在体内具有抗肿瘤活性的抗人TROP‑2抗体的制作方法

本申请是中国专利申请201280057258.4的分案申请，原申请201280057258.4的申请日为2012年11月21日，其名称为“在体内具有抗肿瘤活性的抗人trop-2抗体”。

本发明涉及具有抗肿瘤活性的抗人trop-2抗体、特别涉及在体内具有抗肿瘤活性的抗人trop-2抗体。此外，本发明涉及产生该抗体的杂交瘤、及该抗体的用途。

背景技术：

人trop-2(tacstd2，ga733-1，egp-1)(以下也记作htrop-2。)为已知在各种上皮细胞癌肿中过度表达的、由323氨基酸残基(参照序列号2)构成的1次跨膜型的1型细胞膜蛋白。以前即已明确，存在与人滋养层细胞(trophoblasts)和癌细胞所表现的免疫抵抗有关的细胞膜蛋白(非专利文献1)，已经鉴定出一种被抗人绒毛膜癌细胞株bewo的细胞膜蛋白的小鼠单克隆抗体(162-25.3、162-46.2)识别的抗原分子，为在人滋养层细胞(trophoblasts)中表达的分子之一，被命名为trop-2(非专利文献2)。此后，相同分子被其它研究者发现，将被免疫胃癌细胞sw948而得的小鼠单克隆抗体ga733识别的称为肿瘤抗原ga733-1(非专利文献3)、将被非小细胞肺癌的细胞免疫而获得的小鼠单克隆抗体rs7-3g11识别的称为上皮糖蛋白(epithelial/carcinomaantigen，egp-1)(非专利文献4)，1995年克隆了trop-2的基因，确认了它们为同一分子(非专利文献5)。此外，阐明了其在癌细胞中具有放大细胞内钙信号的作用(非专利文献6)，也被称为肿瘤相关钙信号传导蛋白(tumor-associatedcalciumsignaltransducer)2，tacstd2。

htrop-2基因定位在染色体1p32上，与具有约50％同源性的ga733-2(还作为tacstd1、上皮糖蛋白egp-2、epcam及trop-1而已知)一起构成tacstd基因家族(非专利文献7)。htrop-2蛋白(323氨基酸残基；序列号2)具有约36kd的分子量，包含亲水性的信号肽(第1～26位的氨基酸)、细胞外结构域(第27～274位的氨基酸)、细胞跨膜结构域(第275～297位的氨基酸)以及细胞内结构域(第298～323位的氨基酸)。细胞外结构域中存在4个非均质n结合糖基化位点，添加糖链后，表观分子量增加11～13kd(非专利文献5)。tacstd基因家族中，细胞外结构域具有特征性的甲状腺球蛋白(ty)序列，通常认为其与癌细胞的增殖、浸润、转移有关。

截至目前，尚未鉴定出htrop-2的生理学上的配体，分子功能尚未阐明，但已经公开了其在肿瘤细胞中传递钙信号(非专利文献6)，此外，由于细胞内丝氨酸303号残基通过属于ca²⁺依赖性蛋白激酶的蛋白激酶c(pkc)而磷酸化(非专利文献4)以及细胞内结构域具有pip2结合序列，表明其具有肿瘤细胞中的信号传递功能(非专利文献8)。

通过免疫组化(ihc)及流式细胞术等解析，已经报道了htrop-2在胃癌、肺癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、食道癌等多种上皮源癌肿中过度表达。与此相对，显示出正常组织中的表达则仅限于上皮区域的细胞，表达水平也比癌肿中低，表明trop-2与肿瘤形成有关(专利文献1～3和9)。

此外，作为临床试样的生物学标志的htrop-2的表达与大肠癌(非专利文献10及11)、胰脏癌(非专利文献12)、口腔癌(非专利文献13)的恶性程度有关，在htrop-2高表达时，癌的转移、复发频率显著高。此外，在使用cdna微阵列技术的大规模基因表达分析中，已经鉴定出，其为与正常的卵巢上皮相比在卵巢的重度乳头状癌中最为高度过度表达的基因组之一(非专利文献14)。

进而，近年通过使用大肠癌细胞的模型证明了htrop-2在肿瘤形成中的重要作用(非专利文献15)。htrop-2的表达促进肿瘤细胞的锚着非依赖性细胞增殖，是移植到免疫缺陷小鼠皮下的癌细胞的肿瘤形成及增殖所必需的，表明其可能是功能性肿瘤抗原，可能成为新的治疗靶标。

截至目前，已经报告了几种抗htrop-2抗体的抗肿瘤效果的研究。就rs7抗体(专利文献1)而言，使用经放射性物质标记的抗体在体内模型中进行了试验，在裸小鼠异种移植模型中显示出抗肿瘤活性，但没有报告仅抗体(裸抗体)时的抗肿瘤效果。

此外，报告了与细胞毒素结合的抗htrop-2单克隆抗体br110(专利文献2)对于人癌细胞株h3619、h2987、mcf-7、h3396及h2981的体外实验中的细胞毒性，但体内数据方面，对于裸抗体或br110的免疫复合物则均未公开。

近年还报道了：由通过用人卵巢癌组织免疫小鼠而得的杂交瘤细胞株ar47a6.4.2或ar52a301.5产生的分离单克隆抗体与htrop-2结合，初次以裸抗体形式显示体外的细胞毒性，并且在裸小鼠异种移植模型中显示抗肿瘤活性(专利文献3和4)。但是，这些文献中，在移植了胰脏癌细胞株bxpc-3及pl45、前列腺癌细胞pc-3、乳腺癌细胞mcf-7以及大肠癌细胞colo205的小鼠异种移植模型中，虽然仅抗体时显示出抗肿瘤效果，但是除了在bxpc-3细胞移植中显示出治疗效果以外，均止步于通过抗体的预防性投与而部分地(约40～60％)抑制肿瘤形成及增殖，此外，所需抗体量也为20mg/kg左右，为非常高的用量。

由以上的现有技术，虽然已经明确抗htrop-2抗体可能作为抗肿瘤抗体，但同时所有的抗htrop-2抗体均并非是以裸抗体形式以抗体单独在体内显示出抗肿瘤效果，表明对htrop-2的作用根据抗体的结合位点、亲和性、单克隆抗体的性质而不同。

专利文献1：美国专利第6653104号

专利文献2：美国专利第5840854号

专利文献3：美国专利第7420040号

专利文献4：美国专利第7420041号

非专利文献1：faulkwp,etal.,proc.natl.acad.sci.usa,75(4),p.1947-1951(1978)

非专利文献2：lipinskim,etal.,proc.natl.acad.sci.usa,78(8),p.5147-5150(1981)

非专利文献3：linnenbachaj,etal.,proc.natl.acad.sci.usa,86(1),p.27-31(1989)

非专利文献4：basua,etal.,int.j.cancer,62(4),p.472-479(1995)

非专利文献5：fornarom,etal.,int.j.cancer,62(5),p.610-618(1995)

非专利文献6：ripanie,etal.,int.j.cancer,76(5),p.671-676(1998)

非专利文献7：calabreseg,etal.,cellgenet.,92(1-2),p.164-165(2001)

非专利文献8：elsewedytetal.,int.j.cancer,75(2),p.324-330(1998)

非专利文献9：cubasr,etal.,biochim.biophys.acta.,1796(2),p.309-314(2009)

非专利文献10：ohmachitetal.,clin.cancerres.,12(10),p.3057-3063(2006)

非专利文献11：fangyj,etal.,int.j.colorectaldis.,24(8),p.875-884(2009)

非专利文献12：fongd,etal.,br.j.cancer,99(8),p.1290-1295(2008)

非专利文献13：fongd,etal.,mod.pathol.,21(2),p.186-191(2008)

非专利文献14：santinad,etal.,int.j.cancer,112(1),p.14-25(2004)

非专利文献15：wangj,etal.,mol.cancerther.,7(2),p.280-285(2008)

技术实现要素：

发明要解决的问题

在这样的状况下，期望开发在体内具有高抗肿瘤活性的抗htrop-2抗体(抗htrop-2单克隆抗体)，具体而言，特别是以裸抗体形式在仅抗体时即具有在体内的抗肿瘤效果且以低用量具有该效果的抗htrop-2抗体、特别是人源化的该抗体等。

本发明是考虑了上述状况而作出的，提供以下所示的抗htrop-2抗体(抗htrop-2单克隆抗体)、产生该抗体的杂交瘤、该抗体的片段、该抗体等与药剂的复合物(immunoconjugate)、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤的检测方法、肿瘤的检测用或诊断用试剂盒等。

(1)一种抗人trop-2抗体，h链v区的氨基酸序列包含序列号92或98所示的氨基酸序列，l链v区的氨基酸序列包含序列号93所示的氨基酸序列。

上述(1)的抗体的h链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号36～38所示的氨基酸序列、和/或抗体的l链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号41～43所示的氨基酸序列。

(2)一种抗人trop-2抗体，h链v区的氨基酸序列包含序列号94或95所示的氨基酸序列，l链v区的氨基酸序列包含序列号96所示的氨基酸序列。

上述(2)的抗体的h链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号66～68所示的氨基酸序列、和/或抗体的l链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号71～73所示的氨基酸序列。

上述(1)和(2)的抗体可以列举出例如人源化抗体。

上述(1)和(2)的抗体可以列举出例如在体内具有抗肿瘤活性的抗体。

上述(1)和(2)的抗体可以列举出例如以5～20mg/kg体重的投与量显示50％以上的肿瘤生长抑制活性的抗体。这里，用于显示该肿瘤生长抑制活性的投与次数例如最多为每周1次。

上述(1)和(2)的抗体可以列举出例如以10mg/kg体重的单次投与显示50％以上的肿瘤生长抑制活性的抗体。

上述(1)和(2)的抗体可以列举出例如对2种以上的人肿瘤细胞株具有抗肿瘤活性的抗体。

上述(1)和(2)的抗体可以列举出例如解离常数(kd值)为1.0×10^-10m以下的抗体。

上述(1)和(2)的抗体可以列举出例如单克隆抗体。

这里，作为上述肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人胆管癌组成的组中的至少1种，其中可以优选列举出选自人胰癌、人大肠癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌组成的组中的至少1种。

此外，作为上述肿瘤，可以列举出例如复发癌或转移癌。

此外，作为上述肿瘤细胞株，可以列举出例如选自人胰癌细胞株pk-59、人胰癌细胞株bxpc-3、人胰癌细胞株kp-3l、人胰癌细胞株kp-2、人胰癌细胞株pk-1、人胰癌细胞株pk-45h、人胰癌细胞株pk-45p、人胰癌细胞株tcc-pan2、人胰癌细胞株suit-2、人大肠癌细胞株caco-2、人大肠癌细胞株sw480、人大肠癌细胞株dld-1、人大肠癌细胞株hct116、人乳腺癌细胞株jimt-1、人乳腺癌细胞株hcc1143、人乳腺癌细胞株mcf-7、人乳腺癌细胞株mda-mb-468、人前列腺癌细胞株du145及人前列腺癌细胞株pc-3、人肺癌细胞株calu-3、人卵巢癌细胞株sk-ov-3及人胆管癌细胞株tfk-1组成的组中的至少2种，其中可以优选列举出选自人胰癌细胞株pk-59、人胰癌细胞株bxpc-3、人大肠癌细胞株sw480、人肺癌细胞株calu-3、人乳腺癌细胞株mda-mb-468及人卵巢癌细胞株sk-ov-3组成的组中的至少2种。

(3)来源于上述(1)和(2)的抗体的抗体片段。

上述(3)的抗体片段可以列举出例如包含序列号92或98所示的氨基酸序列、和/或序列号93所示的氨基酸序列的片段；或者包含序列号94或95所示的氨基酸序列、和/或序列号96所示的氨基酸序列的片段。

(4)一种抗体-药剂复合物，其包含上述(1)和(2)的抗体以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质。

(5)一种抗体片段-药剂复合物，其包含上述(3)的抗体片段以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质。

在上述(4)和(5)的复合物中，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人胆管癌组成的组中的至少1种，其中可以优选列举出选自人胰癌、人大肠癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌组成的组中的至少1种。此外，作为肿瘤，还可以列举出例如复发癌或转移癌。

(6)一种药物组合物，其含有选自上述(1)和(2)的抗体、上述(3)的抗体片段、以及上述(4)和(5)的复合物组成的组中的至少1种。

上述(6)的药物组合物可以列举出例如用于肿瘤的治疗的药物组合物、没有体重减少的副作用的组合物、用于肿瘤的诊断的组合物。这里，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人胆管癌组成的组中的至少1种，其中可以优选列举出选自人胰癌、人大肠癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌组成的组中的至少1种。此外，作为肿瘤，还可以列举出复发癌或转移癌。

(7)一种肿瘤治疗剂，其包含选自上述(1)和(2)的抗体、上述(3)的抗体片段、以及上述(4)和(5)的复合物组成的组中的至少1种。

上述(7)的肿瘤治疗剂可以列举出例如没有体重减少的副作用的肿瘤治疗剂。这里，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人胆管癌组成的组中的至少1种，其中可以优选列举出选自人胰癌、人大肠癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌组成的组中的至少1种。

(8)一种肿瘤诊断剂，其包含选自上述(1)和(2)的抗体、上述(3)的抗体片段、以及上述(4)和(5)的复合物组成的组中的至少1种。

在上述(8)的肿瘤诊断剂中，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人胆管癌组成的组中的至少1种，其中可以优选列举出选自人胰癌、人大肠癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌组成的组中的至少1种。

(9)一种肿瘤的检测方法，其特征在于，使选自上述(1)和(2)的抗体、上述(3)的抗体片段、以及上述(4)和(5)的复合物组成的组中的至少1种与由生物体采集的试样反应，并检测发生反应的抗体和/或抗体片段的信号。

在上述(9)的肿瘤的检测方法中，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人胆管癌组成的组中的至少1种，其中可以优选列举出选自人胰癌、人大肠癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌组成的组中的至少1种。

(10)一种肿瘤的治疗用、诊断用或检测用试剂盒，其包含选自上述(1)和(2)的抗体、上述(3)的抗体片段、以及上述(4)和(5)的复合物组成的组中的至少1种。

在上述(10)的肿瘤的治疗用、诊断用或检测用试剂盒中，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人胆管癌组成的组中的至少1种，其中可以优选列举出选自人胰癌、人大肠癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌组成的组中的至少1种。

(11)编码上述(1)和(2)的抗体的多核苷酸。

(12)编码上述(3)的抗体片段的多核苷酸。

(13)包含上述(11)或(12)的多核苷酸的重组载体。

(14)包含上述(13)的重组载体的转化体。

附图说明

图1为表示抗htrop-2单克隆抗体(k5-70)的抗原亲和性(kd：解离常数)测定的图。abt：抗体(总计)，agf：抗原(游离)

图2为表示产生抗htrop-2单克隆抗体的杂交瘤培养上清的、与huh-7细胞(trop-2阴性)和huh-7-htrop-2细胞的反应性的图。涂成黑色的柱状图表示huh-7细胞，黑色线的柱状图表示huh-7-htrop-2细胞。

图3是表示抗htrop-2单克隆抗体的、与在细胞表面表达内源性htrop-2的人胰脏癌细胞株(pk-59细胞)的反应性的图。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(pe标记抗小鼠igg)，黑色线的柱状图表示与各抗htrop-2单克隆抗体反应。

图4是表示抗htrop-2单克隆抗体的、与在细胞表面表达内源性htrop-2的人胰脏癌细胞株(bxpc-3细胞)的反应性的图。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(pe标记抗小鼠igg)、黑色线的柱状图表示与各抗htrop-2单克隆抗体反应。

图5是表示抗htrop-2单克隆抗体(k5-70)与人胰脏癌细胞株的反应性的图。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(pe标记抗小鼠igg)、黑色线的柱状图表示与抗htrop-2单克隆抗体反应。

图6是表示抗htrop-2单克隆抗体(k5-70)与人大肠癌细胞株(colo320，caco2，sw480，dld1，cw2，hct116)，人乳腺癌(jimt-1，hcc1143)及人前列腺癌细胞株(pc-3，du145)的反应性的图。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(pe标记抗小鼠igg)，黑色线的柱状图表示与抗htrop-2单克隆抗体反应。

图7是调查抗htrop-2单克隆抗体与小鼠trop-2的交叉反应性的图。细胞使用的是在cho-k1细胞中瞬时表达小鼠trop-2基因的细胞，作为阳性对照抗体，使用的是与小鼠trop-2显示交叉性的t2-102抗体(小鼠igg1)。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(pe标记抗小鼠igg)，黑色线的柱状图表示与各抗htrop-2单克隆抗体反应。

图8是调查抗htrop-2单克隆抗体与人epcam/trop-1的交叉反应性的图。细胞使用的是在cho-k1细胞中瞬时表达人epcam/trop-1基因的细胞，作为阳性对照抗体，使用的是pe标记抗人epcam单克隆抗体(becton，dickinsonandcompany)。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(pe标记抗小鼠igg)，黑色线的柱状图表示与各抗htrop-2单克隆抗体反应。

图9是表示抗htrop-2抗体(t6-16，t5-86，k5-70，k5-107)的人胰脏癌细胞株(pk-59细胞)的细胞增殖抑制活性的图。migg表示对照抗体(小鼠igg)，yy01：市售的抗htrop-2抗体(santacruz)。白色柱：0μg/ml，灰色柱：0.1μg/ml,黑色柱：1μg/ml。以相对于不添加抗体(0μg/ml)时的值的比例来表示。误差棒表示标准偏差。^*p<0.05，^**p<0.01(利用学生t检验)

图10为表示抗htrop-2抗体(t6-16，k5-70)的人胰脏癌细胞株(pk-59细胞)的划痕试验的图。

a.表示pk-59细胞的划痕区域的照片的代表例。0天：表示刚划痕后的代表例。migg(1天)：划痕后在培养基中添加对照抗体(小鼠igg、1μg/ml)的1天后(24小时后)的照片。k5-70(1天)：表示划痕后在培养基中添加k5-70抗体(1μg/ml)的1天后(24小时后)的照片。t6-16(1天)：表示划痕后在培养基中添加t6-16抗体(1μg/ml)的1天后(24小时后)的照片。照片中所示箭头表示划痕区域的宽度。

b.通过图像解析软件(scionimage)解析划痕区域的面积，以该值为基础并将对照抗体(migg)添加组0天设为基准值1而算出各被测抗体中的值。

^*p<0.05,^**p<0.01(利用学生t检验)

图11为表示人胰脏癌细胞株pk-59细胞的干细胞标志的表达的facs的图。a：为表示pk-59细胞中的epcam的表达的facs的图。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(pe标记抗小鼠igg)，黑色线表示与抗人epcam抗体(becton，dickinsonandcompany)反应时的柱状图。b、c：表示pk-59细胞中的p-糖蛋白/mcr1(b)及abcg2(c)的表达的facs的图。蓝色的柱状图表示仅二抗，红色的柱状图表示与抗人p-糖蛋白/mdr1抗体(bdpharmingen)(b)、抗人abcg2抗体(bdpharmingen)(c)反应的情况。d：为使用作为胰脏癌干细胞标志的fitc标记抗人cd24抗体(bdpharmingen)和pe标记抗人cd44抗体(bdpharmingen)对pk-59细胞进行二重染色的facs图。d图中的数字表示各组分的细胞的存在比例。

图12为在使用pk-59细胞的异种移植治疗模型中对新的抗htrop-2单克隆抗体克隆k5-70(小鼠igg2a)的抗肿瘤活性进行评价的图。

a：表示对照组(●：小鼠igg)和k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时生长(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^*p<0.05，^**p<0.01(利用学生t检验)

b：是对在a的试验中第21天(21天)(实验最后一天)时各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。各曲线上所示的数值为平均值±标准偏差。^**p<0.01(利用学生t检验)

图13是在使用了pk-59细胞的异种移植治疗模型中对a.克隆k5-107，b.克隆t6-16，c.克隆k5-116-2-1的抗肿瘤活性进行评价的图。●表示对照组(小鼠igg)，○表示抗htrop-2抗体(10mg/kg体重)投与组。图中的箭头表示抗体投与期间，各曲线上所示的数值为平均值±标准偏差。^*p<0.05(利用学生t检验)

图14为在使用pk-59细胞的异种移植预防模型中对克隆k5-70(a)、克隆t6-16(b)及克隆k5-116-2-1(c)的抗肿瘤活性进行评价的图。●表示对照组(小鼠igg)、○表示抗htrop-2抗体(10mg/kg体重)投与组。图中的箭头表示抗体投与期间，各曲线上所示的数值为平均值±标准偏差。^**p<0.01(利用学生t检验)

图15为在使用bxpc-3细胞的异种移植预防及治疗模型中对克隆k5-70的抗肿瘤活性进行评价的图。a：表示在预防模型中对照组(●：小鼠igg)和k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时生长(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^**p<0.01(利用学生t检验)b：表示在治疗模型中对照组(●：小鼠igg)和k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时生长(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^*p<0.05(利用学生t检验)

