本发明涉及菌群移植，具体涉及一种耐胃肠液肠道菌群固形物的制备方法、固形物、冻干粉及其制备方法。
背景技术：
1、菌群移植是一种将健康捐助者粪便中的肠道菌群移植给患者，从而调整或重建患者肠道菌群平衡的新技术。由于患者服用的外源性肠道菌群需要经过胃部才能够到达肠道内发挥作用，而胃中的h+会改变摄入菌群的zeta电位，从而改变菌群表面的渗透性，导致菌群死亡，且肠道中的胆盐也会溶解脂质，进而对菌群细胞结构造成破坏，使菌群失活。因此如何保护移植的外源性肠道菌群顺利进入到患者的肠道中并发挥作用，是菌群移植领域目前存在的难点和重点。
2、包埋技术是一种广泛应用于食品、医药、化妆品、农业和纺织等行业的科技手段，它涉及将一种或多种核心物质（如活性成分、细胞、酶等）包裹在一层或多层保护性壁材中，以提高其稳定性、控制释放、改善物理性质或提供其他功能性保护。目前，在益生菌领域中，包埋技术主要作用于提高益生菌在人体消化道中的存活率，即通过加入生物相容性材料，使单菌外层形成“盔甲”，从而赋予其一定的耐胃肠液破坏的能力，提升益生菌在胃肠道中的存活率及活菌数，保证疗效。
3、目前益生菌包埋技术报道有多种方法，如内源乳化法、pickering乳化法、复合凝聚法和多层包埋法等。上述各种方法通过不同的机制来保护益生菌免受胃肠液的破坏，但均存在有相应的缺点。内源乳化法需要添加油脂作为分散相，制备过程较为繁琐，增加了工艺成本，因此目前主要停留在实验室阶段；pickering乳化法由于单一粒子稳定的pickering乳液液滴之间易相互作用导致乳液体系降解，且需采取加热、复配和水解等方法改善其粒径、表面粗糙度和湿润性等，此外，可食用级的pickering固体颗粒种类有限，生物相容性和环境兼容性存在一定的局限性，制备过程复杂，生产成本较高，工业应用上存在困难；复合凝聚法的制备成本相对较高，工艺难度较大，微胶囊的溶解性和润湿性较差，给产品的应用带来不便；而多层包埋法制备步骤多，生产成本高，且微胶囊粒径普遍偏大，增加了益生菌芯材释放的难度，影响释放率。
4、此外，与一般的益生菌相比，肠道菌群的成分组成更为复杂，对包埋材料和包埋方法提出了更高的要求。基于此，提出适用于肠道菌群的包埋工艺对于肠道菌群移植具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于一种耐胃肠液肠道菌群固形物的制备方法、固形物、冻干粉及其制备方法。通过简单易行的技术方法赋予肠道菌群较好的耐胃肠液效果，并且采用可食用的生物相容性材料保证患者安全服用，同时降低生产成本，适配生产应用。
2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明的第一方面在于提供一种耐胃肠液肠道菌群固形物的制备方法，包括以下步骤：
4、s1.乳清钙悬浮液的配制：取乳清钙粉末，加入生理盐水混匀后，制成乳清钙浓度为1%～20%的悬浮液；
5、s2.菌悬液的制备：取健康捐助者的新鲜粪便样本，加入生理盐水，搅拌混匀后，进行过滤处理后，收集滤液，即得菌悬液；
6、s3.乳清钙包埋肠道菌群：将s2菌悬液离心后去上清，收集菌泥，将菌泥加入至s1乳清钙悬浮液中，其中所述菌泥重量与所述乳清钙悬浮液的添加比例按照质量体积比为1:1～1:20（w:v/g:ml），混匀后在摇床上孵育后离心，去上清，收集得到乳清钙包埋肠道菌群的固形物。
7、本发明利用乳清钙作为包埋的唯一生物相容性材料，通过物理、化学双重保护机制，赋予肠道菌群耐胃肠液破坏的能力。在物理保护机制方面，乳清中的钙离子与菌群细胞壁成分（如酸性多糖和蛋白质）发生交联反应，形成一层稳定的保护膜，即凝胶网络，这一过程构筑了肠道菌群的“物理盔甲”，有效隔绝并减少了胃肠液对菌群的侵蚀；此外，乳清蛋白在钙离子的作用下形成的凝胶结构进一步增强了这层“物理盔甲”的机械稳定性，为菌群提供了额外的保护。在化学保护机制方面，乳清钙中的钙离子能够与胃酸中的盐酸反应，形成可溶性的钙盐，这种ph缓冲能力有助于中和胃酸，为肠道菌群提供“化学盔甲”，保护其不受胃液h+的影响，维持高活性状态直至到达肠道。此外，乳清钙的粘附促进作用有助于菌群在肠道粘膜上的定植，作为营养物质又能够支持菌群在胃肠道中的生长和活性，并且乳清中的蛋白质和钙还改善了肠道菌群的耐热性，增强了其在加工和储存过程中的稳定性。
