在本发明的进一步实施方式中，保存的温度不高于40℃。
第三方面，本发明还保护上述人粪便中肠道菌群固定液在制备人粪便中肠道菌群固定产品中的应用。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明首次采用tris-hcl、nacl、edta和/或edta-na2为主要成分配制固定液，虽然tris-hcl、nacl、edta、edta-na2均为常见的缓冲液组分，其组合经常用于dna的提取缓冲液，但是国内外并没有报道过其组合具有固定肠道菌群的功能；
(2)本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液，其中的tris-hcl为缓冲液成分，dna在该溶液中会去质子化，提高其溶解性，与edta一同形成的te缓冲液，能有效的保护菌群中的dna降解；edta为金属螯合剂，能螯合细菌所需的微量金属元素，如镁等，使得这类酶不能发挥作用，从而阻断细菌的正常代谢活动，抑制细菌生长，具有一定的抑菌作用；nacl的主要作用是抑制细菌生长；乙醇的主要作用是抑制细菌生长；
(3)本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液，可以在保证保存品质(粪便中肠道菌群组成稳定)的基础上，延长收集的人体粪便在常温下的保存时间，避免将收集的人体粪便进行低温冻存所带来的不便；
(4)本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液，可以直接将粪便加入装有固定液的保存管中，然后常温避光保存即可，不需要进行低温冻存，使用简单；
(5)本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液制备方法简单，生产成本低，可控制在2～3元/ml，具有极广的应用价值。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例二中的粪便经不同处理后的肠道菌群的组成柱状图；
图2为本发明实施例二中的粪便经不同处理后的测序分析结果主成分分析聚类图；a—个体1；b—个体2；c—个体3；
图3为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物bifidobacterium相对丰度变化图；
图4为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物clostridium相对丰度变化图；
图5为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物bifidobacterium相对丰度变化图；
图6为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物collinsella相对丰度变化图；
图7为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物eubacterium相对丰度变化图；
图8为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物faecalibacterium相对丰度变化图；
图9为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物fusobacterium相对丰度变化图；
图10为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物parabacteroides相对丰度变化图；
图11为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物ruminococcus相对丰度变化图；
图12为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的微生物bacteroides相对丰度变化图；
图13为本发明实施例三中的粪便经不同处理后的主要功能基因相对丰度随时间变化的图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
实施例一：人粪便中肠道菌群固定液及制备
本实施例提供一种人粪便中肠道菌群固定液，每1000ml所述固定液中，原料组分包括：500mmoltris-hcl(ph值为8.0)、100mmoledta、5molnacl、2mol乙醇，余量为去离子水。
制备方法包括：先配制1000mmol/l的tris-hcl溶液(ph值为8.0)，量取500ml的tris-hcl溶液，加入100mmoledta、5molnacl和2mol乙醇，然后加入去离子水至1l，混合均匀，得到固定液。
实施例二：细菌16s扩增子研究肠道菌群组成
1、将同一个体一次排泄的粪便均分成30份采集，然后将采集的粪便分别放入含有等量的本发明实施例一制备得到的人粪便中肠道菌群固定液的30个采集管中，固定液能浸没粪便(下同)。
将30个样本在常温下放置0～9天(第0天表示采集当天)，每天冻存3管作为重复，再放入冰箱冷冻，9天后对所有冻存的粪便进行dna提取、测序和分析(具体操作为本领域常用的操作方法)。
分析后肠道菌群的组成柱状图如图1所示。途中不同颜色表示肠道菌群中不同种类的微生物。横坐标为天数，小数点后为每天重复的样(每天重复三次)。纵坐标为微生物的相对丰度。由图1可知，从第0天到第9天肠道菌群微生物组成的变化小，这种变化主要来源于采集点所致。结果说明本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液效果很好。