图16为表示在使用pk-59细胞的异种移植预防模型中克隆k5-70的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。肿瘤体积以平均值±标准偏差来表示。

a：表示对照组(●：小鼠igg)和各用量时的k5-70抗体投与组(□：1mg/kg体重、△：5mg/kg体重)的肿瘤经时生长(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^*p<0.05(利用学生t检验)，^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中第17天(17天)(实验最后一天)时各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。各曲线上所示的数值为平均值±标准偏差。^**p<0.01(利用学生t检验)

图17为实验中使用的人/小鼠嵌合trop-2蛋白的示意图。sp：信号序列，ty结构域：1型甲状腺球蛋白区域(thyroglobulintype1region)，tm：跨膜区域，c：细胞内区域。用涂满黑色表示的区域为来自于htrop-2的多肽。以白色空心表示的区域为来自于小鼠trop-2的多肽。嵌合蛋白的示意图的上段所示数字表示小鼠trop-2蛋白的氨基酸号，下段表示htrop-2蛋白的氨基酸号。

图18为使用人/小鼠嵌合trop-2的抗htrop-2单克隆抗体结合区域的鉴定结果图。使用恒定表达人/小鼠嵌合trop2-c(hmtrop2-c)及小鼠/人嵌合trop2-d(mhtrop2-d)蛋白的hek293细胞，研究与图中所示的抗htrop-2单克隆抗体的反应性。阴性对照使用的是小鼠igg2b。

图19是表示抗htrop-2单克隆抗体的抗体结合区域的鉴定结果的图。

使用将htrop-2基因及各人/小鼠嵌合trop-2基因导入hek293细胞并使其瞬时表达的细胞进行facs解析。对于(a)k5-70、k5-107、t5-86及k5-116-2-1抗体，研究与htrop-2(上段)、hmtrop-2-a(中段)及hmtrop-2-b(下段)的反应性。使用小鼠igg2b作为阴性对照。对于(b)t6-4和t6-16抗体，研究与htrop-2(上段)、mhtrop-2-e(中段)及mhtrop-2-f(下段)的反应性。使用小鼠igg2b作为阴性对照。

图20是表示人正常组织中的htrop-2的表达的图。使用抗htrop-2单克隆抗体克隆k5-63-17进行人正常组织阵列的免疫染色。(a)皮肤、(b)食道、(c)肾脏(皮质)、(d)肾脏(髓质)、(e)胰脏、(f)前列腺、(g)膀胱、(h)扁桃腺、(i)心脏、(j)肝脏(倍率：×200)

图21是表示癌组织中的htrop-2的表达的图。使用抗htrop-2单克隆抗体克隆k5-63-17进行人癌组织阵列的免疫染色。(a)乳腺癌、(b)肺癌、(c)食道癌、(d)胃癌、(e)胰脏癌、(f)大肠癌、(g)膀胱癌、(h)前列腺癌、(i)卵巢癌(倍率：×100)

图22为表示在使用pk-59细胞的异种移植预防模型中单次投与克隆k5-70的抗肿瘤活性的图。

a.表示对照组(●：小鼠igg)和k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示投与抗体。^*p<0.05(利用学生t检验),^**p<0.01(利用学生t检验)。

b.为对在a的试验中第28天(28天)(实验最后一天)时的各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。^**p<0.01(利用学生t检验)。

c.表示对照组(●：小鼠igg)和k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的各个体的肿瘤经时形成。箭头表示投与抗体。

图23为表示克隆k5-70在使用人大肠癌细胞sw480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：小鼠igg)和k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中第44天(44天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^**p<0.01(利用学生t检验)

图24是表示克隆k5-116-2-1在使用sw480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：小鼠igg)和k5-116-2-1抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中第42天(42天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^**p<0.01(利用学生t检验)

图25为表示克隆t6-16在使用sw480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：小鼠igg)和t6-16抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^*p<0.05(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中第42天(42天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^*p<0.05(利用学生t检验)

图26为表示克隆k5-70在使用sw480细胞的异种移植治疗模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：小鼠igg)和k5-70抗体投与组(○：1mg/kg体重，△：5mg/kg体重，□：10mg/kg体重)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^*p<0.05(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中第42天(42天)(实验最后一天)时的各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。^*p<0.05(利用学生t检验)

图27为表示克隆k5-70在使用sw480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。

a：为表示每周1次的投与间隔时的k5-70抗体的抗肿瘤活性的图。表示对照组(●：小鼠igg)和k5-70抗体(10mg/kg)投与组(○)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头(10，17，24，31，38天)表示k5-70抗体的投与。^*p<0.05，利用学生t检验。

b：为表示每10天1次(q10d)、或每2周1次(q14d)的投与间隔时的k5-70抗体的抗肿瘤活性的图。表示对照组(●：小鼠igg、10mg/kg)和k5-70抗体投与组(○：q10d、10mg/kg，△：q14d、10mg/kg)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。涂成黑色的箭头(▼；9，19，29天)和空心的箭头(▽；9，23，37天)表示投与k5-70抗体。^*p<0.05，^**p<0.01，利用学生t检验。

图28为表示克隆t6-16在使用sw480细胞的异种移植治疗模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：小鼠igg)和t6-16抗体投与组(○：1mg/kg体重，△：5mg/kg体重，□：10mg/kg体重)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中第43天(43天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^**p<0.01(利用学生t检验)

图29为表示克隆t6-16在使用sw480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。表示对照组(●：小鼠igg10mg/kg体重)、t6-16抗体(10mg/kg体重)投与组(○：q7d，△：q10d)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头(10，17，24，31，38天)、及箭头(10，20，30，40天)表示投与t6-16抗体。对照组每3天进行1次投与。^*p<0.05，^**p<0.01，利用学生t检验。

图30为表示克隆k5-70在使用人前列腺癌细胞du-145细胞的异种移植预防模型中的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：小鼠igg)和k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^*p<0.05(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中第40天(40天)(实验最后一天)时的各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。^*p<0.05(利用学生t检验)

图31为表示克隆k5-70在使用pk-59细胞的肝转移模型的转移抑制活性的图。

a：表示细胞移植6周后对照组(●：小鼠igg)摘出的肝脏图，b：表示细胞移植6周后k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组摘出的肝脏图。箭头表示肝转移灶。

图32为表示k5-70在使用sw480细胞的异种移植模型中、在盐酸伊立替康投与后癌复发模型中的抗肿瘤活性的图。为表示无处置组(◆)、和盐酸伊立替康(40mg/kg)投与后k5-70抗体(○：10mg/kg体重)、或小鼠igg投与组(●：10mg/kg体重)的肿瘤经时形成的图(平均值±标准偏差)。箭头(11，14，17天)表示投与盐酸伊立替康。k5-70抗体或小鼠igg从第20天开始每3天进行1次投与。箭头表示抗体投与期间。^*p<0.05，^**p<0.01，利用学生t检验。

图33为表示克隆k5-70h链可变区(vh)的cdna碱基序列(序列号34)和推定氨基酸序列(序列号35)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的谷氨酰胺(q)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；iywin，niypsdsytnynqkfkd，tsmady)按照kabat等(sequencesofproteinsofimmunologicalinterests，fifthedition，nihpublicationno.91-3242，u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定义来确定。克隆k5-70vh的cdr1～3的氨基酸序列依次如序列号36～38所示。

图34为表示克隆k5-70l链可变区(vl)的cdna碱基序列(序列号39)和推定氨基酸序列(序列号40)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；rasqsigtsih，yasesis，qqsnswpft)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定义来确定。克隆k5-70vl的cdr1～3的氨基酸序列分别依次如序列号41～43所示。

图35为表示克隆k5-107h链可变区(vh)的cdna碱基序列(序列号44)和推定氨基酸序列(序列号45)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的谷氨酰胺(q)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；sywmh，niypgggytnydekfks，ssvfdy)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定义来确定。克隆k5-107vh的cdr1～3的氨基酸序列分别依次如序列号46～48所示。

图36为表示克隆k5-107l链可变区(vl)的cdna碱基序列(序列号49)和推定氨基酸序列(序列号50)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；rasqnigtsih，yasesis，qqsnswpft)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定义来确定。克隆k5-107vl的cdr1～3的氨基酸序列分别依次如序列号51～53所示。

图37为表示克隆k5-116-2-1h链可变区(vh)的cdna碱基序列(序列号54)和推定氨基酸序列(序列号55)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的谷氨酰胺(q)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；sywit，niypsdsytnynqkfrd，lfdy)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定义来确定。克隆k5-116-2-1vh的cdr1～3的氨基酸序列分别依次如序列号56～58所示。

图38为表示克隆k5-116-2-1l链可变区(vl)的cdna碱基序列(序列号59)和推定氨基酸序列(序列号60)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；rasqsigtsih，yasesis，qqsnswpft)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定义来确定。克隆k5-116-2-1vl的cdr1～3的氨基酸序列分别依次如序列号61～63所示。

图39为表示克隆t6-16h链可变区(vh)的cdna碱基序列(序列号64)和推定氨基酸序列(序列号65)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的谷氨酰胺酸(e)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；dynmh，yiypynggtgynqrfks，edygsspsyamdy)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定义来确定。克隆t6-16vh的cdr1～3的氨基酸序列分别依次如序列号66～68所示。

图40为表示克隆t6-16l链可变区(vl)的cdna碱基序列(序列号69)和推定氨基酸序列(序列号70)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；rssqslvhgngntylh，kvsnrfs，sqtthvpt)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定义来确定。克隆t6-16vl的cdr1～3的氨基酸序列分别依次如序列号71～73所示。

图41为示出关于克隆k5-70的h链可变区(k5-70vh)的氨基酸序列(序列号35)、人源化k5-70的h链可变区(huk5-70vh)的氨基酸序列(序列号75)、及人源化抗体制作中使用的接纳体(genbank登录号no.da980102；序列号84)的h链可变区(da980102vh)的氨基酸序列(序列号85)的、比对的图(予以说明，图中的所有氨基酸序列均为各h链可变区的氨基酸序列的一部分(具体而言，除信号肽部分外的成熟蛋白部分的氨基酸序列)。)。

k5-70vh中以下划线表示的氨基酸序列表示由kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)所定义的cdr序列。此外，在氨基酸序列上部记载的编号表示根据上述kabat等的定义的氨基酸的位置号。da980102vh中的各cdr序列在图中用---表示，省略了记载。huk5-70vh中的以下划线表示的氨基酸被预测对cdr的结构维持很重要，因而维持了k5-70vh的序列。此外，关于huk5-70vh中的以双下划线表示的氨基酸，对应的da980102vh的氨基酸(蛋氨酸(m))在该位置较少见，为了降低抗原性，置换成属于相同亚组的典型氨基酸亮氨酸(l)。

图42为示出关于克隆k5-70的l链可变区(k5-70vl)的氨基酸序列(序列号40)、人源化k5-70的l链可变区(huk5-70vl)的氨基酸序列(序列号77)、及人源化抗体制作中使用的接纳体(genbank登录号no.l41174；序列号86)的l链可变区(l41174vl)的氨基酸序列(序列号87；genbank登录号no.aaa64877)的、比对的图(予以说明，图中的所有氨基酸序列均为各l链可变区的氨基酸序列的一部分(具体而言，除信号肽部分外的成熟蛋白部分的氨基酸序列)。)。

k5-70vl中以下划线表示的氨基酸序列表示由kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)所定义的cdr序列。此外，在氨基酸序列上部记载的编号表示根据上述kabat等的定义的氨基酸的位置号。l41174vl中的各cdr序列在图中用---表示，省略了记载。huk5-70vl中的以下划线表示的氨基酸被预测对cdr的结构维持很重要，因而维持了k5-70vl的序列。

图43为示出关于克隆t6-16的h链可变区(t6-16vh)的氨基酸序列(序列号65)、2种人源化t6-16的h链可变区(hut6-16vh1、hut6-16vh2)的氨基酸序列(分别依次为序列号79、序列号81)、及人源化抗体制作中使用的接纳体(genbank登录号no.da935238；序列号88)的h链可变区(da935238vh)的氨基酸序列(序列号89)的、比对的图(予以说明，图中的所有氨基酸序列均为各h链可变区的氨基酸序列的一部分(具体而言，除信号肽部分外的成熟蛋白部分的氨基酸序列)。)。

hut6-16vh中以下划线表示的氨基酸序列表示由kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)所定义的cdr序列。此外，在氨基酸序列上部记载的编号表示根据上述kabat等的定义的氨基酸的位置号。da935238vh中的各cdr序列在图中用---表示，省略了记载。hut6-16vh1和hut6-16vh2中的以下划线表示的氨基酸被预测对cdr的结构维持很重要，因而维持了t6-16vh的序列。此外，关于hut6-16vh1中的位于73位的位置的赖氨酸(k)，在hut6-16vh2中被置换成来自作为接纳体序列的da935238vh的苏氨酸(t)。

图44为示出关于克隆t6-16的l链可变区(t6-16vl)的氨基酸序列(序列号70)、人源化t6-16的l链可变区(hut6-16vl)的氨基酸序列(序列号83)、及人源化抗体制作中使用的接纳体(genbank登录号no.m99608；序列号90)的l链可变区(m99608vl)的氨基酸序列(序列号91；genbank登录号no.aaa60341)的、比对的图(予以说明，图中的所有氨基酸序列均为各l链可变区的氨基酸序列的一部分(具体而言，除信号肽部分外的成熟蛋白部分的氨基酸序列)。)。

t6-16vl中以下划线表示的氨基酸序列表示由kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)所定义的cdr序列。此外，在氨基酸序列上部记载的编号表示根据上述kabat等的定义的氨基酸的位置号。m99608vl中的各cdr序列在图中用---表示，省略了记载。

图45为表示huk5-70vh的基因序列(序列号74)及氨基酸序列(序列号75)的图。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示氨基酸序列。该氨基酸序列中，信号肽部分画有虚线的下划线，各cdr序列(cdr1～3)画有实线的下划线(除去该信号肽部分的仅成熟蛋白部分的氨基酸序列示于序列号92)。予以说明，在huk5-70vh基因的5’末端附加了ecori位点(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3’末端附加了nhei位点(gctagc)。

图46为表示huk5-70vl的基因序列(序列号76)及氨基酸序列(序列号77)的图。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示氨基酸序列。该氨基酸序列中，信号肽部分画有虚线的下划线，各cdr序列(cdr1～3)画有实线的下划线(除去该信号肽部分的仅成熟蛋白部分的氨基酸序列示于序列号93)。予以说明，在huk5-70vl基因的5’末端附加了agei位点(accggt)及kozak序列(accacc)，在3’末端附加了bsiwi位点(cgtacg)。

图47为表示hut6-16vh1的基因序列(序列号78)及氨基酸序列(序列号79)的图。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示氨基酸序列。该氨基酸序列中，信号肽部分画有虚线的下划线，各cdr序列(cdr1～3)画有实线的下划线(除去该信号肽部分的仅成熟蛋白部分的氨基酸序列示于序列号94)。予以说明，在hut6-16vh1基因的5’末端附加了ecori位点(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3’末端附加了nhei位点(gctagc)。

图48为表示hut6-16vh2的基因序列(序列号80)及氨基酸序列(序列号81)的图。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示氨基酸序列。该氨基酸序列中，信号肽部分画有虚线的下划线，各cdr序列(cdr1～3)画有实线的下划线(除去该信号肽部分的仅成熟蛋白部分的氨基酸序列示于序列号95)。予以说明，在hut6-16vh2基因的5’末端附加了ecori位点(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3’末端附加了nhei位点(gctagc)。

图49为表示hut6-16vl的基因序列(序列号82)及氨基酸序列(序列号83)的图。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示氨基酸序列。该氨基酸序列中，信号肽部分画有虚线的下划线，各cdr序列(cdr1～3)画有实线的下划线(除去该信号肽部分的仅成熟蛋白部分的氨基酸序列示于序列号96)。予以说明，在hut6-16vl基因的5’末端附加了agei位点(accggt)及kozak序列(accacc)，在3’末端附加了bsiwi位点(cgtacg)。

图50为表示确认了huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的表达的结果图。

(a)在293f细胞中导入表达载体pfuse-chig-huk5-70及pfuse2-clig-huk5-70，通过蛋白印迹法研究了培养上清中的huk5-70抗体的表达。条带1为未进行基因导入的293f细胞的培养上清(阴性对照)，条带2为导入了上述表达载体的293f细胞的培养上清。huk5-70抗体的重链及轻链蛋白质用生物素标记的抗人iggf(ab’)²抗体进行了检测。

(b)以表达载体pfuse-chig-hut6-16-1及pfuse2-clig-hut6-16(条带3)、pfuse-chig-hut6-16-2及pfuse2-clig-hut6-16(条带4)的组合分别对293f细胞进行导入，通过蛋白印迹法研究了hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的表达。hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的重链蛋白质用生物素标记的抗人iggfc抗体进行了检测，hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的轻链蛋白质用生物素标记的抗人iggf(ab’)²抗体进行了检测。

图51为表示纯化的huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的考马斯亮蓝染色的结果的图。

利用sds-page将纯化后的huk5-70抗体(条带1)、hut6-16-1抗体(条带2)及hut6-16-2抗体(条带3)各1μg分别展开，进行考马斯亮蓝染色。

图52为表示使用了流式细胞仪的huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的抗原结合能力的解析结果的图。

使用图中所示的各抗体，通过facs解析研究了对于hek293-htrop-2细胞(a)及pk-59细胞(b)的反应性。阴性对照为仅二抗(涂成黑色)，各抗体的反应性用灰色线表示。

图53为表示使用了elisa法的huk5-70抗体的抗原结合能力的测定结果的图。

通过抗原固相化elisa法对k5-70抗体及huk5-70抗体的抗原结合能力进行了研究。▲表示k5-70抗体的测定结果，●表示huk5-70抗体的测定结果。

图54为表示使用了elisa法的hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的抗原结合能力的测定结果的图。

通过抗原固相化elisa法对t6-16抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的抗原结合能力进行了研究。▲表示t6-16抗体的测定结果，●表示hut6-16-1抗体的测定结果，■表示hut6-16-2抗体的测定结果。

图55为表示人源化抗htrop-2抗体(huk5-70抗体)在使用人大肠癌细胞sw480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：pbs)和huk5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^*p<0.05,^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中第39天(39天)(实验最后一天)时的各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。^*p<0.05(利用学生t检验)

图56为表示人源化抗htrop-2抗体(huk5-70)在使用人大肠癌细胞sw480细胞的异种移植治疗模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：pbs)和huk5-70抗体投与组(○：1mg/kg体重，△：5mg/kg体重，□：10mg/kg体重)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中癌细胞移植后第48天(48天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^**p<0.01(利用学生t检验)

图57为表示人源化抗htrop-2抗体(hut6-16-2)在使用人大肠癌细胞sw480细胞的异种移植治疗模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：pbs)和hut6-16-2抗体投与组(○：1mg/kg体重，△：5mg/kg体重，□：10mg/kg体重)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中癌细胞移植后第48天(48天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^**p<0.05(利用学生t检验)

图58为表示小鼠抗htrop-2抗体(k5-70及t6-16)在使用人卵巢癌细胞sk-ov-3细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：pbs)、k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)及t6-16抗体(10mg/kg体重)投与组(△)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中癌细胞移植后第56天(56天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^**p<0.05(利用学生t检验)

图59为表示小鼠抗htrop-2抗体(k5-70及t6-16)在使用人乳腺癌细胞mda-mb-468细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：pbs)、k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)及t6-16抗体(10mg/kg体重)投与组(△)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中癌细胞移植后第54天(54天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^*p<0.05，^**p<0.01(利用学生t检验)

图60为表示小鼠抗htrop-2抗体(k5-70及t6-16)在使用人肺癌细胞calu-3细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：pbs)、k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)及t6-16抗体(10mg/kg体重)投与组(△)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^*p<0.05，^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中癌细胞移植后第41天(41天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^*p<0.05，^**p<0.01(利用学生t检验)

图61为表示小鼠抗htrop-2抗体k5-70在使用人胆管癌细胞tfk-1细胞的异种移植预防模型中的抗肿瘤活性的图。

a：表示对照组(●：pbs)及k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组(○)的肿瘤经时形成(平均值±标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。^**p<0.01(利用学生t检验)

b：为对在a的试验中癌细胞移植后第31天(31天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。^**p<0.01(利用学生t检验)

图62为利用低浓度抗原固相化elisa对huk5-70及hut6-16-2抗体的结合活性进行研究的结果。将96孔板用0.1μg/ml的重组htacstd2-fc-his蛋白进行包覆，从20μg/ml开始制备各2倍的稀释系列，使所得到的被测抗体(k5-70、huk5-70、t6-16及hut6-16-2抗体)反应。(a)使用k5-70(▲)及huk5-70(●)抗体作为被测抗体，(b)使用t6-16(▲)及hut6-16-2抗体(●)作为被测抗体。

图63为表示htrop-2对于k5-70及huk5-70抗体的结合活性的elisa的结果。在96孔板中通过抗小鼠igg(γ链特异性的)及抗人igg1(fcγ特异性的)将k5-70及huk5-70抗体固相化，使从5μg/ml开始制备2倍稀释系列而得到的htrop-2-ec-his蛋白反应。利用抗his标签抗体检测了htrop-2-ec-his蛋白的结合。(▲)k5-70抗体、(●)huk5-70抗体