8、采用适当浓度的乳清钙悬浮液，以及适当的菌泥重量与乳清钙悬浮液的添加比例对于提高肠道菌群耐胃肠液能力非常重要；根据进一步的技术方案，s1所述乳清钙悬浮液的浓度为1%～10%；需要说明的是，乳清钙悬浮液浓度的单位应当理解为质量（g）体积（ml）浓度。
9、优选地，s1所述乳清钙悬浮液的浓度为1%～5%。
10、根据进一步的技术方案，s3所述菌泥重量与所述乳清钙悬浮液的添加比例为1:9～1:20。进一步地，s3所述菌泥重量与所述乳清钙悬浮液的添加比例为1:9较佳。
11、根据进一步的技术方案，s3中采用的孵育时间为1min～30min；
12、优选地，s3中采用的孵育时间为2min～5min。
13、根据进一步的技术方案，s3中采用的摇床转速为80rpm～600rpm；
14、优选地，s3中采用的摇床转速为200rpm～600rpm。
15、本发明的第二个方面在于提供一种耐胃肠液肠道菌群的固形物，其为采用上述的方法制备得到。
16、本发明的第三个方面在于提供一种耐胃肠液肠道菌群的冻干粉，所述冻干剂的制备原料包括上述耐胃肠液肠道菌群的固形物和肠道菌群冻干保护剂。制成冻干粉的样品更容易运输、保存，且能够相应地衍生开发出多种剂型，如片剂、丸剂等。
17、根据进一步的技术方案，s4所述肠道菌群冻干保护剂可以采用选自麦芽糖醇、木糖醇、鱼蛋白肽、海胆提取物、羟丙甲基纤维素、黄原胶、甘露寡糖、高脂果胶、山梨糖醇、红藻硫酸多糖、卡拉胶、壳聚糖、海胆糖蛋白、甘露醇、海藻果胶中至少一种；
18、根据进一步的技术方案，s4所述肠道菌群冻干保护剂选自木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、岩藻多糖、鱼蛋白肽、n-乙酰葡萄糖、冰结构蛋白中至少一种；
19、进一步地，本技术筛选了适应于上述耐胃肠液肠道菌群的固形物的冻干保护剂组合，所述肠道菌群冻干保护剂由木糖醇、山梨糖醇、甘露醇和麦芽糖醇按照质量之比为2:2:5:1的比例复配而成；或者由岩藻多糖、鱼蛋白肽、n-乙酰葡萄糖和冰结构蛋白按照质量之比为1:4:2.5:2.5的比例复配而成，后者对于耐胃肠液肠道菌群的固形物尤其适合，采用后者的冻干保护剂能够显著提升肠道菌群的冻干存活率。
20、本发明的第四个方面是提供所述的一种耐胃肠液肠道菌群的冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
21、（1）制备冻干保护剂溶液：取肠道菌群冻干保护剂，加入生理盐水溶解并混匀制成质量体积浓度为5%～20%的冻干保护剂溶液，灭菌后备用；
22、（2）乳清钙包埋肠道菌群冻干粉的制备：将耐胃肠液肠道菌群固形物与冻干保护剂溶液混合，固形物重量与冻干保护剂溶液的混合比例按照质量体积比为1:1～1:15（w:v/g:ml），并进行冷冻干燥，得到乳清钙包埋肠道菌群冻干粉。
23、需要说明的是，冻干保护剂溶液浓度的单位应当理解为质量（g）体积（ml）浓度。
24、根据进一步的技术方案，步骤（2）所述固形物重量与冻干保护剂溶液的比例为1:1～1:6。
25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
26、1. 本发明提供的肠道菌群包埋方法，能够赋予菌泥形式的肠道菌群耐胃肠液能力。同时，冻干粉形式的肠道菌群经乳清钙包埋后也具有较好的耐胃肠液能力，该结果一方面能够使最终产品形式多样化，另一方面也证明了乳清钙包埋的效果。
27、2. 本发明技术方法简单易行，乳清钙包埋过程从离心、孵育至再次离心所需时间短，工艺操作难度低、步骤少，更适应未来的生产环节情况，可以预期的大幅降低对操作人员的要求，缩减了工艺成本及时间成本，并且避免了其他技术需要用到的加热、复配和水解等方法。
28、3. 本发明技术方法其形成的包埋结构从镜检下结果来看属于单层微米级，避免了微胶囊粒径偏大、增加菌群释放难度等问题，并且患者也更容易服用，特别是对于老年人和幼儿群体。
29、4. 本发明制备过程中仅采用可食用的乳清钙作为包埋材料，降低了患者服用的安全隐患及风险，增强了生物相容性，还能够补充相应的营养物质。
30、综上所述，上述基于乳清钙“盔甲”包埋肠道菌群的技术方法在移植肠道菌群耐胃肠液方面具有重要的应用前景。