2、使用本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液进行粪便固定，同时使用国外产品进行固定，最长常温放置36天后进行细菌16s扩增子研究肠道菌群组成。由于需要粪便较多，因此选取不同个体进行粪便采集，具体方案及结果如下：
个体1(a)：使用含有等量的本发明实施例一制备得到的人粪便中肠道菌群固定液的采集管36个，分别采集同一个体一次排泄的36份粪便，常温下放置，从第0天(采集当天)开始每个3天冻存3管，全部冻存完毕后进行测序分析；
个体2(b)：使用含有等量的国外产品的采集管15个，分别采集同一个体一次排泄的15份粪便，常温下放置，每隔一周冻存3管，一共冻存5周，全部冻存完毕后进行测序分析；
个体3(c)：使用含有等量的国外产品的采集管15个，分别采集同一个体一次排泄的15份粪便，常温下放置，每隔一周冻存3管，一共冻存5周，全部冻存完毕后进行测序分析。
结果如下：使用主成分方法(通过对测序结果进行分析)对样本的物种组成进行分析，肠道菌群组成越相似的样本，聚得越紧密，肠道菌群组成越不相似的样品，样品间越疏远。由图2可以看出，个体1(a)的30个样本较个体2(b)和个体3(c)的15个样本聚得更集中，说明个体1(a)的30个样本非常相似。结果也说明，本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液较国外产品在固定肠道菌群状态方面效果更优。
实施例三：细菌全基因metagenome研究
使用本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液进行粪便固定，最长常温放置36天后进行细菌全基因组metagenome研究(具体操作为本领域常用的操作方法)，观察肠道菌群中微生物以及功能基因的变化情况，具体方案及结果如下：
将同一个体一次排泄的粪便均分成39份采集，然后将采集的粪便分别放入含有等量的本发明实施例一制备得到的人粪便中肠道菌群固定液的39个采集管中，固定液能浸没粪便(下同)，常温下放置。每隔3天取3管进行冻存，一共36天(采集当天也需要冻存3管)，全部冻存完毕后进行细菌全基因metagenome研究。
结果如下：1、图3-图12显示的是含量最高的10种微生物(包括：bifidobacterium、clostridium、bifidobacterium、collinsella、eubacterium、faecalibacterium、fusobacterium、parabacteroides、ruminococcus、bacteroides)，其相对丰度分别在36天中的变化情况。横坐标是不同样品，按照天数进行排列(即a01、a02、a03代表第3天冻存样品，b01、b02、b03代表第6天冻存样品，依此类推)，纵坐标是该菌的相对丰度。线的平滑度表示对应微生物丰度的变化。可以看出线相对较为平滑，说明肠道菌群中该微生物变化不大。需说明，由于不能百分百的混匀，因此会出现采集点上的偏差，由此也会出现波动，但均在统计学范围内。结果说明本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液效果很好。
2、图13是功能基因丰度随时间变化的图：横坐标是不同样品，按照天数进行排列，纵坐标是该类基因的相对丰度，线越平滑则变化越小。由图13可以看出，氨基酸代谢(aminoacidmetabolism)相关基因在常温放置36天情况下变化很小。结果说明本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液效果很好。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明首次采用tris-hcl、nacl、edta和/或edta-na2为主要成分配制固定液，虽然tris-hcl、nacl、edta、edta-na2均为常见的缓冲液组分，其组合经常用于dna的提取缓冲液，但是国内外并没有报道过其组合具有固定肠道菌群的功能；(2)本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液，其中的tris-hcl为缓冲液成分，dna在该溶液中会去质子化，提高其溶解性，与edta一同形成的te缓冲液，能有效的保护菌群中的dna降解；edta为金属螯合剂，能螯合细菌所需的微量金属元素，如镁等，使得这类酶不能发挥作用，从而阻断细菌的正常代谢活动，抑制细菌生长，具有一定的抑菌作用；nacl的主要作用是抑制细菌生长；乙醇的主要作用是抑制细菌生长；(3)本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液，可以在保证保存品质(粪便中肠道菌群组成稳定)的基础上，延长收集的人体粪便在常温下的保存时间，避免将收集的人体粪便进行低温冻存所带来的不便；(4)本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液，可以直接将粪便加入装有固定液的保存管中，然后常温避光保存即可，不需要进行低温冻存，使用简单；(5)本发明提供的人粪便中肠道菌群固定液制备方法简单，生产成本低，可控制在2～3元/ml，具有极广的应用价值。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。