图64为表示通过基因合成制作的k5-70vh基因的碱基序列(上段；序列号99)和k5-70vh的氨基酸序列(下段；序列号35)的图。该碱基序列中，在5’末端附加了ecori位点(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3’末端附加了nhei位点(gctagc)。该氨基酸序列用单个字母标记表示，n末端侧的信号肽用斜体表示。画有双下划线的谷氨酰胺(q)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；iywin，niypsdsytnynqkfkd，tsmady)按照kabat等(sequencesofproteinsofimmunologicalinterests，fifthedition，nihpublicationno.91-3242，u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定义来确定。克隆k5-70vh的cdr1～3的氨基酸序列分别依次如序列号36～38所示。

图65为表示通过基因合成制作的k5-70vl基因的碱基序列(上段；序列号100)和k5-70vl的氨基酸序列(下段；序列号40)的图。该碱基序列中，在5’末端附加了agei位点(accggt)及kozak序列(accacc)，在3’末端附加了bsiwi位点(cgtacg)。该氨基酸序列用单个字母标记表示，n末端侧的信号肽用斜体表示。画有双下划线的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端氨基酸残基。cdr序列(下划线；rasqsigtsih，yasesis，qqsnswpft)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)的定义来决定。克隆k5-70vl的cdr1～3的氨基酸序列分别依次如序列号41～43所示。

图66为表示chk5-70、huk5-70、huvh/muvl(将huk5-70抗体的vl置换成k5-70抗体的vl)及muvh/huvl(将huk5-70抗体的vh置换成k5-70抗体的vh)抗体对于htrop-2的结合活性的图。将96孔板用0.1μg/ml的重组htacstd2-fc-his蛋白包覆，将瞬时表达被测抗体(chk5-70、huk5-70、huvh/muvl及muvh/huvl抗体)的细胞的培养上清按照1、0.1、0.01、0.001μg/ml的抗体浓度进行稀释并使其反应。(▲)chk5-70抗体、(△)muvh/huvl抗体、(○)huvh/muvl抗体、(●)huk5-70抗体

图67为表示huk5-70vh及其氨基酸置换突变体的氨基酸序列的图。氨基酸用单个字母标记表示。各氨基酸置换突变体中，与huk5-70vh的氨基酸相同的氨基酸用“-“表示，仅所置换的氨基酸用单个字母标记表示。序列上部的数字表示氨基酸号(kabat等1991)。

图68为表示chk5-70、huk5-70、huk5-70vha40r(将huk5-70抗体的vh的40位的丙氨酸置换成精氨酸的突变体)及huk5-70vhr44g抗体(将huk5-70抗体的vh的44位的精氨酸置换成甘氨酸的突变体)对于htrop-2的结合活性的图的。将96孔板用0.1μg/ml的重组htacstd2-fc-his蛋白进行包覆，将瞬时表达被测抗体(chk5-70、huk5-70、huk5-70vha40r及huk5-70vhr44g抗体)的细胞的培养上清从0.5μg/ml开始制作2倍稀释系列(6点)并使其反应。(▲)chk5-70抗体、(△)huk5-70vhr44g抗体、(○)huk5-70vha40r抗体、(●)huk5-70抗体

图69为表示通过基因合成制作的huk5-70vhr44g基因的碱基序列(上段)和氨基酸序列(下段)。在5’末端附加了ecori位点(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3’末端附加了nhei位点(gctagc)。氨基酸序列用单个字母标记表示。n末端的信号肽用斜体表示，成熟vh的n末端侧的氨基酸(q：谷氨酰胺)用双下划线表示，cdr序列(kabat等、1991)用下划线表示。

图70为纯化huk5-70-2抗体的sds-page的图。在还原条件下利用11％sds-page凝胶展开huk5-70-2抗体1μg。条带1：分子量标志(precisionplusdualstandard(bio-rad))，条带2：huk5-70-2抗体。图的左侧的数值表示分子量。

图71为表示k5-70、huk5-70及huk5-70-2抗体对于htrop-2的结合活性的图。将96孔板用0.1μg/ml的重组htacstd2-fc-his蛋白进行包覆，将纯化后的被测抗体(k5-70、huk5-70及huk5-70-2抗体)从1μg/ml开始制作2倍稀释系列(10点)并使其反应。(■)k5-70抗体、(△)huk5-70-2抗体、(●)huk5-70抗体

图72a为表示使用人源化抗htrop-2抗体(白色柱：huk5-70，黑色柱：hut6-16-2)的adcc活性的图。详细而言，表示在人大肠癌细胞株sw480中加入huk5-70抗体及hut6-16-2抗体(均为0、0.1、0.3、1、3、10μg/ml)和健康人末梢血单核细胞并培养6小时，测定释放至培养上清的ldh的活性，从而测定adcc活性的结果(平均值±标准误差(n＝3)，：效靶比(e/t)＝40)。抗体浓度0表示不添加抗体。^*p<0.05，^**p<0.01(利用学生t检验)

图72b为表示使用人源化抗htrop-2抗体(白色柱：huk5-70，灰色柱：huk5-70-2，黑色柱：hut6-16-2)的adcc活性的图。详细而言，表示在人胰脏癌细胞株(pk-59)中加入huk5-70抗体、huk5-70-2抗体及hut6-16-2抗体(均为0、0.3、1、3、10、30μg/ml)和健康人末梢血单核细胞并培养6小时，测定释放至培养上清的ldh的活性，从而测定adcc活性的结果(平均值±标准误差(n＝3)，：效靶比(e/t)＝40)。抗体浓度0表示不添加抗体。^**p<0.01(利用学生t检验)

图72c为表示使用人源化抗htrop-2抗体(白色柱：huk5-70，灰色柱：huk5-70-2，黑色柱：hut6-16-2)的adcc活性的图。详细而言，表示在人前列腺癌细胞株(pc-3)中加入huk5-70抗体、huk5-70-2抗体及hut6-16-2抗体(均为0、0.3、1、3、10、30μg/ml)和健康人末梢血单核细胞并培养6小时，测定释放至培养上清的ldh的活性，从而测定adcc活性的结果(平均值±标准误差(n＝3)，：效靶比(e/t)＝40)。抗体浓度0表示不添加抗体。^**p<0.01(利用学生t检验)

具体实施方式

以下详细说明本发明。本发明的范围不受这些说明限制，除了以下例示以外，也可以在不损害本发明主旨的范围内适当变更实施。

予以说明，本说明书包括作为本申请优先权基础的美国临时申请61/562,672号说明书(2011年11月22日提出申请)的全体。此外，本说明书所引用的全部的出版物如现有技术文献及公开公报、专利公报以及其它专利文献均作为参照而引入本说明书中。

1.本发明的概要

如前所述，人trop-2(htrop-2)是由全长323氨基酸残基构成的1次跨膜型的1型膜蛋白。并且已知htrop-2基因及其基因产物在各种癌细胞中表达。

如前所述，希望开发出在体内具有高抗肿瘤活性的抗htrop-2抗体(抗htrop-2单克隆抗体)等的状况下，本发明人从极其众多的克隆中进行筛选，从而成功地获得了在体内具有高抗肿瘤活性的克隆。具体而言，本发明提供在体内特异性识别htrop-2的细胞外区域的单克隆抗体，特别是提供显示皮摩尔级别(pm)的高亲和性的单克隆抗体。与现有的抗htrop-2抗体相比，本发明的抗体为：以仅裸抗体投与时，在更少的用量(例如1/20投与量)下具有显著的肿瘤生长抑制活性，且在使用多种人癌细胞的荷瘤小鼠治疗模型中显示显著的肿瘤生长抑制活性的抗htrop-2单克隆抗体(特别是人源化抗体)，从这方面来看是极其有用的。

2.抗htrop-2抗体的制作

(1)抗原的制备

htrop-2的氨基酸序列(序列号2)信息在例如ncbi(genbank)网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中以“登录号：np_002344”公布。予以说明，编码htrop-2的氨基酸序列的碱基序列(序列号1)的信息在该网站中以“登录号：nm002353”公布。

作为抗原，可以使用包含htrop-2的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的多肽或肽(也简称为肽)，可以优选使用包含htrop-2的细胞外区域的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的肽。htrop-2的细胞外区域(包括信号肽)是指包含序列号2所示的氨基酸序列中的第1位～第274位的氨基酸的区域(信号肽：第1位～第26位的氨基酸)。这里，对用作抗原的肽而言，上述“氨基酸序列的至少一部分”的长度没有特别限定，优选例如包含序列号2所示的氨基酸序列中的第1位～第145位的氨基酸的区域、包含该氨基酸序列中的第146位～第274位的氨基酸的区域等。

作为抗原的肽的制作方法可以是化学合成，也可以通过采用大肠杆菌等的基因工程法合成，可以使用本领域技术人员公知的方法。

进行肽的化学合成时，可以通过肽合成的公知方法进行合成。此外，其合成也可以使用固相合成法和液相合成法中的任意一种。还可以使用市售的肽合成装置(例如，岛津制作所制：pssm-8等)。

在用基因工程学方式合成肽时，首先设计并合成编码该肽的dna。该设计和合成例如可以使用以包含全长htrop-2基因的载体等作为模板，使用设计为可以合成所希望的dna区域的引物，通过pcr法进行。然后，通过将上述dna连接到适当的载体上而获得蛋白质表达用重组载体，将该重组载体导入宿主中并使得目的基因可以表达，由此获得转化体(sambrookj.etal.，molecularcloning，alaboratorymanual，3rdedition，coldspringharborlaboratorypress，2001)。

使用可以在宿主微生物中自我增殖的噬菌体或质粒作为载体。而且还可以使用动物病毒、昆虫病毒载体。重组载体的制作可如下进行，即用适当的限制酶切断纯化的dna，插入适当的载体dna的限制酶位点等中而与载体连接。作为转化时使用的宿主，只要是可以表达目的基因的宿主即可，没有特别的限定。例如，可以列举细菌(大肠杆菌、枯草杆菌等)、酵母、动物细胞(cos细胞、cho细胞等)、昆虫细胞或昆虫。还可以使用山羊等哺乳动物作为宿主。向宿主导入重组载体的方法是公知的。

然后，培养前述转化体，从其培养物中收集作为抗原使用的肽。“培养物”是指(a)培养上清、(b)培养细胞或者培养菌体或其破碎物中的任意一种。

培养后，目的肽在菌体内或细胞内产生时，通过破碎菌体或细胞来提取肽。而且，目的肽在菌体外或细胞外产生时，直接使用培养液或通过离心分离等除去菌体或细胞。然后，可以通过单独使用可以在肽的分离纯化中使用的一般的生物化学方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等或将这些方法组合使用，来分离纯化目的肽。

本发明中，还可以使用无细胞合成系统，通过体外翻译获得作为抗原的肽。此时，可以使用以rna作为模板的方法和以dna作为模板的方法(转录/翻译)这2种方法。作为无细胞合成系统，可以使用市售的系统，例如expressway^tm系统(invitrogen公司)、puresystem(注册商标；postgenome研究所)、tnt系统(注册商标；promega公司)等。

如上所述获得的肽还可以结合到适当的载体蛋白质，例如牛血清白蛋白(bsa)、钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，klh)、人甲状腺球蛋白、鸡γ-球蛋白等。

另外，抗原可以是在htrop-2的氨基酸序列(序列号2)或前述的其部分序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列而构成的肽。例如，还可以使用htrop-2的氨基酸序列或其部分序列中缺失1个或多个(优选1个或多个(例如1个～10个，更优选1个～5个))氨基酸、1或多个(优选1个或多个(例如1个～10个，更优选1个～5个))氨基酸被其它氨基酸置换、或添加了1个或多个(优选1个或多个(例如1个～10个，更优选1个～5个))其它氨基酸的氨基酸序列所构成的肽。

本发明中，作为用于导入于细胞等的基因，可以列举编码htrop-2蛋白或其部分片段的基因、或编码其突变型的蛋白质或片段的基因。作为这种基因，例如可以使用具有序列号1所示的碱基序列或其部分序列的基因。

另外，作为用于导入于细胞等的基因，还可以使用与序列号1所示的碱基序列互补的序列在严紧条件下杂交，且编码具有htrop-2活性的蛋白质的碱基序列或其部分序列。

“严紧条件”是指杂交后洗涤时的条件，缓冲液的盐(钠)浓度为10～500mm，温度为42℃～72℃，优选上述盐浓度为50～300mm，温度为55～68℃的条件。

为了在基因中导入突变，可以通过kunkel法或带缺口的双链体(gappedduplex)法等公知方法进行，例如使用利用定点突变法的突变导入用试剂盒如genetailor^tmsite-directedmutagenesissystem(invitrogen公司制)、takarasite-directedmutagenesissystem(mutan-k、mutan-superexpresskm等：takarabio公司制)来进行。

(2)多克隆抗体的制作

将制备的抗原投与到用于免疫的哺乳动物。哺乳动物没有特别限定，例如可以列举大鼠、小鼠和兔等，其中优选小鼠。

每一只动物的抗原投与量，可以根据佐剂的有无适当设定。作为佐剂，可以列举弗氏完全佐剂(fca)、弗氏不完全佐剂(fia)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要可以通过注入到静脉内、脚掌、皮下、腹腔内等来进行。而且，免疫的间隔没有特别限定，以数天至数周的间隔、优选以1周的间隔进行1～10次、优选进行2～3次免疫。然后，在最后的免疫日起3～7天后，通过酶免疫测定法(elisa或eia)或放射性免疫测定法(ria)等测定抗体效价，可以在出现所希望的抗体效价之日采血，获得抗血清。在上述抗体的提取方法中，在需要纯化抗体时，可以通过适当选择或组合硫酸铵盐析法、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等公知方法来进行纯化。然后，通过elisa法等测定抗血清中的多克隆抗体的反应性。

(3)单克隆抗体的制作

(3-1)抗体产生细胞的提取

本发明的抗htrop-2抗体并没有限制，但优选为单克隆抗体。

将制备的抗原投与用于免疫的哺乳动物，例如大鼠、小鼠和兔等。每只动物的抗原投与量可以根据有无佐剂适当设定。佐剂与上述同样。免疫方法也与前述同样。而且，在最后的免疫日起1～60天后，优选为1～14天后，提取抗体产生细胞。作为抗体产生细胞，可以列举脾细胞、淋巴结细胞和末梢血细胞等，其中优选淋巴结细胞和脾脏细胞。

(3-2)细胞融合

为了获得杂交瘤(抗体产生细胞株)，进行抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的一般可以获得的已建立的细胞株。作为使用的细胞株，优选具有药剂筛选性，具有未融合的状态下在hat选择培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)中无法生存而只有在与抗体产生细胞融合的状态下可以生存的性质的细胞株。

作为骨髓瘤细胞，例如可以列举p3-x63-ag8.653、p3-x63-ag8(x63)、p3-x63-ag8.u1(p3u1)、p3/nsi/1-ag4-1(ns1)和sp2/0-ag14(sp2/0)等小鼠骨髓瘤细胞株。骨髓瘤细胞的选择可以适当考虑与抗体产生细胞的适合性而进行。

然后，使骨髓瘤细胞与抗体产生细胞进行细胞融合。细胞融合时，在不含血清的dmem和rpmi-1640培养基等动物细胞用培养基中，混合1×10⁶～1×10⁷个/ml的抗体产生细胞和2×10⁵～2×10⁶个/ml的骨髓瘤细胞。抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞比(抗体产生细胞：骨髓瘤细胞)没有限制，但通常优选为1：1～10：1，更优选为3：1。然后，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，例如可以使用平均分子量为1000～6000道尔顿(d)的聚乙二醇等。而且，还可以使用利用电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置，使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。

(3-3)杂交瘤的挑选和克隆

从细胞融合处理后的细胞中挑选出目的杂交瘤。作为该方法，将细胞悬浮液用例如含有胎牛血清的rpmi-1640培养基等适当稀释后，接种于微孔培养板上，在各孔中加入选择培养基，以后适当更换选择培养基进行培养。其结果是，在选择培养基中开始培养后，可以将14天前后开始生长的细胞作为杂交瘤。

然后，在逐步增殖的杂交瘤的培养上清中，筛选是否存在与htrop-2反应的抗体。杂交瘤的筛选可以按照通常的方法，没有特别限制。例如，可以采集已长出杂交瘤的孔中所含的培养上清的一部分，通过elisa、eia和ria等进行筛选。

融合细胞的克隆可以通过有限稀释法等进行。通过流式细胞术等判断与htrop-2显示出强反应性的抗体，选择产生该抗体的杂交瘤，建立克隆。

(3-4)单克隆抗体的提取

作为培养已建立的杂交瘤并从获得的培养物中提取单克隆抗体的方法，可以采取通常的细胞培养法或腹水形成法等。“培养”是指在培养皿或培养瓶中使杂交瘤生长，或如下使杂交瘤在动物的腹腔内增殖。

细胞培养法中，可以在含有10％胎牛血清的rpmi-1640培养基、mem培养基或无血清培养基等动物细胞培养的培养基中，在通常的培养条件(例如37℃、5％co2浓度)下培养杂交瘤7～14天，从其培养上清中获得抗体。

腹水形成法的情况下，在与骨髓瘤细胞来源的哺乳动物同种系动物的腹腔内投与约1×10⁷个杂交瘤，使杂交瘤大量增殖。并且，优选在2～3周后提取腹水。

在上述抗体的提取方法中，在需要纯化抗体时，可以通过适当选择或组合硫酸铵盐析法、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等公知方法来进行纯化。

(3-5)具有抗肿瘤活性的克隆的挑选

本发明的抗htrop-2抗体是在体内具有抗肿瘤活性的抗体。

这里，“抗肿瘤活性”是指使肿瘤细胞(癌细胞)死亡的活性或抑制肿瘤生长的活性。作为抗肿瘤活性，例如可优选列举癌细胞增殖抑制活性、肿瘤血管生成抑制活性。此外，作为本发明的抗体可以发挥抗肿瘤活性的人肿瘤(肿瘤细胞)的种类，可以列举已确认htrop-2的表达的公知的各种人肿瘤，没有特别限定，可以优选列举出例如人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人胆管癌等各种人肿瘤中的1种或2种以上，更优选为人胰癌、人大肠癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌及人肺癌中的1种或2种以上，进一步优选为人胰癌和/或人大肠癌。进而，作为上述肿瘤的种类，还可以是复发癌、转移癌，本发明的抗体对于这些肿瘤也可以发挥优异的抗肿瘤活性。

在体内的抗肿瘤活性的确认，例如可以使用在小鼠的皮下移植了所希望的肿瘤细胞的荷瘤小鼠(荷瘤动物治疗模型)，通过对该小鼠投与前述获得的抗体来进行。此时，抗体的投与可以在肿瘤细胞的移植后立即进行(预防模型)，也可以在确认移植肿瘤达到预定体积之后进行(治疗模型)。投与方法并没有限制，例如可以以每3天1次、1周1次、10天1次或2周1次或单次(仅一次)，以5～20mg/kg体重进行腹腔内投与等。预防模型的情况下，可以通过肿瘤形成频率和肿瘤体积评价抗肿瘤活性的有无和水平。治疗模型的情况下，可以根据肿瘤体积评价抗肿瘤活性的有无和水平。

本发明中，作为在体内具有抗肿瘤活性的抗htrop-2抗体，可以优选列举出例如h链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号36～38所示的氨基酸序列、和/或l链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号41～43所示的氨基酸序列的抗体。作为该h链v区，优选例如包含序列号35所示的氨基酸序列的区域，作为该l链v区，优选例如包含序列号40所示的氨基酸序列的区域。

此外，作为本发明的抗htrop-2抗体的其它形态，可以优选列举例如h链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号46～48所示的氨基酸序列、和/或l链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号51～53所示的氨基酸序列的抗体。作为该h链v区，优选例如包含序列号45所示的氨基酸序列的区域，作为该l链v区，优选例如包含序列号50所示的氨基酸序列的区域。

同样地，作为本发明的抗htrop-2抗体的其它形态，可以优选列举例如h链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号56～58所示的氨基酸序列、和/或l链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号61～63所示的氨基酸序列的抗体。作为该h链v区，优选例如包含序列号55所示的氨基酸序列的区域，作为该l链v区，优选例如包含序列号60所示的氨基酸序列的区域。

同样地，作为本发明的抗htrop-2抗体的其它形态，可以优选列举例如h链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号66～68所示的氨基酸序列，和/或l链v区的cdr1～3的氨基酸序列分别依次为序列号71～73所示的氨基酸序列的抗体。作为该h链v区，可以列举出例如包含序列号65所示的氨基酸序列的区域，作为该l链v区，可以列举出例如包含序列号70所示的氨基酸序列的区域。

在本发明中，作为在体内具有抗肿瘤活性的抗htrop-2抗体，更具体而言，可以优选列举出例如由保藏号为fermbp-11251的杂交瘤产生的抗htrop-2单克隆抗体(克隆名：k5-70)、由保藏号为fermbp-11252的杂交瘤产生的抗htrop-2单克隆抗体(克隆名：k5-107)、由保藏号为fermbp-11253的杂交瘤产生的抗htrop-2单克隆抗体(克隆名：k5-116-2-1)、由保藏号为fermbp-11346的杂交瘤产生的抗htrop-2单克隆抗体(克隆名：t6-16)及由保藏号为fermbp-11254的杂交瘤产生的抗htrop-2单克隆抗体(克隆名：t5-86)等。

这里，保藏号为fermbp-11251的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(mouse-mousehybridoma)k5-70”，于2010年5月12日保藏，保藏号为fermbp-11252的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(mouse-mousehybridoma)k5-107”，于2010年5月12日保藏，保藏号为fermbp-11253的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(mouse-mousehybridoma)k5-116-2-1”，于2010年5月12日保藏，保藏号为fermbp-11346的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(mouse-mousehybridoma)t6-16”，于2011年3月1日保藏，保藏号为fermbp-11254的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(mouse-mousehybridoma)t5-86”，于2010年5月12日保藏，均保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。

进而，作为本发明的抗htrop-2抗体，还可以优选列举出例如与由保藏号为fermbp-11251、fermbp-11252、fermbp-11253、fermbp-11346或fermbp-11254的杂交瘤产生的单克隆抗体所结合(识别)的位点(例如表位)结合的抗htrop-2抗体。作为表位，可以优选列举出下述(3-6)项中例示的表位。

(3-6)抗htrop-2抗体的表位

本发明的抗htrop-2抗体的表位(抗原决定簇)只要是抗原htrop-2的至少一部分即可，没有特别限制，例如优选为序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的、除由第252位～第260位的氨基酸构成的区域外的区域的至少一部分，更优选为包含第1位～第69位的氨基酸的区域的至少一部分或包含第100位～第274位的氨基酸的区域(由第252位～第260位的氨基酸构成的区域除外)的至少一部分，进一步优选为包含第27位～第69位的氨基酸的区域的至少一部分或包含第109位～第206位的氨基酸的区域的至少一部分。作为上述表位，特别优选包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第43位～第65位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第152位～第165位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第171位～第183位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第109位～第120位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第193位～第206位的氨基酸的区域、及包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第43位～第56位的氨基酸的区域、以及包含上述区域的部分，其中特别优选的是包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第43位～第65位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第152位～第165位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第171位～第183位的氨基酸的区域、及包含序列号2所示的htrop-2的氨基酸序列中的第109位～第120位的氨基酸的区域、以及包含上述区域的部分。识别该区域的(与该区域或包含该区域的部分结合的)抗htrop-2抗体例如对肿瘤细胞内的内化活性高，在后述的免疫交联物等用途中极为有用。

(3-7)抗htrop-2抗体的特性

如前所述，本发明的抗htrop-2抗体为以低用量在体内具有高抗肿瘤活性的抗体。具体而言，优选对于荷瘤动物模型以20mg/kg体重以下(优选10mg/kg体重以下，更优选5mg/kg体重以下，进一步优选1mg/kg体重以下)的投与量(裸抗体)显示50％以上(优选80％以上，更优选90％以上，进一步优选95％以上、特别优选几乎100％(例如98％以上或99％以上))的肿瘤生长抑制活性。

这里，肿瘤生长抑制活性(％)例如可以通过下式算出。

肿瘤生长抑制活性(％)＝100－〔(抗体投与组的肿瘤体积或肿瘤重量)÷(对照组的肿瘤体积或肿瘤重量)〕×100

此外，本发明的抗htrop-2抗体优选对2种以上人肿瘤细胞株具有抗肿瘤活性。作为人肿瘤细胞株，没有限定，可以列举出例如选自各种人胰癌细胞株、人前列腺癌细胞株、人大肠癌细胞株、人乳腺癌细胞株、人卵巢癌细胞株、人肺癌细胞株及人胆管癌细胞株组成的组中的至少2种，具体而言，可以优选列举出选自人胰癌细胞株pk-59、人胰癌细胞株bxpc-3、人胰癌细胞株kp-3l、人胰癌细胞株kp-2、人胰癌细胞株pk-1、人胰癌细胞株pk-45h、人胰癌细胞株pk-45p、人胰癌细胞株tcc-pan2、人胰癌细胞株suit-2、人大肠癌细胞株caco-2、人大肠癌细胞株sw480、人大肠癌细胞株dld-1、人大肠癌细胞株hct116、人乳腺癌细胞株jimt-1、人乳腺癌细胞株hcc1143、人乳腺癌细胞株mcf-7、人乳腺癌细胞株mda-mb-468、人前列腺癌细胞株du145、人前列腺癌细胞株pc-3、人卵巢癌细胞株sk-ov-3、人肺癌细胞株calu-3及人胆管癌细胞株tfk-1组成的组中的至少2种。其中，作为前述2种以上人肿瘤细胞株，可以更优选列举出选自人胰癌细胞株pk-59、人胰癌细胞株bxpc-3、人大肠癌细胞株sw480、人肺癌细胞株calu-3、人乳腺癌细胞株mda-mb-468及人卵巢癌细胞株sk-ov-3组成的组中的至少2种。

进而，本发明的抗htrop-2抗体优选解离常数(kd值)为1.0×10^-10m以下，更优选1.0×10^-11m以下，进一步优选1.0×10^-12m以下。这里，抗体的结合能力(亲和性)例如可以通过斯卡查德分析(scatchardanalysis)、称为biacore的表面等离子体共振传感器来测定解离常数(kd值)、解离速率常数(kdiss[1/秒])、结合速率常数(kass[1/m.秒])。作为biacore装置，可以列举出例如biacore3000、biacore2000、biacorex、biacorej、biacoreq(均为biacore公司)等。就抗体而言，解离常数(kd值)值越小则结合能力(亲和性)越强则越优选。kd值可以由kdiss及kass两个参数确定，例如可以用式：kd[m]＝kdiss/kass表示。予以说明，kd值的计算方法还可以优选采用后述实施例(具体为实施例10)中所述方法。

(4)基因重组抗体和抗体片段

(4-1)基因重组抗体

作为本发明的抗htrop-2抗体的优选方式之一，可以列举基因重组抗体。作为基因重组抗体，没有限制，但例如可以列举嵌合抗体、人源化抗体和人抗体等。

嵌合抗体(即人源化嵌合抗体)是小鼠源抗体的可变区连接(接合)到人来源的恒定区的抗体(参照proc.natl.acad.sci.u.s.a.81，6851-6855,(1984)等)，在制作嵌合体时，可以通过基因重组技术容易地构建，从而获得这样连接的抗体。

在制作人源化抗体时，通过从小鼠抗体的可变区将互补性决定区(cdr)移植到人可变区，框架区(fr)为人来源，cdr由小鼠来源的cdr构成，制备重构的可变区(即cdr移植(cdrgrafting))。然后，将这些人源化的重构的人可变区与人恒定区连接。这种人源化抗体的制作方法在本领域中是众所周知的(参照nature，321，522-525(1986)；j.mol.biol.，196，901-917(1987)；queencetal.，proc.natl.acad.sci.usa，86：10029-10033(1989)；日本特表平4-502408号公报(日本特许第2828340号公报；queen等)等)。

这里，作为本发明的人源化抗htrop-2抗体中可以使用的小鼠来源的cdr序列，并没有限定，例如，作为h链v区(vh)的cdr1～3可以优选列举出(分别依次为)序列号36～38所示的氨基酸序列、序列号66～68所示的氨基酸序列，作为l链v区(vl)的cdr1～3可以优选列举出(分别依次为)序列号41～43所示的氨基酸序列、序列号71～73所示的氨基酸序列。

此外，在人源化的重构人可变区中，作为h链v区的氨基酸序列，例如可以优选列举出序列号92所示的氨基酸序列(包含由序列号36～38所示的氨基酸序列构成的cdr1～3；进而包含信号肽的氨基酸序列如序列号75所示)、序列号98所示的氨基酸序列(包含由序列号36～38所示的氨基酸序列构成的cdr1～3；进而包含信号肽的氨基酸序列如序列号97所示)、序列号94所示的氨基酸序列(包含由序列号66～68所示的氨基酸序列构成的cdr1～3；进而包含信号肽的氨基酸序列如序列号79所示)、及序列号95所示的氨基酸序列(包含由序列号66～68所示的氨基酸序列构成的cdr1～3；进而包含信号肽的氨基酸序列如序列号81所示)。这里，上述序列号98所示的h链v区的氨基酸序列为将上述的序列号92所示的h链v区的氨基酸序列的第44位的精氨酸(r)置换成甘氨酸(g)的突变型的氨基酸序列。

同样地，在人源化的重构人可变区中，作为l链v区的氨基酸序列，例如可以优选列举出序列号93所示的氨基酸序列(包含由序列号41～43所示的氨基酸序列构成的cdr1～3；进而包含信号肽的氨基酸序列如序列号77所示)、及序列号96所示的氨基酸序列(包含由序列号71～73所示的氨基酸序列构成的cdr1～3；进而包含信号肽的氨基酸序列如序列号83所示)。

这里，作为本发明的人源化抗htrop-2抗体的形态，例如优选下述形态：(i)h链v区的氨基酸序列包含序列号92所示的氨基酸序列、且l链v区的氨基酸序列包含序列号93所示的氨基酸序列的形态；(ii)h链v区的氨基酸序列包含序列号98所示的氨基酸序列、且l链v区的氨基酸序列包含序列号93所示的氨基酸序列的形态。其中，h链v区的氨基酸序列为序列号98所示的氨基酸序列的上述(ii)的人源化抗htrop-2抗体的亲合力(avidity)(即，与2个抗原结合臂的运动能力相关的柔软性)进一步提高，抗原结合活性高，因而特别优选。

同样地，作为本发明的人源化抗htrop-2抗体的其它形态，例如优选下述形态：(iii)h链v区的氨基酸序列包含序列号94所示的氨基酸序列、且l链v区的氨基酸序列包含序列号96所示的氨基酸序列的形态；(iv)h链v区的氨基酸序列包含序列号95所示的氨基酸序列、且l链v区的氨基酸序列包含序列号96所示的氨基酸序列的形态。

关于人抗体(完全人抗体)，一般是v区的抗原结合位点即高变区(hypervariableregion)，v区的其它部分和恒定区的结构具有与人的抗体相同的结构。但是，高变位点也可以来源于其它动物。制作人抗体的技术也是公知的，已建立了通过基因工程学的手法来制作人共通的基因序列的方法。人抗体例如可以通过使用含有具有人抗体的h链和l链基因的人染色体片段的人抗体产生小鼠的方法(参照tomizuka，k.etal.，naturegenetics，(1977)16，133-143；kuroiwa，y.et.al.，nuc.acidsres.，(1998)26，3447-3448；yoshida，h.et.al.，animalcelltechnology：basicandappliedaspects,(1999)10，69-73(kitagawa，y.,matuda，t.andiijima，s.eds.)，kluweracademicpublishers；tomizuka，k.et.al.，proc.natl.acad.sci.usa，(2000)97，722-727等)和获得从人抗体文库挑选的噬菌体展示来源的人抗体的方法(参照wormstone，i.m.et.al，investigativeophthalmology&visualscience.，(2002)43(7)，2301-8；carmen，s.et.al.，briefingsinfunctionalgenomicsandproteomics,(2002)1(2)，189-203；siriwardena，d.et.al.，opthalmology，(2002)109(3)，427-431等)而获得。

关于上述嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，优选为抗体fc区域中的n-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的n-乙酰葡糖胺不与岩藻糖结合的糖链，具体而言可以列举在抗体分子的fc区域中具有该岩藻糖的1位不与n-糖苷键复合型糖链还原末端的n-乙酰氨基葡萄糖的6位发生α结合的糖链的基因重组抗体分子所构成的抗体。如果是这种抗体，则可以使adcc活性极大提高。而且，前述的多克隆抗体和单克隆抗体同样优选这一点(抗体fc区域中n-糖苷键复合型糖链的特征)。

(4-2)抗体片段

本发明的抗htrop-2抗体的片段(部分片段)也包含在本发明的抗体中。其中，本发明的抗体片段与本发明的抗htrop-2抗体一样，具有与htrop-2结合的活性(即可以结合到htrop-2上)，在体内具有抗肿瘤活性。

作为该抗体的片段，是指抗htrop-2多克隆抗体或抗htrop-2单克隆抗体的一部分的区域(即，来源于本发明的抗htrop-2抗体的抗体片段)，例如，可以列举fab、fab’、f(ab’)2、fv(抗体可变区)、单链抗体(h链、l链、h链v区和l链v区等)、scfv、双抗体(diabody)(scfv二聚物)、dsfv(二硫化物稳定化v区)和至少一部分含有互补性决定区(complementaritydeterminingregion：cdr)的肽等。

fab是用蛋白质分解酶中的木瓜蛋白酶处理抗体分子而获得的片段中，h链的n末端侧约一半和l链全体通过二硫键结合的、分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过将编码抗体的fab的dna插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该载体导入到原核生物或真核生物而使之表达，制造fab。

f(ab’)2是用蛋白质分解酶中的胃蛋白酶处理抗体分子而获得的片段中，fab通过铰链区的二硫键结合的稍大的、分子量约为10万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过使后述的fab形成硫醚键或二硫键进行制作。

fab’是切断上述f(ab’)2的铰链区的二硫键的、分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过将编码抗体的fab’片段的dna插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该载体导入于原核生物或真核生物而使之表达，制造fab’。

scfv是将1条h链v区(vh)和1条l链v区(vl)用适当的肽连接子(p)连接的vh-p-vl或vl-p-vh多肽，其是具有抗原结合活性的抗体片段。scfv可以如下制备，即，获得编码抗体的vh和vl的cdna，构建编码scfv的dna，将该dna插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。

双抗体是scfv二聚化形成的抗体片段，其为具有二价的抗原结合活性的抗体片段。二价的抗原结合活性可以是相同的，也可以是其中一方为不同的抗原结合活性。双抗体可以如下制备，即，获得编码抗体的vh和vl的cdna，构建编码scfv的dna并使p的氨基酸序列的长度达到8个残基以下，将该dna插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物使之表达而进行制造。

dsfv是指使vh和vl中的各1个氨基酸残基被置换成半胱氨酸残基的多肽通过该半胱氨酸残基间的二硫键结合形成的抗体。被置换成半胱氨酸残基的氨基酸残基可以按照reiter等人公开的方法(proteinengineering，7，697-704，1994)，基于抗体的立体结构预测进行选择。dsfv可以如下制备：获得编码抗体的vh和vl的cdna，构建编码dsfv的dna，将该dna插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。

含有cdr的肽包含vh的cdr(cdr1～3)及vl的cdr(cdr1～3)中的至少1个以上区域而构成，更优选包含vh的全部cdr的肽、及包含vl的全部cdr的肽，特别优选包含vh及vl的全部cdr(共6个区域)的肽。作为cdr的氨基酸序列，可以优选列举例如前述序列号36～38、41～43、46～48、51～53、56～58、61～63、66～68及71～73所示的氨基酸序列。包含多个cdr的肽可以直接或介由适当的肽连接子结合。含有cdr的肽可以通过构建编码抗体的vh和vl的cdr的dna，将该dna插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。此外，含有cdr的肽还可以通过fmoc法(芴甲氧羰基法)和tboc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。

作为本发明的抗体片段，可以是以原有的形状含有n-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的n-乙酰葡糖胺不与岩藻糖结合的糖链的抗体fc区域的一部分或全部的抗体片段，而且，也可以是上述抗体片段与n-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的n-乙酰氨基葡萄糖不与岩藻糖结合的糖链的抗体fc区域的一部分或全部的融合蛋白质。这种抗体片段可以极大地提高adcc活性，因而优选。

以下，在本说明书中的说明中，上述抗体片段也包含于本发明的抗htrop-2抗体中。

3.多核苷酸、重组载体及转化体

本发明中，还可以提供编码上述本发明的抗htrop-2抗体、其抗体片段的多核苷酸(基因、dna)。作为该多核苷酸，具体而言，优选为包含编码作为上述本发明的抗htrop-2抗体或抗体片段的例示所示出的各氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸可以仅由编码本发明的抗htrop-2抗体、抗体片段的多核苷酸构成，也可以一部分包含该多核苷酸、除此以外还包含基因表达所需要的公知的碱基序列(转录启动子、sd序列、kozak序列、终止子等)，并没有限定。

作为编码本发明的抗htrop-2抗体、抗体片段的多核苷酸，与翻译后的各氨基酸对应的密码子没有特别限定，转录后，可以包含表示在人等哺乳类中一般使用的密码子(优选使用频率高的密码子)的核苷酸dna，此外，还可以包含表示在大肠杆菌或酵母等微生物、植物等中一般使用的密码子(优选使用频率高的密码子)的核苷酸dna。

本发明中，还可以提供包含上述本发明的多核苷酸的重组载体、包含该重组载体的转化体。

对于作为重组载体使用的表达载体中引入的多核苷酸(基因、dna)，可以根据需要预先在上游连接转录启动子、sd序列(宿主为原核细胞的情况)及kozak序列(宿主为真核细胞的情况)，可以在下游连接终止子，除此以外还可以预先连接增强子、剪接信号、多聚腺苷酸附加信号、选择标志等。予以说明，上述转录启动子等基因表达所需要的各要素可以从最初包含于该多核苷酸中，原本包含于表达载体中的情况下也可以对其进行利用，各要素的使用形态没有特别限定。

作为在表达载体中引入该多核苷酸的方法，例如可以采用使用限制酶的方法、使用拓扑异构酶的方法等利用了公知的基因重组技术的各种方法。此外，作为表达载体，只要是例如质粒dna、噬菌体dna、逆转录转座子dna、逆转录病毒载体、人工染色体dna等能够保持编码本发明的抗htrop-2抗体、其抗体片段的多核苷酸(基因、dna)则没有限定，可以适宜选择使用适合于所使用的宿主细胞的载体。

然后，将所构建的上述重组载体导入宿主中而得到转化体，对其进行培养，由此可以使本发明的抗htrop-2抗体、其抗体片段表达。予以说明，本发明中所说的“转化体”是指宿主中导入有外来基因的物质，例如包括通过在宿主中导入质粒dna等(转化)而导入有外来基因的物质；以及，通过使各种病毒和噬菌体感染宿主(转导)而导入有外来基因的物质。

作为宿主，只要是导入有上述重组载体后能够表达本发明的抗htrop-2抗体、其抗体片段则没有限定，可以适宜选择，可以列举出例如人或小鼠等各种动物细胞、各种植物细胞、细菌、酵母、植物细胞等公知的宿主。

将动物细胞作为宿主时，使用例如人成纤维细胞、人胚胎肾细胞、hek293细胞、293f细胞、cho细胞、猴细胞cos-7、vero(非洲绿猴肾细胞)、小鼠l细胞、大鼠gh3、人fl细胞等。此外，还可以使用sf9细胞、sf21细胞等昆虫细胞。

将细菌作为宿主时，使用例如大肠杆菌、枯草杆菌等。

将酵母作为宿主时，使用例如啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)等。

将植物细胞作为宿主时，使用例如烟草by-2细胞等。

得到转化体的方法没有限定，可以考虑宿主与表达载体的种类的组合而适宜选择，例如可以优选列举出电穿孔法、脂质转染法、热休克法、peg法、磷酸钙法、deae葡聚糖法、以及感染dna病毒或rna病毒等各种病毒的方法等。

在得到的转化体中，重组载体所包含的多核苷酸的密码子型可以与所使用的宿主的密码子型一致、也可以不同，没有限定。

4.抗体-药剂复合物的制作

作为使用上述本发明的抗htrop-2抗体的免疫交联物等，可以提供含有该抗体以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质(化合物等)的抗体-药剂复合物。予以说明，在预先分别制备该抗体分子以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质之后，将它们复合化而获得的物质一般被称为免疫交联物。而且，通过使用基因重组技术，将具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质中的蛋白质毒素在基因上与抗体基因连接，作为1个蛋白质(融合蛋白质)表达而获得的物质一般被称为免疫毒素。

作为具有抗肿瘤活性的物质，可以列举出例如阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)、丝裂霉素(mitomycin)c、auristatine、放射性同位素(ri)等。作为具有细胞杀伤活性的物质，可以列举出例如皂草素、篦麻毒素、绿脓杆菌外毒素、白喉毒素、放射性同位素(ri)等，其中优选使用皂草素和绿脓杆菌外毒素。予以说明，作为具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的ri，没有限定，可以列举出例如⁹⁰y、¹¹¹in、¹²⁵i、³h、³⁵s、¹⁴c、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁸⁹re、¹⁷⁷lu、⁶⁷cu、²¹²bi、²¹³bi、²¹¹at、¹⁹⁸au、²²⁴ac、¹²⁶i、¹³³i、⁷⁷br、^113min、⁹⁵ru、⁹⁷ru、¹⁰³ru、¹⁰⁵ru、¹⁰⁷hg、²⁰³hg、^94mtc、^121mte、^122mte、^125mte、¹⁶⁵tm、¹⁶⁷tm、¹⁶⁸tm、¹¹¹ag、¹⁹⁷pt、¹⁰⁹pd、³²p、³³p、⁴⁷sc、¹⁵³sm、¹⁷⁷lu、¹⁰⁵rh、¹⁴²pr、¹⁴³pr、¹⁶¹tb、¹⁶⁶ho、¹⁹⁹au、⁵⁷co、⁵⁸co、⁵¹cr、⁵⁹fe、¹⁸f、⁷⁵se、²⁰¹tl、²²⁵ac、⁷⁶br、⁸⁶y、¹⁶⁹yb、¹⁶⁶dy、²¹²pb及²²³ra等。

作为抗体-药剂复合物的制作方法并没有限定，例如可以列举通过二硫键或腙键将抗体与药剂偶联的方法等。

上述本发明的抗htrop-2抗体在对表达htrop-2的目标肿瘤细胞内的内化活性方面优异。因此，通过预先使具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质复合化，可以使这些物质直接且高选择地作用于肿瘤细胞。本发明的抗体-药剂复合物在向目标肿瘤细胞传送药剂的能力上极为优异。

予以说明，对细胞内的内化活性可以如下评价，即，通过用罗丹明等对抗体进行萤光标记，用萤光显微镜等观察向细胞内的进入举动和抗体的定位性。

另外，本发明中还可以提供在抗体-药剂复合物中使用前述抗体片段代替抗体的抗体片段-药剂复合物。抗体片段-药剂复合物的详细内容可以适当应用上述抗体-药剂复合物的说明。

以下，在本说明书的说明中，抗体片段-药剂复合物也包含于本发明的抗体-药剂复合物中。

5.药物组合物

本发明的抗htrop-2抗体和抗体-药剂复合物作为包含于药物组合物中的有效成分是有用的。

该药物组合物作为肿瘤的治疗用和/或诊断用的药物组合物是有用的。尤其是，由于本发明的抗htrop-2抗体和含有该抗体的抗体-药剂复合物具有作为抗肿瘤活性的优异的肿瘤生长抑制活性，因此优选在肿瘤的治疗用中使用。即，本发明的抗htrop-2抗体和抗体-药剂复合物作为包含于肿瘤治疗剂和肿瘤诊断剂中的有效成分是有用的。予以说明，本发明中，上述肿瘤的治疗还包括抑制肿瘤生长和阻遏肿瘤生长的意思，具体而言，例如若为肿瘤治疗剂，则还包括肿瘤生长抑制剂(tumorgrowthinhibitor)和肿瘤生长阻遏剂(tumorgrowthsuppressor)的形态。

本发明的药物组合物优选以含有本发明的抗htrop-2抗体和/或抗体-药剂复合物作为有效成分、而且包含药学上允许的载体的药物组合物的形态提供。此外，本发明的药物组合物还可以与公知的抗肿瘤剂并用。通过并用，可以获得更好的抗肿瘤效果。

作为本发明的药物组合物的适用对象疾病(肿瘤)，可以列举确认了表达htrop-2的前述公知的各种人肿瘤。其中，特别优选列举人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人胆管癌等各种人肿瘤中的1种或2种以上。这些疾病可以是单独的，也可以是2种以上并发。此外，作为对象的肿瘤还可以是复发癌、转移癌，本发明的药物组合物(进而，本发明的抗htrop-2抗体和/或抗体-药剂复合物)可以有效用作复发癌、转移癌的治疗剂和诊断剂。

所谓“药学上允许的载体”，可以列举赋形剂、稀释剂、增量剂、崩解剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、芳香剂、着色剂、甜味剂、粘稠剂、矫味剂、增溶剂或其它添加剂等。通过使用1种以上这种载体，可以制备注射剂、液剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂或糖浆剂等形态的药物组合物。这些药物组合物可以经口或非经口投与。作为用于非经口投与的其它形态，包括含有1种以上的活性物质的通过常规方法制备的注射剂等。注射剂的情况中，可以通过溶解或悬浮于生理盐水或市售的注射用蒸馏水等药学上允许的载体中来制造。

尤其是，对生物体内投与本发明的抗htrop-2抗体来源的抗体片段(其中尤其是低分子的物质)时，在其基础上还可以使用胶体分散系。胶体分散系可期待具有提高化合物(抗体片段)在生物体内稳定性的效果和将化合物高效输送到特定的内脏器官、组织或细胞的效果。胶体分散系只要为通常使用的胶体分散系即可，没有限制，可以列举聚乙二醇、高分子复合物、高分子凝集体、纳米胶囊、微球体、珠子和水包油系的乳化剂、胶束、混合胶束和以包含脂质体在内的脂质为基础的分散系，优选为具有将化合物高效输送到特定脏器、组织或细胞的效果的多个脂质体、人工膜的小囊泡(manninoetal.，biotechniques，1988，6，682；blumeandcevc，biochem.etbiophys.acta，1990，1029，91；lappalainenetal.，antiviralres.，1994，23，119；chonnandcullis，currentop.biotech.，1995，6，698)。

本发明的药物组合物的投与量根据患者的年龄、性别、体重和症状、治疗效果、投与方法、处理时间或药物组合物所含的本发明的抗htrop-2抗体和抗体-药剂复合物的种类等而不同。通常，成人每人每次可以在600μg到6000mg的范围内投与，但并不限于此范围。

例如通过注射剂投与时，对人患者1次的投与中，可以每1kg体重平均1天以1次～数次投与100μg～100mg的量，还可以优选采用每3天、1周、10天或2周投与1次或单次(总计投与次数为1次)投与的方式。作为投与的形态，可以列举静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌肉内注射或腹腔内注射等，优选为静脉内注射。而且，注射剂根据情况还可以调制成非水性的稀释剂(例如聚乙二醇、橄榄油等植物油、乙醇等醇类等)、悬浮剂或乳浊剂。这种注射剂的无菌化可以通过过滤器进行过滤杀菌、配合杀菌剂等来进行。注射剂可以制备成使用时调制的形态。即，可以通过冷冻干燥法等制成无菌的固体组合物，在使用前溶解于无菌的注射用蒸馏水或其它溶剂中使用。

另外，本发明还提供用于制造治疗和/或诊断肿瘤的药物(药剂)的前述本发明的抗htrop-2抗体和/或抗体-药剂复合物的应用。而且，本发明还提供治疗和/或诊断肿瘤用的前述本发明的抗htrop-2抗体和/或抗体-药剂复合物。

此外，本发明还提供肿瘤的治疗和/或诊断方法，其特征在于，其使用前述本发明的抗htrop-2抗体和/或抗体-药剂复合物(即投与患者)，而且，还提供前述本发明的抗htrop-2抗体和/或抗体-药剂复合物在用于治疗和/或诊断肿瘤中的应用。

6.肿瘤的检测方法

本发明的肿瘤检测方法的特征在于，使前述本发明的抗htrop-2抗体与从生物体采集的试样(以下称生物体试样)反应，检测发生反应的抗体的信号。

如前所述，由于确认了htrop-2在各种肿瘤细胞中特异性表达，htrop-2、尤其是游离htrop-2(htrop-2的细胞外区域部分)可以作为各种肿瘤标志来使用。其中，优选作为人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌和人乳腺癌的标志来使用。

因此，可以通过使本发明的抗htrop-2抗体与生物体试样反应，检测发生反应的抗体的信号来检测肿瘤。获得的抗体的信号成为生物体试样中的抗原量(即htrop-2量或游离htrop-2量)的指标。关于使用本发明的抗体的肿瘤的检测，首先，使作为试样的从被验者中提取的生物体试样，例如作为检查对象的组织片或血液等与本发明的抗体通过抗原抗体反应结合。然后，基于结合的抗体量的测定结果测定生物体试样中的目的抗原量，从而进行。该测定可以按照公知的免疫学测定法进行，可以使用例如免疫沉淀法、免疫凝集法、标记免疫测定法、免疫比浊法、蛋白印迹法、流式细胞术法等。标记免疫测定法中，抗体的信号除了以用标记抗体直接检测的标记量表示之外，还可以以已知浓度或已知抗体效价的抗体作为标准液相对地表示。即，可以通过测定计测定标准液和试样，以标准液的值作为基准，相对地表示生物体试样中的抗体信号。作为标记免疫测定法，可以列举例如elisa法、ei法、ria法、萤光免疫测定(fia)法、化学发光免疫测定法(luminescenceimmunoassay)等。其中elisa法由于简便和高灵敏度而尤其优选。

本发明中，可以将通过上述检测方法获得的检测结果作为指标来评价或诊断肿瘤的状态。例如，检测结果超过预定的基准值时判断为肿瘤阳性，在预定的基准值以下时判断为肿瘤阴性，为阳性时，判断为有发生任意一种肿瘤的可能性，可以评价肿瘤的状态。这里，所谓肿瘤的状态是指是否患有肿瘤或其进行程度，可以列举肿瘤发病的有无、进行度、恶性程度、转移的有无和复发的有无等。

在上述评价时，作为肿瘤的状态，可以选择1个，也可以组合选择多个。关于肿瘤的有无的评价，可以基于所获得的检测结果，通过以预定的基准值作为界限，判断是否患有肿瘤来进行。肿瘤的恶性程度是表示癌进行到何种程度的指标，也可以基于检测结果，对病期(stage)分类再进行评价，或分类为早期癌或晚期癌再进行评价。例如，还可以将检测结果作为指标，评价为早期癌或晚期癌。关于肿瘤的转移，可以通过以检测结果作为指标，根据在从原发瘤的位置离开的位点是否出现新生物来评价。复发可以根据在间歇期或缓解后检测结果是否再次超过预定的基准值来评价。

7.肿瘤的检测用或诊断用试剂盒

本发明的抗htrop-2抗体可以以肿瘤的检测用或诊断用试剂盒的形态提供。本发明的试剂盒含有抗体，此外还可以含有标记物质、或用于固定抗体或其标记物的固定化试剂等。所谓抗体的标记物质是指用酶、放射性同位素、萤光化合物和化学发光化合物等标记的物质。本发明的试剂盒除了上述构成要素之外，还可以含有用于实施本发明的检测的其它试剂，例如标记物为酶标记物时，可以含有酶底物(显色性底物等)、酶底物溶解液、酶反应停止液、或试样用稀释液等。而且，还可以含有各种缓冲液、无菌水、各种细胞培养容器、各种反应容器(eppendorf管等)、封闭剂(牛血清白蛋白(bsa)、脱脂乳、山羊血清等血清成分)、洗涤剂、表面活性剂、各种板、叠氮化钠等防腐剂和实验操作手册(说明书)等。

本发明的试剂盒可有效用于进行上述本发明的检测方法，其有用性极高。

以下，通过列举实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限于此。

〔实施例1〕

[htrop-2基因的克隆]

htrop-2全长基因的分离是通过rt-pcr法由人胎肝(10周大的胚胎)进行的。首先，基于htrop-2基因(genbank登录号no.nm_002353)的序列设计了以下所示的pcr引物。

正向侧引物：5’-ttcctccgccccaccatggc-3’(序列号3)

反向侧引物：5’-ctcgagcaagctcggttcctttctc-3’(序列号4)

此时，反向侧引物中除去了终止密码子并添加了xhoi的限制酶消化序列。以由这些引物和人胎肝(10周大的胚胎)制备的总rna(takara)合成的cdna为模板进行pcr反应。然后，利用琼脂糖凝胶电泳进行展开、进行目标条带的提取，克隆到pcrii载体(invitrogen)中(pcrii-htrop2)。通过测序，对所克隆的htrop-2的cdna进行了确认。

表达载体的构建：由pcrii-htrop2切出含有htrop-2基因的ecori/xhoi片段，插入到a载体(invitrogen)的ecori/xhoi位点，从而进行构建(pcdna4-htrop2-myc/his)。此外，由pcdna4-htrop2-myc/his切出含有htrop-2基因的hindiii/pmei片段(hindiii切断位点进行了平滑末端化)，插入到pcdna3.1(+)载体(invitrogen)的pmei位点，从而构建了具有新霉素耐性基因的表达载体(pcdna3.1-htrop2-myc/his)。

〔实施例2〕

[htrop-2基因稳定细胞株的构建]

使用lipofectamine2000试剂(invitrogen)，将按照上述方法制作的编码htrop-2的全长cdna的表达载体(pcdna3.1-htrop2-myc/his)导入hek293细胞(riken)、huh-7细胞(hsrrb)、7e2-c细胞(wo2005/052156中所记载的)、cho-k1细胞(hsrrb)中，利用抗生素g418(遗传霉素，gibcobrl)进行选择后，建立了稳定表达htrop-2的细胞株，从而获得。

〔实施例3〕

[htrop-2细胞外区域的重组蛋白制作]

通过pcr法对编码htrop-2细胞外区域的一部分(具体而言，包含序列号2所示的氨基酸序列中的第1位～第263位的氨基酸的区域)的基因片段进行了扩增。扩增中使用的引物如下所示。

正向侧引物：5’-ttcctccgccccaccatggc-3’(序列号3)

反向侧引物：5’-ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg-3’(序列号5)

此时，反向侧引物中添加了xhoi限制酶消化位点。利用琼脂糖凝胶电泳对由pcr法扩增获得的dna片段进行展开，使用qiaquick(注册商标)gelextractionkit(qiagen)进行纯化。纯化而得的dna片段亚克隆至pcrblunt载体(invitrogen)中(pcrb-htrop-2ec)，确认基因序列。然后，由pcrb-htrop-2ec切出含有编码htrop-2的细胞外区域的基因片段的ecori/xhoi片段，插入到a载体(invitrogen)的ecori/xhoi位点(pcdna4mh-htrop-2ec)。进而，为了在pcdna4mh-htrop-2ec的bamhi/ecori位点制作nrui限制酶切断位点，连接、插入以下所示的寡核苷酸。

寡核苷酸1：5’-gatccactagtcgcgagtggtgg-3’(序列号6)

寡核苷酸2：5’-aattccaccactcgcgactagtg-3’(序列号7)

同样地在pcdna4mh-htrop-2ec的pmei位点插入pbglii连接子(takara)(pcdna4mh-nb-htrop-2ec)。为了使用杆状病毒(baculovirus)制作重组蛋白，由pcdna4mh-nb-htrop-2ec切出含有编码htrop-2的细胞外区域的基因片段的nrui/bglii片段，插入到ppsc8载体(日本农产工业)的nrui/bglii位点(ppsc8-htrop2ec)。委托日本农产工业来进行使用杆状病毒制作htrop-2细胞外区域的重组蛋白。

htrop-2细胞外区域的重组蛋白的纯化如下进行。在含有重组蛋白的培养上清中加入nisepharose6fastflow(gehealthcare)，在4℃下进行2小时结合。然后，使用econo柱(biorad)，用含有20mm咪唑的磷酸缓冲液洗涤，用含有300mm咪唑的磷酸缓冲液进行洗脱，从而进行纯化。

〔实施例4〕

[人epcamcdna的分离和表达载体的构建]

人epcam全长基因的分离是通过rt-pcr法由人胎肝(10周大的胚胎)进行的。首先，基于人epcam基因(genbank登录号no.nm002354)的序列设计了以下所示的pcr引物。

正向侧引物：5’-tcctcgtgtcccactcccgg-3’(序列号8)

反向侧引物：5’-ctcgagtgcattgagttccctatgc-3’(序列号9)

此时，反向侧引物中除去了终止密码子并添加了xhoi的限制酶消化序列。以由这些引物和人胎肝(10周大的胚胎)源的总rna(takara)合成的cdna为模板进行pcr反应。然后，利用琼脂糖凝胶电泳进行展开、进行目标条带的提取，克隆到pcrii载体(invitrogen)中(pcrii-hepcam)。通过测序对克隆的人epcam的cdna进行了确认。

表达载体的构建：由pcrii-hepcam切出含有人epcam基因的ecori/xhoi片段，插入到a载体(invitrogen)的ecori/xhoi位点，从而进行构建(pcdna4-hepcam-myc/his)。此外，由pcdna4-hepcam-myc/his切出含有人epcam基因的hindiii/pmei片段(hindiii切断位点进行了平滑末端化)，插入到pcdna3.1(+)载体(invitrogen)的pmei位点，从而构建了具有新霉素耐性基因的表达载体(pcdna3.1-hepcam-myc/his)。

〔实施例5〕

[抗htrop-2单克隆抗体的制作]

作为免疫原，使用了htrop-2稳定表达细胞株(hek293-htrop-2细胞、cho-k1-htrop-2细胞、7e2-c-htrop-2细胞)、在细胞表面内源性表达htrop-2蛋白的人胰脏癌细胞株(pk-59，rcb1901；由rikencellbank购入)、或通过上述方法制作的htrop-2的细胞外区域的重组蛋白。

在htrop-2稳定表达细胞株时将1×10⁷细胞、在重组htrop-2蛋白时将20μg蛋白分别与免疫辅助剂titermaxgold(funakoshi株式会社)以1：1混合，制备乳浊液，注射到小鼠(c57/bl6，balb/c)的两脚掌或腹腔内(初次免疫)。在对两脚掌短期免疫时，从初次免疫起3天后及10天后进行加强免疫，在最后一次免疫的次日，取出两膝窝的淋巴结，制备淋巴细胞。在向腹腔内长期免疫时，从初次免疫起以每周1次的比例进行加强免疫(在1～2个月内实施)，按照常规方法由脾脏分离b细胞。加强免疫时，在细胞免疫的情况下使用5×10⁶细胞的用pbs悬浮的细胞悬浮液，在蛋白质抗原的情况下，使用5μg的pbs溶液。

将制备的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞株(p3-x63-ag8.653)以3：1的比例混合，用聚乙二醇法进行细胞融合，用含有hat(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)的甲基纤维素培养基(商品名：clonacell-hycloningmediumd；stemcell)培养7～28天，将增殖出来的杂交瘤的单一集落一个一个地挑到96孔平底培养板中，使用含有hat的液体选择培养基在5％co2培养箱中培养。对来自于增殖出来的单一集落的杂交瘤的培养上清，利用cellelisa(后述)进行一次筛选、通过使用huh-7-htrop-2细胞pk-59的facs解析进行2次筛选，从而建立了300种产生识别在活细胞的细胞表面表达的htrop-2蛋白的抗htrop-2单克隆抗体的杂交瘤。

〔实施例6〕

[使用cellelisa进行的一次筛选]

在96孔培养板(bdfalcon)中，以3×10⁴细胞/孔交替接种cho-k1细胞(htrop-2阴性对照：由japanhealthsciencesfoundation购入)、和cho-k1-htrop-2细胞(或huh-7细胞(htrop-2阴性对照：由japanhealthsciencesfoundation购入)和huh-7-htrop-2细胞)，在5％co2、37℃下培养1～2天。通过倾析除去细胞培养液，接下来用冰冷pbs洗涤后，用4％多聚甲醛-pbs处理5分钟，从而将细胞固定，用冰冷pbs洗涤后，作为elisa板。之后，按照常规方法进行elisa法。具体如下所示。

首先，在室温下用2％脱脂乳-pbs溶液进行30分钟～1小时封闭。接下来，加入杂交瘤培养上清，在室温下反应1小时后，用0.1％tween20-pbs溶液洗涤3次。加入作为二抗的用封闭溶液稀释1000倍的辣根过氧化物酶(hrp)标记抗小鼠igg(gehealthcarebiosciences)，在室温下反应1小时后，用0.1％tween20-pbs溶液洗涤3次。添加tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺：sigma)底物溶液进行显色反应，加入1m硫酸使反应停止。使用酶标仪model550(biorad)测定吸光度(405nm)。将相对于阴性对照显示高吸光度值的杂交瘤培养上清的相应杂交瘤在24孔平底培养板中进行扩大培养，转移到使用facs解析进行的二次筛选(后述)。

〔实施例7〕

[使用facs解析进行的二次筛选]

对上述用cellelisa进行的一次筛选中为阳性的杂交瘤，使用facs解析进行二次筛选。就细胞而言，以不表达htrop-2的人肝癌细胞株huh-7细胞为阴性对照，以相对于表达htrop-2的稳定细胞株huh-7-htrop-2细胞的反应性为指标进行评价，接下来以与在细胞表面内源性表达htrop-2蛋白的人胰脏癌细胞株pk-59细胞(rcb1901；由rikencellbank购入)的反应性进行评价。

通过胰蛋白酶处理将细胞从培养皿剥离，制备细胞悬浮液(细胞密度2×10⁶细胞/ml)。使在使用cellelisa进行的一次筛选中显示阳性反应的杂交瘤上清和细胞悬浮液100μl于4℃反应20分钟。用pbs洗涤后，使之与pe标记抗小鼠igg(bdpharmingen)(0.1μg)反应(4℃，30分钟)后，用facscalibur(becton，dickinsonandcompany)解析。

最终，建立了约300种产生识别在活细胞的细胞表面表达的htrop-2蛋白的抗htrop-2单克隆抗体的杂交瘤。

〔实施例8〕

[同种型的鉴定]

使用小鼠单克隆抗体同种型测定试剂盒(serotec公司)并按照试剂盒所附方法进行制作的抗htrop-2单克隆抗体的同种型的鉴定。

〔实施例9〕

[trop-2抗体的腹水化及抗体纯化]

在预先(7天前)投与2,6,10,14-四甲基十五烷(pristane)的balb/c裸小鼠的腹腔内投与3×10⁶个按照上述方法制作的杂交瘤的克隆，采集2周后的腹水。进而，进行辛酸沉淀、使用蛋白g柱(hitrapproteing；gehealthcarebiosciences)或蛋白a柱(hitrapproteina；gehealthcarebiosciences)进行亲和纯化，从而由该腹水获得各杂交瘤克隆所产生的抗htrop-2单克隆抗体。

〔实施例10〕

[抗原亲和性的测定(kd值的测定)]

通过使用了elisa的方法计算所制作的抗htrop-2单克隆抗体的抗原亲和性(kd值)(djavadi-ohaniancel.etal(1996)，inantibodyengineering，chapter4，pp77-97.irlpress，oxford)。

具体而言，在96孔培养板(corning)中添加纯化的重组htrop-2蛋白(0.1μg/ml)，将抗原固定化(室温、1小时，或4℃、一晚)。然后，用pbs洗涤3次，加入2％脱脂乳(pbs溶液)进行封闭(室温，1小时)。用pbs洗涤2次后，在上述elisa板中添加预先混合抗原溶液(纯化htrop-2蛋白；50，25，12.5，6.25，3.125nm)和抗htrop-2单克隆抗体的各克隆(0.5nm)并使其平衡化的抗原-抗体复合物，并使之反应(室温，1小时)。用pbs洗涤3次后，使之与用封闭液稀释的hrp标记抗小鼠igg(最终浓度1μg/ml)(gehealthcarebiosciences)反应(室温，1小时)。接下来用0.1％tween20-pbs溶液洗涤3次后，添加tmb(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺：sigma)底物溶液，进行显色反应，加入1m硫酸使反应停止。使用酶标仪model550(biorad)测定吸光度。

解离常数(kd)的计算式如下所示。

基于质量作用定律，抗原抗体反应如下表示。

kd＝k2/k1＝agf×abf/ag-ab＝agf×abf/x....(2)

式(2)中，agf表示游离抗原的浓度，abf表示游离抗体的浓度，ag-ab表示抗原-抗体复合物的浓度，当设ag-ab＝x时，游离抗体浓度为

abf＝abt-x.......(3)

式(2)变为：

kd＝agf×(abt-×)/×.......(4)

对式(4)的两边乘以x/kd×abt时，

x/abt＝agf×(1-×/abt)×1/kd

x/abt×1/agf＝(1-x/abt)×1/kd.......(5)

在式(5)中，当设x＝x/abt、y＝x/abt×agf时，

y＝(1-x)×1/kd.......(6)

由式(6)算出kd值。

按照上述方法测定了所制作的300克隆的抗htrop-2单克隆抗体的kd值，结果kd值显示为1×10^-10(m)以下的克隆为133克隆，kd值显示为1×10^-11(m)以下的克隆为59克隆，kd值显示为1×10^-12(m)以下的克隆为2克隆。

在体内显示肿瘤生长抑制活性的抗htrop-2单克隆抗体中，k5-70(小鼠igg2a)、t6-16(小鼠igg2a)、k5-107(小鼠igg1)、k5-116-2-1(小鼠igg2a)、及t5-86(小鼠igg1)的kd值分别依次为6.8×10^-12(m)、4.3×10^-12(m)、4.7×10^-12(m)、2.69×10^-11(m)、及8.49×10^-11(m)(图1、表1)。

[表1]

抗htrop-2单克隆抗体的kd值

〔实施例11〕

[抗htrop-2单克隆抗体与人癌细胞株的反应性]

人癌细胞株(人肿瘤细胞株)使用了由日本卫生科学基金会(japanhealthsciencesfoundation，hsrrb)、riken细胞库(riken)，美国模式培养物保藏所(americantypeculturecollection，atcc)、欧洲细胞培养物收藏中心(europeancollectionofcellcultures，ecacc)、德国典型菌种保藏中心(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures，dsmz)获得的细胞株。具体列举如下。

huh-1(hsrrb),huh-6(hsrrb),huh-7(hsrrb),jhh-5(hsrrb),jhh-6(hsrrb),jhh-7(hsrrb),hle(hsrrb),hlf(hsrrb),hepg2(hsrrb),alexander(hsrrb),kp-1n(hsrrb),kp-1nl(hsrrb),kp-2(hsrrb),kp-3(hsrrb),kp-3l(hsrrb),pk-1(riken),panc-1(riken),miapaca-2(hsrrb),pk-59(riken),pk-45h(riken),pk-45p(riken),bxpc-3(atcc),suit-2(hsrrb),tcc-pan2(hsrrb),sw480(atcc),dld-1(hsrrb),lovo(hsrrb),colo-320(riken),caco-2(riken),cw-2(riken),hct116(atcc),hcc-56(hsrrb),mcf-7(hsrrb),jimt-1(dsmz),hcc1143(atcc),a549(hsrrb),du145(riken),pc-3(hsrrb)

对于癌细胞，通过胰蛋白酶处理而由培养皿剥离，并制备细胞悬浮液(细胞密度为2×10⁶细胞/ml)。在细胞悬浮液100μl中加入抗htrop-2单克隆抗体(0.1μg)，4℃下反应20分钟。用pbs洗涤后，与pe标记抗小鼠igg(bdpharmingen)(0.1μg)反应(4℃、30分钟)，然后通过facscalibur(becton，dickinsonandcompany)解析。

所制作的抗htrop-2抗体均不与不内源性表达htrop-2的人肝癌细胞株huh-7结合，另一方面，显示出与表达htrop-2基因的稳定细胞株huh-7-htrop-2细胞结合(图2)。接下来，通过facs解析对所制作的htrop-2单克隆抗体与人癌细胞株(在细胞表面内源性表达的htrop-2蛋白)的反应性进行研究，结果显示所制作的300种抗htrop-2单克隆抗体均与人胰脏癌细胞株(pk-59、bxpc-3)结合，特别是，和仅pe标记抗小鼠igg(bdpharmingen)反应时相比，在体内显示肿瘤生长抑制活性的k5-70、t6-16、k5-107、k5-116-2-1、t5-86抗体在pk-59细胞的情况下平均荧光强度为k5-70(44倍)、t6-16(59倍)、k5-107(89倍)、k5-116-2-1(122倍)、t5-86(15倍)(图3)，在bxpc-3细胞的情况下为k5-70(45倍)、t6-16(25倍)、k5-107(90倍)、k5-116-2-1(121倍)、t5-86(10倍)，各抗体均显示为强结合性(图4)。

在pk-59和bxpc-3以外的人癌细胞株中，在胰脏癌细胞株12种之中，与kp-2、kp-3l、pk-1、pk-45h、suit-2、tcc-pan2结合，不与kp-1n、kp-1nl、kp-3、panc-1、mia-paca2结合(图5)。在人大肠癌细胞株的情况下，与caco-2、sw480、dld-1、hct116结合，不与colo-320、cw-2结合(图6)。此外，与jimt-1、hcc1143(均为人乳腺癌细胞株)、pc-3、du145(均为人前列腺癌细胞株)结合，识别在多种人癌细胞株的细胞表面内源性表达的htrop-2蛋白(图6)。

〔实施例12〕

[与小鼠trop-2蛋白、人trop-1/epcam蛋白的交叉反应性]

为了调查所制作的htrop-2单克隆抗体的特异性，通过facs解析研究了与和htrop-2蛋白在氨基酸序列方面显示80％同源性的小鼠trop-2蛋白、与htrop-2蛋白在氨基酸序列方面显示50％同源性的人trop-1/epcam的反应性。

具体而言，将包含小鼠trop-2基因(genbank登录号no.nm_020047、y08830)的全长cdna的表达载体(小鼠trop-2-pcdna3.1(+)，东京大学分子细胞生物学研究所惠赠)、以及包含人trop-1/epcam基因(genbank登录号no.nm_002354)的全长cdna的表达载体(pcdna3.1-hepcam-myc/his)分别使用lipofectamine2000试剂(invitrogen)对cho-k1细胞进行瞬时基因导入，24～48小时后通过胰蛋白酶处理由培养皿剥离细胞，制备细胞悬浮液，依次与所制作的htrop-2单克隆抗体(0.1μg)、pe标记抗小鼠igg反应后，通过facscalibur进行解析。

在瞬时表达小鼠trop-2基因的cho-k1细胞中，用作阳性对照的与小鼠trop-2显示交叉反应的t2-102抗体(小鼠igg1)显示出强烈结合，另一方面，k5-70、t6-16、k5-107、k5-116-2-1、t5-86抗体与小鼠trop-2不显示交叉反应(图7)。

同样地，在瞬时表达人epcam/trop-1基因的cho-k1细胞中，用作阳性对照的抗人epcam单克隆抗体(bdpharmingen)显示出强烈结合，另一方面，k5-70、t6-16、k5-107、k5-116-2-1、t5-86抗体与人epcam/trop-1不显示交叉反应(图8)。

以上结果表明，所制作的htrop-2单克隆抗体、特别是在体内显示抗肿瘤活性的k5-70、t6-16、k5-107、k5-116-2-1、t5-86抗体特异性地与htrop-2结合。

〔实施例13〕

[细胞增殖抑制活性的测定]

作为调查抗htrop-2单克隆抗体的htrop-2的功能抑制的方法之一，基于使用tetracolorone(生化学工业)的活细胞数的测定，评价了对在细胞表面内源性表达htrop-2的人癌细胞的细胞增殖的影响。具体而言，按照使pk-59细胞在含有0.5％的胎牛血清(biowest公司制)的rpmi1640培养基中达到2×10⁵细胞/ml的细胞浓度的方式制备细胞悬浮液，在96孔培养板中各接种100μl。接下来，添加小鼠igg(阴性对照)、抗htrop-2单克隆抗体(最终浓度0.1μg/ml、1μg/ml)，在37℃、5％co2培养箱中培养72小时。作为比较对照，使用市售的抗htrop-2单克隆抗体(克隆yy01，santacruz)。在细胞中添加tetracolorone(生化学工业)，在5％co2培养箱中反应1～2小时。使用酶标仪对反应后的96孔培养板直接测定波长490nm(对照波长：655nm)的吸光度。各组在3孔中实施，通过学生t检验(student’st检验)进行差异显著性检验，将p<0.05判定为统计学上显著。

目前，通过上述方法对本公司制作的抗htrop-2单克隆抗体中的约160克隆调查了对pk-59细胞的细胞增殖的效果，结果可以确认，与小鼠igg(阴性对照)相比，在体内显示肿瘤生长抑制活性的t6-16、t5-86、k5-70、k5-107具有20％～40％的细胞增殖抑制活性，明确了这些抗htrop-2抗体与在人癌细胞表面表达的htrop-2蛋白结合并中和htrop-2蛋白的功能，具有抑制癌细胞增殖的活性(图9)。

〔实施例14〕

[划痕试验(scratchassay)]

通过划痕试验对抗htrop-2单克隆抗体的人癌细胞的迁移能力进行评价。按照使pk-59细胞在含有10％胎牛血清的rpmi1640培养基中达到3×10⁵细胞/ml的细胞浓度的方式制备细胞悬浮液，在96孔培养板中各接种100μl。在细胞达到铺满的阶段，采用用枪头(tip)的尖端沿着纵向划线的方式剥离单层培养的细胞的一部分。按照使抗htrop-2单克隆抗体、以及作为阴性对照的小鼠igg的最终浓度达到0.1以及1μg/ml的方式在培养基中进行添加，培养24小时，拍摄抗体添加前(0天)和培养24小时后(1天)的剥离的区域的照片，测定细胞间距离。此外，通过scionimage软件将剥离区域的面积定量。各组在8孔中实施，通过学生t检验进行差异显著性检验，将p<0.05判定为统计学上显著。

调查了htrop-2抗体对浸润至划痕区域的细胞的运动能力的效果。与细胞增殖抑制检测同样地对具有药效的抗体进行评价。评价方法：拍摄0天(抗体添加时)以及1天(经过24小时后)的细胞，对迁移距离(μm)以及划痕区域的面积进行图像解析。结果如图10所示，细胞的运动能力可见到明显差异。与对照相比，本试验中使用的t6-16以及k5-70均可观察到显著的增殖抑制，再现性试验中也能够确认同样的倾向。特别是，t6-16的情况下p<0.01(利用学生t检验)，可确认与体内试验的相关性。

〔实施例15〕

[利用荷瘤小鼠进行的、抗htrop-2单克隆抗体的药效评价]

预防模型

通过胰蛋白酶处理来剥离表达htrop-2的胰癌细胞株(pk-59、bxpc-3)，用pbs制备出1×10⁸个细胞/ml的细胞悬浮液，在冰上与等量的matrigel(bdpharmingen)混合。在6周龄的雌性裸小鼠(balb/c、nu/nu)的右胁腹的皮下用26g的注射器注射100μl(5×10⁶个细胞)。在癌细胞移植当天(1天)，将小鼠分组，开始投与抗体(1、5、或10mg/kg体重，腹腔内投与)。之后，按3天1次的间隔进行同样的投与。根据肿瘤形成频率和肿瘤体积评价抗肿瘤活性。肿瘤体积的测量采用以下计算式。

肿瘤体积(mm³)＝(短径)²×(长径)×π/6

治疗模型

通过胰蛋白酶处理来剥离表达htrop-2的胰癌细胞株(pk-59、bxpc-3)，用pbs制备出1×10⁸个细胞/ml的细胞悬浮液，在冰上与等量的matrigel(bdpharmingen)混合。在6周龄的雌性裸小鼠(balb/c、nu/nu)的右胁腹的皮下用26g的注射器注射100μl(5×10⁶个细胞)。癌细胞移植5～6天后，将肿瘤体积生长到50～150mm³(平均值约为100mm³)的小鼠分组，将分组的当天作为第1天(1天)，开始投与抗体。抗体按3天1次的间隔进行腹腔内投与(10mg/kg体重)。通过测量肿瘤体积评价抗肿瘤活性。差异显著性检验用学生t检验(student’st检验)进行，将p<0.05判定为统计学上显著。

〔实施例16〕

[人胰癌细胞异种移植模型中的、抗htrop-2单克隆抗体的体内抗肿瘤活性的研究]

以htrop-2为靶标的癌治疗用抗体在异种移植治疗模型中必须显示出使表达htrop-2的肿瘤组织特异性死亡或抑制肿瘤生长的活性。

通过胰癌细胞株pk-59细胞的异种移植治疗模型对本发明中新制作的抗htrop-2单克隆抗体(约160克隆)进行评价。pk-59细胞表达作为胰脏癌干细胞标志的epcam(图11a)(chenweili，etal.cancerres2007；67：(3).1030-1037)，在细胞表面表达与耐药性相关的作为abc转运蛋白的p-糖蛋白/mdr1(图11b)，abcg2/cdw338(图11c)(chen,c.j.etal.cell47(3)，381-389(1986)，allikmets,r.，etal.hum.mol.genet.5(10)，1649-1655(1996)。此外，包含胰脏癌干细胞特征性的cd24和cd44共阳性的细胞组分(8.93％)(图11d)，推测其为恶性程度高的人胰脏癌细胞株(chenweili，etal.cancerres2007；67：(3).1030-1037、janee.visvaderandgeoffreyj.lindeman.natrevcancer.vol.8(10)：755-68，2008)。

新制作的约160克隆中，大部分克隆在pk-59细胞异种移植治疗模型中不显示药效，其中也获得了显示显著的肿瘤生长抑制活性的以下克隆，即克隆k5-70、t6-16、k5-107、t5-86及k5-116-2-1。

克隆k5-70(小鼠igg2a)投与组中，肿瘤生长速度在统计学上显著受到抑制，投与开始后第21天(21天)，对照组(n＝14)的肿瘤体积为1200.8±377.3mm³，与此相对，克隆k5-70投与组则为748.7±175.0mm³(p<0.01，利用学生t检验)(图12a)。设抗体投与开始时刻的肿瘤体积为1.0，第21天(21天)的肿瘤体积方面，对照组为12.5，与此相对，克隆k5-70投与组为7.8(图12a)。摘出的肿瘤重量方面，对照组为0.73±0.26g，与此相对，克隆k5-70投与组则为0.43±0.14g(p<0.01，利用学生t检验)，显示约60％的抑制(图12b)。

同样地，克隆k5-107(小鼠igg1)投与组(n＝8)、克隆t6-16(小鼠igg2a)投与组(n＝8)、克隆t5-86(小鼠igg1)及克隆k5-116-2-1(小鼠igg2a)投与组(n＝8)中，肿瘤生长速度在统计学上也显著受到抑制。投与开始后第17天(17天)，对照组(n＝8)的肿瘤体积为1039.3±271.6mm³，与此相对，克隆k5-107投与组(n＝8)以及克隆t6-16投与组(n＝8)分别为698.2±175.9mm³(p<0.05，利用学生t检验)、707.2±254.5mm³(p<0.05，利用学生t检验)。同样地，投与开始后第16天(16天)，对照组(n＝8)的肿瘤体积为797.0±172.9mm³，与此相对，克隆k5-116-2-1投与组(n＝8)为508.5±225.2mm³(p<0.05，利用学生t检验)(图13)。

另一方面，关于克隆t5-86，投与开始后第15天(15天)，对照组(n＝8)的肿瘤体积为1033.2±319.4mm³，与此相对，克隆t5-86投与组(n＝8)则为744.1±289.1mm³，虽然肿瘤体积的比较并无显著差异，但同天的肿瘤重量比较中，对照组为0.62±0.14g，与此相对，克隆t5-86投与组则为0.44±0.13g(p<0.05，利用学生t检验)，显示出显著的抑制。

此外，下述表2中分别示出各克隆抗体投与组的实验最后一天的肿瘤体积以及肿瘤重量与对照组的比例(t/c)。如表2所示，各克隆抗体投与组分别获得t/c＝62～72％的显著的抑制。

表2

^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.01(利用学生t检验)

此外，分别研究了克隆k5-70、克隆t6-16、克隆k5-116-2-1在胰癌细胞株pk-59细胞的异种移植预防模型中的抗肿瘤活性。就各个克隆而言，抗体投与后所有个体中(n＝8)肿瘤生长均受到抑制，投与开始后第18天(18天)，对照组(n＝8)的肿瘤体积为880.8±206.4mm³，与此相对，克隆k5-70投与组(10mg/kg体重)为62.4±80.4mm³(p<0.01，利用学生t检验)，显示92.9％的肿瘤生长抑制活性；投与开始后第28天(28天)，对照组(n＝8)的肿瘤体积为992.3±250.8mm³，与此相对，克隆t6-16投与组(10mg/kg体重)为152.14±122.3mm³(p<0.01，利用学生t检验)，显示84.6％的肿瘤生长抑制活性；投与开始后第20天(20天)，对照组(n＝8)的肿瘤体积为1159.4±413.3mm³，与此相对，克隆k5-116-2-1投与组(10mg/kg体重)为207.7±319.2mm³(p<0.01，利用学生t检验)，显示82.1％的肿瘤生长抑制活性(图14，表3)。此外，所有的实验中，在对照组和抗htrop-2抗体投与组之间，整个试验期间平均体重的变化方面无显著差异。

下述表3分别示出各克隆抗体投与组的、实验最后一天的肿瘤体积以及肿瘤重量与对照组的比例(t/c)。如表3所示，各克隆抗体投与组可观察到显著的肿瘤生长抑制，特别是克隆k5-70投与组确认到t/c＝10％以下的显著效果。

表3

^＊＊p＜0.01(利用学生t检验)

公知的抗trop-2抗体ar47a6.4.2(美国专利第7420041号)虽然在使用各种人癌细胞株时以20mg/kg的投与量在异种移植预防模型中显示出肿瘤生长抑制效果，且在人胰脏癌细胞株pl45细胞时几乎100％抑制肿瘤生长，但在胰脏癌细胞株bxpc-3中为约50％、在前列腺癌细胞株pc-3中为约40％、在乳腺癌细胞株mcf-7中为约60％、在大肠癌细胞株colo205中为约40％的肿瘤生长抑制效果，与此相对，本申请发明的抗htrop-2抗体以一半投与量(10mg/kg体重)发挥了更强的肿瘤生长抑制效果。

〔实施例17〕

[人胰癌细胞株bxpc-3细胞的异种移植模型(预防模型以及治疗模型)中的抗肿瘤活性的研究]

与上述使用人胰癌细胞株pk-59细胞的异种移植治疗模型时同样地，研究克隆k5-70在人胰癌细胞株bxpc-3细胞的异种移植预防模型及异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性。

克隆k5-70投与组(n＝8)中，与对照组(n＝8)相比，肿瘤生长显著受到抑制，第52天(52天)，对照组(n＝8)的肿瘤体积为616.3±266.8mm³，与此相对，克隆k5-70投与组(n＝8)则为236.0±136.4mm³，显示61.7％的肿瘤生长抑制效果(p<0.01，利用学生t检验)(图15)。

由以上结果可以明确，抗htrop-2单克隆抗体对至少2种以上的多种癌细胞种类在体内显示显著的肿瘤生长抑制活性。

〔实施例18〕

[抗htrop2抗体(克隆k5-70)在表达htrop2的胰癌细胞株(pk-59细胞)异种移植预防模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性]

为了更详细地研究抗htrop-2抗体在体内的肿瘤生长抑制活性，进行了用量依赖性试验。如图16所示，可以明确的是，pk-59细胞的肿瘤生长通过投与k5-70抗体而用量依赖性地受到抑制，抗体投与后第21天(21天)，对照组(n＝8)的肿瘤体积为937.8±295.3mm³，与此相对，k5-70抗体(1mg/kg体重)投与组(n＝8)为493.5±305.1mm³，显示50％的抑制率，k5-70抗体(5mg/kg体重)投与组(n＝8)为124.7±89.0mm³，显示出90％的抑制效果，与公知的抗trop-2抗体ar47a6.4.2(美国专利第7420041号)相比，以20分之1的投与量显示出几乎同等的在体内的肿瘤生长抑制效果，以4分之1的投与量显示出更高的90％的抑制效果。

〔实施例19〕

[表位分析]

人/小鼠嵌合trop-2蛋白的制作

使用pcr法制作了人/小鼠嵌合trop-2基因。基于人trop-2基因序列以及小鼠trop-2基因序列(genbank登录号no.nm020047)，设计了以下所示的pcr引物。

人/小鼠trop-2-c引物

y606(正向侧)：5’-cctgagcctacgctgcgacgaagtggtgcg-3’(序列号10)

y607(反向侧)：5’-cgcaccacttcgtcgcagcgtaggctcagg-3’(序列号11)

人/小鼠trop-2-a引物

y612(正向侧)：5’-gactgctccacgctgacttccaagtgcctg-3’(序列号12)

y613(反向侧)：5’-caggcacttggaagtcagcgtggagcagtc-3’(序列号13)

人/小鼠trop-2-b引物

y614(正向侧)：5’-ctcgtggacaacgatggcctctacgacccg-3’(序列号14)

y615(反向侧)：5’-cgggtcgtagaggccatcgttgtccacgag-3’(序列号15)

小鼠/人trop-2-d引物

y608(正向侧)：5’-ccaaagcctgcgctgcgatgagctggtgcgc-3’(序列号16)

y609(反向侧)：5’-gcgcaccagctcatcgcagcgcaggctttgg-3’(序列号17)

小鼠/人trop-2-e引物

y616(正向侧)：5’-agcttcctatccgcggtgcactacgagcag-3’(序列号18)

y617(反向侧)：5’-ctgctcgtagtgcaccgcggataggaagct-3’(序列号19)

小鼠/人trop-2-f引物

y618(正向侧)：5’-gacattaaaggcgagtctctattccagggc-3’(序列号20)

y619(反向侧)：5’-gccctggaatagagactcgcctttaatgtc-3’(序列号21)

小鼠trop-2引物

正向侧：5-ctactccaccccaccctggcg-3’(序列号22)

反向侧：5’-ctcgagcaagctaggttcgcttctc-3’(序列号23)

在小鼠trop-2反向侧引物中去掉终止密码子，添加xhoi的限制酶消化序列。所制作的人/小鼠嵌合trop-2蛋白的示意图如图17所示。

hmtrop-2-a嵌合蛋白是从htrop-2蛋白的n末端起至第69位的多肽和从小鼠trop-2蛋白的第64位起至c末端的多肽所构成的嵌合蛋白。hmtrop2-b嵌合蛋白是从htrop-2蛋白的n末端起至第101位的多肽和从小鼠trop-2蛋白的第96位起至c末端的多肽所构成的嵌合蛋白。hmtrop2-c嵌合蛋白为从htrop-2蛋白的n末端起至第145位的多肽和从小鼠trop-2蛋白的第140位起至c末端的多肽所构成的嵌合蛋白。mhtrop-2-d嵌合蛋白是从小鼠trop-2蛋白的n末端起至第139位的多肽和从htrop-2蛋白的第146位起至c末端的多肽所构成的嵌合蛋白。mhtrop-2-e嵌合蛋白是从小鼠trop-2蛋白的n末端起至第187位的多肽和从htrop-2蛋白的第194位起至c末端的多肽所构成的嵌合蛋白。mhtrop-2-f嵌合蛋白是从小鼠trop-2蛋白的n末端起至第227位的多肽和从htrop-2蛋白的234位起至c末端的多肽所构成的嵌合蛋白。

用于制作上述嵌合蛋白的表达载体具体通过以下方法构建。为了制作hmtrop-2-a嵌合基因，以htrop-2基因为模板，使用htrop-2正向侧引物及人/小鼠trop-2-a引物y613进行pcr。同样地，以小鼠trop-2基因为模板，使用人/小鼠trop-2-a引物y612及小鼠trop-2反向侧引物进行pcr。将pcr所扩增的dna片段用丙烯酰胺凝胶展开，通过目标条带的提取而回收。接下来，将所提取的2种dna片段混合作为模板，使用htrop-2正向侧引物及小鼠trop-2反向侧引物进行pcr。将pcr产物用琼脂糖凝胶电泳展开，提取目标dna片段。将所提取的dna片段克隆至pcr(注册商标)-blunt载体(invitrogen)(pcrb-hmtrop-2-a)来确认基因序列。动物细胞用表达载体如下制作：通过ecori/xhoi消化，由pcdna3.1-htrop-2-myc/his除去htrop-2基因，插入由pcrb-hmtrop-2-a制备的含有hmtrop-2-a嵌合基因的ecori/xhoi片段(pcdna3.1-hmtrop-2-a-myc/his)。此外，hmtrop-2-b(使用人trop-2正向侧引物、人/小鼠trop-2-b引物y615、人/小鼠trop-2-b引物y614及小鼠trop-2反向侧引物)、hmtrop-2-c(使用人trop-2正向侧引物、人/小鼠trop-2-c引物y607及人/小鼠trop-2-c引物y606、小鼠trop-2反向侧引物)、mhtrop-2-d(使用小鼠trop-2正向侧引物、小鼠/人trop-2-d引物y609及小鼠/人trop-2-d引物y608、人trop-2反向侧引物)、mhtrop-2-e(使用小鼠trop-2正向侧引物、小鼠/人trop-2-e引物y617及小鼠/人trop-2-e引物y616、人trop-2反向侧引物)、mhtrop-2-f(使用小鼠trop-2正向侧引物、小鼠/人trop-2-f引物y619及小鼠/人trop-2-f引物y618、人trop-2反向侧引物)也通过同样的方法制作嵌合基因、构建表达载体(pcdna3.1-hmtrop-2-b-myc/his、pcdna3.1-hmtrop-2-c-myc/his、pcdna3.1-mhtrop-2-d-myc/his、pcdna3.1-mhtrop-2-e-myc/his、pcdna3.1-mhtrop-2-f-myc/his)。

恒定表达htrop-2、人/小鼠嵌合trop-2-c、及小鼠/人嵌合trop-2-d蛋白的hek293细胞株的建立

在hek293细胞株中分别导入上述表达载体pcdna3.1-htrop-2-myc/his、pcdna3.1-hmtrop-2-c-myc/his及pcdna3.1-mhtrop-2-d-myc/his。利用抗生素g418(calbiochem)进行选择，建立恒定表达htrop-2蛋白、hmtrop-2-c嵌合蛋白以及mhtrop-2-d嵌合蛋白的hek293细胞株。

对在使用胰脏癌细胞株pk-59的异种移植治疗模型中显示药效的抗htrop-2单克隆抗体k5-70、t5-86、k5-107、t6-4、t6-16、k5-116-2-1进行了结合区域的鉴定。首先，使用恒定表达hmtrop-2-c、mhtrop-2-d的各嵌合蛋白的hek293细胞，通过facs解析研究显示药效的抗htrop-2单克隆抗体的反应性(图18)。其结果是，k5-70、k5-107、t5-86和k5-116-2-1与hmtrop-2-c反应，但与mhtrop-2-d不反应。另一方面，t6-4、t6-16抗体与mhtrop-2-d反应，但与hmtrop-2-c不反应。由此，k5-70、k5-107、t5-84及k5-116-2-1抗体的结合区域被限定在htrop-2的从n末端起至第145位的氨基酸区域，t6-4和t6-16抗体的结合区域被限定在htrop-2的从第146位的氨基酸起至c末端的区域(图18)。

进而，为了详细进行结合区域的解析，制作hmtrop-2-a、hmtrop-2-b、mhtrop-2-e及mhtrop-2-f嵌合蛋白表达用载体，研究了与显示药效的抗htrop-2单克隆抗体的反应性(图19)。使用将新制作的嵌合蛋白表达用载体导入到hek293细胞中并使其瞬时表达的细胞进行facs解析。k5-70、k5-107、t5-86及k5-116-2-1抗体与hmtrop-2-a反应，但与mhtrop-2-b不反应。显示调查的6种单克隆抗体与所有的htrop-2均反应。由此可以明确，k5-70、k5-107、t5-86及k5-116-2-1抗体的结合区域存在于htrop-2的从n末端起至第69位的氨基酸区域。此外，t6-4及t6-16抗体与mhtrop-2-e、mhtrop-2-f均不反应，因此暗示识别的是htrop-2的从第146位起至第193位的氨基酸区域。

〔实施例20〕

[免疫组化]

＜材料·方法＞

免疫组化染色中使用的正常组织阵列以及癌组织阵列如下所示。

人正常组织阵列：

human，normalorgansinduplicates(catalogno.：ab1，superbiochips)

normaltissuesmorethansinglespots(catalogno.：a103(vi)，isuabxis)

肺癌组织阵列：

humanlungcancer-metastasis-normal(catalogno.：cca3，superbiochips)

humanlungcarcinomatissuewithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-rslug03-002，shanghaioutdobiotech)

胰脏癌组织阵列：

humanpancreascarcinomatissuewithmono-pathologicaltypefrom60cases，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgpan03-001，shanghaioutdobiotech)

肝癌组织阵列：

hepatocellularcarcinoma，gradei～iiiwithnormaltissuecontrols，63casestissuearrays(catalogno.：cs03-01-002u，cybrdi)

humanlivercarcinomatissuewithmono-pathologicaltypefrom30cases，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgliv02-002，shanghaioutdobiotech)

大肠癌组织阵列：

human，colorectalcancer(catalogno.：cd3，superbiochips)

humancoloncarcinomawithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgcol03-002，shanghaioutdobiotech)

大肠癌淋巴结转移、肝转移组织阵列：

colorectal(colonandrectum)cancerwithmatchedlymphnodemetastasistissuearray，44cases/99cores，trialslide(catalogno.：co991t，biomaxus)

colorectal(colonandrectum)cancerwithmatchedlymphnodemetastasisandnormaladjacenttissuearray，43cases/99cores(catalogno.：co992，biomaxus)

coloncancertissueslivermetastasis(catalogno.：a203(iv)，isuabxis)

乳腺癌组织阵列：

human，breastcancer-metastasis-normal(catalogno.：cba3，superbiochips)

humanbreastcarcinomawithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-rpbre03-002，shanghaioutdobiotech)

胃癌组织阵列：

human，stomachcancer(catalogno.：cq1，superbiochips)

humangastriccarcinomawithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgstm03-002，shanghaioutdobiotech)

食道癌组织阵列：

human，esophaguscancer(catalogno.：cr1，superbiochips)

humanesophaguscarcinomawithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgeso03-002，shanghaioutdobiotech)

卵巢癌组织阵列：

human，ovarycancer(catalogno.：cj1，superbiochips)

前列腺癌组织阵列：

human，prostatecancer-normal(catalogno.：ca3，superbiochips)

膀胱癌组织阵列：

bladdercarcinoma/transitionalcellcarcinoma，gradei～iiiwithnormaltissuearrays(catalogno.：cc12-01-001u，cybrdi)

上述组织阵列的患者信息以及临床信息由其所附的数据表以及各公司的主页获得。

免疫组化染色法

人正常组织以及癌组织的组织阵列石蜡切片经脱石蜡处理后，在37℃下利用胃蛋白酶进行5分钟蛋白酶处理，用于使用抗htrop-2单克隆抗体的免疫染色中。以dab(3,3'-二氨基联苯胺)为底物进行显色反应后，通过苏木精进行核染色作为对比染色。

这些操作具体如下进行。石蜡包埋的切片经脱石蜡处理后，在37℃下利用胃蛋白酶(dako)进行5分钟蛋白酶处理。活化抗原后，用在甲醇中按终浓度为0.3％加入了双氧水的溶液，在室温下处理20分钟，除去内源性的过氧化物酶活性。用pbs在室温下进行2次各5分钟的洗涤，然后用含有1.5％的正常马血清(dako)的pbs溶液在室温下进行30分钟封闭，对组织中的非特异性结合部位进行封闭操作。然后，与用含有1.5％的正常马血清的pbs溶液稀释的抗htrop-2单克隆抗体克隆k5-63-17(终浓度10μg/ml)在室温下反应1小时，然后用pbs在室温下进行3次各5分钟的洗涤，然后，与用含有1.5％的正常马血清的pbs溶液稀释200倍的生物素化抗小鼠igg抗体(vector)在室温下反应30分钟。室温下用pbs进行3次各5分钟的洗涤后，按说明书所述混合vectastainabc试剂盒(vector)的试剂，制作abc复合物，使其在室温下反应30分钟。用pbs在室温下进行3次各5分钟的洗涤后，利用histofineperoxidasesubstratesimplestaindabsolution(nichireibiosciences)进行显色。确认显色后，用去离子水洗涤5分钟，用迈耶斯苏木精(meyer’shematoxylin)溶液(和光纯药)对核进行染色，然后用醇脱水，用二甲苯透明，用entellannew(merckjapan)封片。

＜结果＞

人正常组织中的htrop-2的表达

使用抗htrop-2单克隆抗体克隆k5-63-17，对人正常组织中的htrop-2的表达谱进行解析。对人正常组织组织阵列(catalogno.：ab1，superbiochips)进行脱石蜡、亲水化处理后，利用作为蛋白水解酶的胃蛋白酶进行抗原活化，通过抗htrop-2单克隆抗体克隆k5-63-17进行免疫染色(图20)。其结果是，在皮肤、食道、肾脏(皮质及髓质)、胰脏、前列腺、膀胱、扁桃腺中可观察到染色。几乎所有的染色像均显示为定位于细胞膜(图20的a、b、c、d、f、g、h)，部分细胞质中也观察到表达(图20的e、h)。另一方面，心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、骨骼肌、肺、脾脏、胸腺等没有被染色(图20的i、j)。

htrop-2在人癌组织中的表达

为了调查人癌组织中的htrop-2的表达(htrop-2的阳性率)，使用抗htrop-2单克隆抗体克隆k5-63-17进行了人各癌种的癌组织阵列的免疫染色。将癌细胞的10％以上被染色的组织切片作为htrop-2阳性。该染色结果示于表4。

表4

此外，代表染色像示于图21。在研究htrop-2的表达的癌种中，前列腺癌中阳性率最高(92.1％)，肺癌(65.4％)、食道癌(76.7％)、膀胱癌(71.2％)等中为高阳性率。阳性率最低的是肝癌，为7.61％。与正常细胞同样地，癌细胞中也观察到htrop-2强烈定位于细胞膜的染色像(图21的a～f、h、i)。此外，一部分也在细胞质中表达(图21的a、b、e、g)。

胰脏癌中的htrop-2的阳性率为41.9％。对此时的htrop-2阳性率和胰脏癌的等级(分化度)的关系进行了研究。其结果是，在等级高即低分化的胰脏癌中高频表达(表5)。

表5

〔实施例21〕

[k5-70抗体的单次投与在人胰癌细胞株pk-59异种移植预防模型中的抗肿瘤效果]

在使用人胰癌细胞株pk-59的异种移植预防模型中，以10mg/kg体重的投与量投与1次时，克隆k5-70(小鼠igg2a)的体内强抗肿瘤活性也表现出来。对照组(小鼠igg10mg/kg体重，n＝3)中，所有个体中均观察到肿瘤形成，细胞移植后第28天(28天)的肿瘤体积为781.7±74.5mm³，与此相对，癌细胞移植当天(1天)投与1次k5-70抗体的组(10mg/kg体重，n＝3)中第28天的肿瘤体积为144.4±176.9mm³(p<0.05，利用学生t检验)，显示出81.5％的肿瘤生长抑制活性(图22a)。肿瘤重量方面，第28天时，对照组为0.59±0.06g，与此相对，克隆k5-70抗体投与组则为0.07±0.10g(p<0.01，利用学生t检验))，显示出88％的抑制活性(图22b)。肿瘤体积、肿瘤重量方面，在k5-70投与组中，3个体中的2个体在1次投与10mg/kg体重时肿瘤形成完全受到抑制(图22c)。

〔实施例22〕

[抗trop-2单克隆抗体在人大肠癌细胞株sw480细胞异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性]

通过使用人大肠癌细胞株sw480的异种移植治疗模型，研究了抗htrop-2单克隆抗体(克隆k5-70，k5-116-2-1及t6-16)的抗肿瘤活性。将5×10⁶细胞的sw480细胞移植(1天)到6周龄雌性nod-scid小鼠的右胁腹皮下，在肿瘤平均体积达到100mm³的阶段进行分组(7天或10天)，从第7天或10天起以每3天1次的投与间隔开始抗体的腹腔内投与。克隆k5-70抗体的抗肿瘤活性评价、克隆k5-116-2-1抗体以及克隆t6-16抗体的抗肿瘤活性评价通过各自独立的试验来进行。k5-70抗体的抗肿瘤活性评价试验中，癌细胞移植起第44天(44天)，对照组(小鼠igg(10mg/kg体重)，n＝8)的肿瘤体积为365.4±214.6mm³，与此相对，k5-70抗体(10mg/kg体重)投与组则为27.4±29.4mm³(p<0.01，利用学生t检验)，肿瘤形成显著受到抑制(抑制率92.5％)(图23a)。肿瘤重量方面，对照组为0.11±0.07g，与此相对，k5-70抗体投与组则为0.005±0.007(g)(p<0.01，利用学生t检验)，为95.5％的抑制率(图23b)。特别是，k5-70抗体投与组中，8个体中的2个体中肿瘤形成完全受到抑制，未确认到肿瘤。

另外进行的k5-116-2-1抗体和t6-16抗体的抗肿瘤活性评价试验中，第42天时，对照组的肿瘤体积为713.8±354.5mm³(n＝8)，与此相对，k5-116-2-1抗体投与组(10mg/kg体重)为188.9±97.4mm³(n＝8，p<0.01，利用学生t检验)(图24a)，t6-16抗体投与组(10mg/kg体重)为292.8±199.7mm³(n＝8，p<0.05，利用学生t检验)(图25a)，分别为73.5％、59.0％的抑制率。肿瘤重量方面也同样，对照组为0.39±0.19g，与此相对，k5-116-2-1抗体投与组、t6-16抗体投与组则为0.10±0.07g(p<0.01，利用学生t检验)、0.17±0.14g(p<0.05，利用学生t检验)，分别显示出72.2％、56.4％的抑制率(图24b、图25b)。

〔实施例23〕

[克隆k5-70在人大肠癌细胞株sw480细胞异种移植治疗模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性]

接下来，在使用人大肠癌细胞株sw480的异种移植治疗模型中对k5-70抗体的用量依赖性的抗肿瘤活性进行了研究。将5×10⁶细胞的sw480细胞移植到6周龄雌性nod-scid小鼠的右胁腹皮下，在移植起10天后(10天)肿瘤平均体积达到100mm³的阶段，进行分组，分为对照组(小鼠igg10mg/kg体重投与组、n＝8，104.4±17.6mm³)、1mg/kg体重的k5-70抗体投与组(n＝8，104.3±16.1mm³)、5mg/kg体重的k5-70抗体投与组(n＝8，104.6±15.9mm³)、10mg/kg体重的k5-70抗体投与组(n＝8，104.8±14.9mm³)，每3天进行1次腹腔内投与。第42天时，对照组的肿瘤体积为713.8±354.5mm³，与此相对，k5-70抗体投与组中观察到用量依赖性的肿瘤形成抑制活性，1mg/kg体重投与组为485.0±207.3mm³(抑制率32.1％)，5mg/kg体重投与组为339.5±253.2mm³(抑制率52.4％)，10mg/kg体重投与组为355.4±202.8mm³(抑制率50.2％，p<0.05，利用学生t检验)(图26a)。同样地，第42天时肿瘤重量方面，对照组为0.39±0.19g，与此相对，k5-70抗体的1mg/kg体重投与组则为0.24±0.11g(抑制率37.8％)，5mg/kg体重投与组为0.17±0.14g(抑制率55.8％，p<0.05，利用学生t检验)，10mg/kg体重投与组为0.20±0.13g(抑制率47.1％)，观察到用量依赖性的抗肿瘤活性(图26b)。

〔实施例24〕

[k5-70抗体在人大肠癌细胞株sw480细胞异种移植治疗模型中的投与间隔的研究]

进而，为了研究k5-70抗体的最佳投与间隔，在使用了人大肠癌细胞株sw480的异种移植治疗模型中，对每周1次(每7天1次)投与时的抗肿瘤活性进行了研究。将5×10⁶细胞的sw480细胞移植到6周龄雌性nod-scid小鼠的右胁腹皮下，在移植起10天后(10天)肿瘤平均体积达到100mm³的阶段进行分组，分为对照组(小鼠igg10mg/kg体重、n＝8，104.42±15.1mm³)、k5-70抗体投与组(10mg/kg体重、n＝8，104.3±16.1mm³)，7天进行1次腹腔内投与。第42天时，对照组的肿瘤体积为713.8±354.5mm³，与此相对，k5-70抗体投与组(每周投与1次)为332.3±239.9mm³(抑制率55％，p<0.05，利用学生t检验)(图27a)，进而投与间隔延长为每10天1次、每2周1次时，第39天时，对照组的肿瘤体积为956.9±367.8mm³，与此相对，每10天1次的k5-70抗体投与组则为525.4±180.6mm³(抑制率45.1％，p<0.01，利用学生t检验)，每2周1次的k5-70抗体投与组则为459.4±217.6mm³(抑制率52.0％，p<0.01，利用学生t检验)(图27b)。现有技术(us7420040、us7420041)中在使用胰脏癌细胞株(bxpc-3)的异种移植治疗模型中，以20mg/kg体重每周投与抗体3次(投与间隔为2天)时，显示出抑制率为50-60％的抗肿瘤活性，与此相对，k5-70抗体以1次投与量为一半的投与量(10mg/kg体重)、且每2周1次的投与(投与间隔为13天)时显示出可以与现有技术媲美的抗肿瘤活性。因此，可以明确k50-70抗体以至少现有技术的12分之1的总投与量显示出显著的抗肿瘤活性。

〔实施例25〕

[t6-16抗体在人大肠癌细胞株sw480细胞异种移植治疗模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性]

接下来，在使用人大肠癌细胞株sw480的异种移植治疗模型中，对t6-16抗体的用量依赖性的抗肿瘤活性进行了研究。将5×10⁶细胞的sw480细胞移植到6周龄雌性nod-scid小鼠的右胁腹皮下，在移植起10天后(10天)肿瘤平均体积达到100mm³的阶段进行分组，分为对照组(小鼠igg10mg/kg体重、n＝8，105.8±9.9mm³)、1mg/kg体重的t6-16抗体投与组(n＝8，104.4±13.3mm³)、5mg/kg体重的t6-16抗体投与组(n＝8，104.7±13.0mm³)、10mg/kg体重的t6-16抗体投与组(n＝8，104.8±12.4mm³)，3天进行1次腹腔内投与。第43天时，对照组的肿瘤体积为473.5±137.0mm³，与此相对，t6-16抗体投与组中观察到用量依赖性的肿瘤形成抑制活性，1mg/kg体重投与组为397.9±97.5mm³(抑制率16.0％)，5mg/kg体重投与组为195.9±89.7mm³(抑制率58.7％，p<0.01，利用学生t检验)，10mg/kg体重投与组为190.2±56.5mm³(抑制率59.8％，p<0.01，利用学生t检验)(图28a)。同样地，第43天时，肿瘤重量方面，对照组为0.19±0.07g，与此相对，1mg/kg体重的t6-16抗体投与组则为0.20±0.08g，5mg/kg体重投与组为0.08±0.04g(抑制率57.9％，p<0.01，利用学生t检验)，10mg/kg体重投与组为0.09±0.04g(抑制率52.6％，p<0.01，利用学生t检验)，确认到用量依赖性的抗肿瘤活性(图28b)。

〔实施例26〕

[t6-16抗体在人大肠癌细胞株sw480细胞异种移植治疗模型中的投与间隔的研究]

进而，为了研究t6-16抗体的最佳投与间隔，在使用了人大肠癌细胞株sw480的异种移植治疗模型中，对每周1次(每7天1次)以及每10天1次的投与间隔时的抗肿瘤活性进行了研究。将5×10⁶细胞的sw480细胞移植到6周龄雌性nod-scid小鼠的右胁腹皮下，在移植起10天后(10天)肿瘤平均体积达到100mm³的阶段进行分组，分为对照组(小鼠igg，10mg/kg体重、n＝8，105.8±9.9mm³)、每周1次的t6-16抗体投与组(10mg/kg体重、n＝8,105.0±11.6mm³)、每10天1次的t6-16抗体投与组(10mg/kg体重、n＝5，130.8±2.4mm³)，开始投与。第43天时，对照组的肿瘤体积为473.5±137.0mm³，与此相对，每周1次的t6-16抗体投与组为243.7±65.3mm³(抑制率48.5％，p<0.01，利用学生t检验)，每10天1次的t6-16抗体投与组为297.8±54.4mm³(抑制率37.1％，p<0.05，利用学生t检验)(图29)。现有技术(us7420040，us7420041)在使用胰脏癌细胞株(bxpc-3)的异种移植治疗模型中以20mg/kg体重的投与量每周投与3次(投与间隔为2天)时显示抑制率为50-60％的抗肿瘤活性，与此相对，t6-16抗体以1次投与量为现有技术的一半用量且每10天投与1次(投与间隔为9天)时显示出显著的抗肿瘤活性。因此，可以明确t6-16抗体以至少现有技术的8分之1的总投与量显示出显著的抗肿瘤活性。

〔实施例27〕

[在人前列腺癌细胞株du-145异种移植预防模型中的抗肿瘤活性的研究]

通过使用du-145细胞(rikencellbank，rcb2143)的异种移植预防模型，对克隆k5-70的对人前列腺癌的抗肿瘤活性进行评价。将5×10⁶细胞的du-145细胞移植到6周龄的雌性裸小鼠(balb/c，nu/nu)的皮下，以移植当天作为第1天，进行分组，分为对照组(小鼠igg)(n＝8)和k5-70抗体投与组(n＝8)，从第1天起以3天1次的频率以10mg/kg体重的投与量进行腹腔内投与。第40天时，对照组的肿瘤体积为368.2±307.8mm³，与此相对，k5-70抗体投与组则为30.6±29.6mm³(p<0.05，利用学生t检验)，显示出约90％的肿瘤形成抑制活性(图30a)。肿瘤重量方面，确认到更显著的抗肿瘤活性。第40天时，对照组的肿瘤重量为0.18±0.18g，与此相对，k5-70抗体投与组中，8个个体的肿瘤全部消失，肿瘤形成完全受到抑制(图30b)。由以上结果可以明确，抗人trop-2单克隆抗体克隆k5-70对人前列腺癌显示出强抗肿瘤活性。

〔实施例28〕

[k5-70抗体在使用了人胰癌细胞株pk-59细胞的肝转移模型中的转移抑制活性]

消化器官癌的治疗中，癌转移是左右着临床上的予后的重要因子，控制转移在治疗上具有重要意义。若通过投与以trop-2为靶标的癌治疗用抗体，不仅可以抑制肿瘤形成，还可以抑制癌细胞向其它脏器的转移，则可以期待临床上的较高有用性，因此是作为癌治疗抗体所期待的特性。

trop-2已经确认在多种癌肿中表达，特别是显示出在转移灶中高表达(br.j.cancer(2008)；99：1290-1295，clin.cancerres.(2006)；12：3057-3063，mod.pathol.(2008)；21：186-191)。进而，已经报道了在对裸小鼠经脾或经胰移植导入了trop-2基因的癌细胞时，肝转移的发病率增加(wo2010/089782，molecularcancer(2010)；9：253)，显示出trop-2在癌转移过程中的重要性。但是，迄今为止，尚不存在具体表明使用以trop-2为靶标的抗体在体内具有转移抑制作用的报告。

本发明发现的抗htrop-2小鼠单克隆抗体k5-70在皮下移植了人胰脏癌细胞的异种移植模型中显示出较好治疗效果，不仅具有癌细胞的增殖抑制效果，而且体外划痕试验显示，还抑制人胰癌细胞pk-59的迁移活性(migrationability)，可以认为可能还抑制体内癌的转移。因此，使用由裸小鼠的脾脏注入pk-59细胞而引发肝转移的模型，检验抗htrop-2小鼠单克隆抗体的转移抑制效果。

在癌细胞移植前一天，将小鼠分组，按照10mg/kg体重腹腔内投与抗htrop-2单克隆抗体k5-70或对照抗体(纯化小鼠igg)。第二天，通过胰蛋白酶处理剥离内源性表达htrop-2的人胰癌细胞株(pk-59)，用pbs制备2×10⁷细胞/ml的细胞悬浮液。细胞悬浮液在至移植时为止均在冰上保管。将6～7周龄的雌性裸小鼠(balb/c，nu/nu)通过腹腔内投与戊巴比妥而麻醉，在麻醉下将左侧腹部切开10～15mm，将脾脏牵出到腹腔外，使用27g的注射器，将50μl的细胞悬浮液(1x10⁶细胞)注入脾脏内。在注入细胞4分钟后，以5-0丝线将脾门部结扎，摘出脾脏。用4-0丝线缝合所切开的腹膜，使用闭合夹(woundclips)(autoclip9mm，bectondickinson)闭合腹部。癌细胞移植7天后，进一步按照10mg/kg体重投与k5-70抗体及对照抗体。癌细胞移植起4～6周后，通过颈椎脱臼使小鼠安乐死，摘出肝脏，确认有无转移灶。

用作对照的投与小鼠igg的组中，移植pk-59细胞的6只小鼠中，4只在移植后4～6周后在肝叶边缘部确认到明显的转移灶(2～7个)(图31a，转移发生率67％，表6)。与此相对，k5-70抗体投与组中，移植了pk-59细胞的4只小鼠的全部个体均未确认到肝脏转移灶，转移发生率为0％(图31b，表6)。

表6

克隆k5-70在对裸小鼠经脾移植pk-59细胞的肝转移模型中的转移抑制效果

这些结果表明，抗htrop-2抗体k5-70对人胰癌细胞株pk-59的肝转移具有极强的抑制作用。

〔实施例29〕

[k5-70抗体在大肠癌细胞株sw480异种移植模型中的、盐酸伊立替康投与后的癌复发模型中的抗肿瘤活性]

作为癌治疗剂，近年开发出多种抑制癌细胞增殖的化疗剂，一定程度上改善了治疗效果，但存在伴有对癌细胞以外的正常细胞也有增殖抑制作用的副作用以及治疗结束后癌复发的较大问题。因此，若能够通过投与以trop-2为靶标的癌治疗用抗体来抑制化疗剂治疗后的肿瘤复发，则可以期待较高的临床上的有用性，因而这是作为癌治疗抗体所期望的特性。

作为大肠癌的治疗剂，近年临床上应用5-fu、铂制剂以及具有拓扑异构酶抑制效果的盐酸伊立替康(topotecin，第一三共株式会社)，据报道，在动物模型中，在移植了以大肠癌为首的各种人肿瘤细胞的小鼠模型中具有抗肿瘤效果(cancerchemotherpharmacol.(1991)；28(3)：192-8)。因此，在使用了人大肠癌细胞株sw480的异种移植模型中，研究了抗htrop-2抗体克隆k5-70(小鼠igg2a)对于投与盐酸伊立替康后的肿瘤复发的复发予防效果。将5×10⁶细胞的sw480细胞移植到8周龄雌性nod-scid小鼠的右胁腹皮下，在移植起11天后(11天)肿瘤平均体积达到100mm³以上的阶段进行分组，分为无处置组(生理盐水投与组、n＝8，130.7±16.2mm³)、盐酸伊立替康(cpt-11，topotecin、第一三共株式会社)投与组(n＝16，123.0±21.4mm³)，以40mg/kg体重每3天腹腔内投与1次盐酸伊立替康，合计3次(11，14，17天)。在盐酸伊立替康的最后一次投与起第3天(20天)，无处置组的肿瘤体积达到232.1±21.1mm³，与此相对，盐酸伊立替康投与组为126.6±26.6mm³(p<0.01，利用学生t检验)，确认到明显的肿瘤抑制效果。在该阶段，基于肿瘤大小而将盐酸伊立替康投与组分为2组，一组为k5-70抗体投与组(10mg/kg体重，n＝8，第20天的肿瘤体积126.0±28.0mm³)，另一组为小鼠igg投与组(10mg/kg体重、n＝8，第20天的肿瘤体积127.2±27.0mm³)。分别进行每3天1次的腹腔内抗体投与和肿瘤体积的测定，对肿瘤的复发进行评价(图32)。小鼠igg投与组中，从盐酸伊立替康的最后一次投与起第18天(35天)开始，确认存在多个具有肿瘤体积超过300mm³的明显复发肿瘤的个体，在盐酸伊立替康的最后一次投与起第30天(47天)时，8例中的5例中确认到超过300mm³的肿瘤(肿瘤平均体积401.7±172.7mm³)。与此相对，k5-70抗体投与组中，肿瘤复发显著受到抑制，肿瘤平均体积为180.5±142.1mm³(p<0.05，利用学生t检验)(图32)。特别是，k5-70抗体投与组中，确认到8例中有4例个体在第47天的肿瘤体积与分组时(126.0±28.0mm³)相比萎缩，小于100mm³。这些结果表明，抗htrop-2抗体k5-70对盐酸伊立替康投与后的肿瘤复发具有极强抑制作用。

〔实施例30〕

[使用了clips技术的表位作图]

＜材料和方法＞

肽合成

通过利用fmoc(9-芴甲氧羰基)法的固相合成获得了本实验中使用的直链型15-mer及30-mer的来自trop-2细胞外区域的肽。此外，为了进行不连续表位解析，合成了在两端添加了半胱氨酸残基的来自trop-2细胞外区域的17-mer的肽，通过clips技术(chemicallylinkedpeptidesonscaffoldstechnology)，再构建了具有1个或2个环结构的立体结构。添加的半胱氨酸残基附近存在其它半胱氨酸残基时，将其置换为丙氨酸。

表位筛选elisa

使5034种合成肽共价结合到pepscan片(445肽/片)，通过elisa法检验合成肽和抗体的结合。对于pepscan片而言，与用封闭缓冲液(含有4％马血清、5％卵白白蛋白、1％tween的磷酸缓冲液)稀释至1μg/ml的抗人trop-2单克隆抗体(k5-70、k5-107、k5-116-2-1、t5-86、t6-16)反应。洗涤后，与1000倍稀释的过氧化物酶-二抗复合物在25℃下反应1小时。洗涤后，加入底物溶液(含有2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)和2μl的3％双氧水的溶液)，进行1小时显色反应。通过ccd相机拍摄并进行图像解析而对抗体结合活性进行定量。

<结果>

对于显示药效的抗htrop-2单克隆抗体k5-70、k5-107、k5-116-2-1、t5-86、t6-16，利用clips(chemicallylinkedpeptidesonscaffolds)技术进行表位解析。予以说明，下面，本实施例中“氨基酸号”是指序列号2所示的氨基酸序列(htrop-2蛋白(323氨基酸残基))中的氨基酸号。

k5-70抗体的解析结果如下述表7所示。该结果表明33个肽与k5-70抗体强烈结合。上述33个肽中，含有vcspdgpggrcqcralgsgmavd(氨基酸号43-65)的序列(表7中记载的肽no.1-7、9)、含有hhilidlrhrptag(氨基酸号152-165)的序列(表7中记载的肽no.14、22-24、28)、含有vhyeqptiqielrq(氨基酸号193-206)的序列(表7中记载的肽no.8、10、12、13、18、20、21、23、26、28、30、32)、含有dldaelrrlfrer(氨基酸号171-183)的序列(表7中记载的肽no.11、16、18、19、21、22、29、31)反复出现。k5-70抗体尤其与含有vcspdgpggrcqcralgsgmavd的序列强烈结合。这些结果暗示，htrop-2蛋白中的上述4种肽序列区域可能为k5-70抗体的表位。

表7

k5-70抗体对来自于人trop-2细胞外区域的clips肽的结合

k5-107的解析结果如下述表8所示。其结果是，含有vcspdgpggrcqcralgsgmavd(氨基酸号43-65)的序列包含在20个肽中的10个肽(表8中记载的肽no.1-6、8、9、14、17)中(表8)。

因此表明，htrop-2蛋白中的上述vcspdgpggrcqcralgsgmavd的肽序列区域为k5-107抗体的表位。

表8

k5-107抗体对来自于人trop-2细胞外区域的clips肽的结合

k5-116-2-1抗体的解析结果如下述表9所示。该解析中，含有vcspdgpggrcqcralgsgmavd(氨基酸号43-65)的序列(表9中记载的肽no.1-7、15、25)、含有hhilidlrhrptag(氨基酸号152-165)的序列(表9中的肽no.8-11、16、17、19、20、22-24、27-29)、含有dldaelrrlfrer(氨基酸号171-183)的序列(表9中记载的肽no.11-14、17、19、21、23、29)这3种肽序列多次出现(表9)。因此表明，htrop-2蛋白中的这3种肽序列区域为k5-116-2-1抗体的表位。

表9

k5-116-2-1抗体对来自于人trop-2细胞外区域的clips肤的结合

t5-86及t6-16抗体的解析结果如下述表10及表11所示。该解析中，与含有dpegrfkarqcn(氨基酸号109-120)的序列的肽强烈结合。与t5-86抗体结合的26个肽中的22个肽(表10中记载的肽no.1-4、6-8、10-13、15-19、21-26)中包含上述肽序列，与t6-16抗体结合的26个肽中的4个肽(表11中的肽no.1，2，9，13)包含上述肽序列(表10及表11)。此外，t5-86抗体的解析中，除了包含dpegrfkarqcn(氨基酸号109-120)的序列以外，含有vcspdgpggrcqcra(氨基酸号43-57)的序列(表10中记载的肽no.5、14、20)多次出现。进而，t6-16抗体的解析中，多次确认到另一序列、即含有hhilidlrhrptag(氨基酸号152-165)的序列(表11中记载的肽no.4-8、10-12、19、21、23、25、26)。因此表明，t5-86抗体的表位为htrop-2蛋白中的dpegrfkarqcn(氨基酸号109-120)、vcspdgpggrcqcra(氨基酸号43-57)这2种肽序列区域，t6-16抗体的表位为htrop-2蛋白中的dpegrfkarqcn(氨基酸号109-120)、hhilidlrhrptag(氨基酸号152-165)这2种肽序列区域。

表10

t5-86抗体对来自于人trop-2细胞外区域的clips肽的结合

表11

t6-16抗体对来自于人trop-2细胞外区域的clips肤的结合

〔实施例31〕

[小鼠抗htrop-2抗体(克隆k5-70、k5-107、k5-116-2-1及t6-16)的抗体基因的可变区的序列确定]

使用trizol试剂(invitrogen)，由3×10⁶个小鼠抗trop-2单克隆抗体产生杂交瘤提取总rna。对克隆k5-70、克隆k5-107和克隆k5-116-2-1使用smarter^tmracecdnaamplificationkit(clontech)，按照试剂盒所附方法，使用小鼠igg的h链特异性引物(5’-tccakagttcca-3’(序列号24))和l链特异性引物(5’-gctgtcctgatc-3’(序列号25))合成cdna。对于克隆t6-16，使用generacerkit(invitrogen)，按照试剂盒所附方法，使用寡dt引物合成cdna。编码克隆k5-70(小鼠igg2a)、克隆k5-107(小鼠igg1)、以及克隆k5-116-2-1(小鼠igg2a)的h链及l链的可变区(vh、vl)的基因则以上述合成后的cdna为模板使用pcr法进行克隆。此时，5’-引物使用的是smarter^tmracecdnaamplificationkit附带的10×universalprimeramix(upm)。另一方面，就3’-引物而言，作为vh扩增用3’-引物，使用具有小鼠iggh链特异性序列的引物，作为vl扩增用3’-引物，使用具有小鼠iggl链特异性的序列的引物。

5’-引物(10×universalprimeramix(upm))：

long(0.4μm)

5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′(序列号26)

short(2μm)

5’-ctaatacgactcactatagggc-3’(序列号27)

3’-引物(r引物)：

vh：5’-gggaartartarcccttgaccaggca-3’(序列号28)

5’-gggaartagcctttgacaaggca-3’(序列号29)

vl：5’-cactgccatcaatvctccacttgaca-3’(序列号30)

使用了上述各引物的pcr按照以下反应液组成及反应条件进行。此外，vh的cdna扩增的r引物使用的是等摩尔混合上述2序列的混合物。

<反应液组成>

<反应条件>

94℃(10秒)反应后，以“热变性·解离：98℃(10秒)→退火：60℃(5秒)→合成·伸长：72℃(60秒)”作为一个循环，进行共30个循环的反应后，最后在72℃(3分钟)反应。

将合成的vh及vl的cdna亚克隆到pmd20-t载体(宝生物)，确定碱基序列。解读多个vh克隆及vl克隆的碱基序列，鉴定了小鼠h链及l链的可变区中典型的碱基序列。图33及图34中示意出k5-70的vh及vl的共通(consensus)cdna碱基序列以及推定氨基酸序列。图35及图36中示意出k5-107的vh及vl的共通cdna碱基序列以及推定氨基酸序列。图37及图38中示意出k5-116-2-1的vh及vl的共通cdna碱基序列以及推定氨基酸序列。

编码克隆t6-16的h链及l链的可变区(vh、vl)的基因则以上述合成后的cdna为模板使用pcr法进行克隆。此时，5’-引物使用了generacerkit附带的引物。另一方面，就3’-引物而言，作为vh扩增用3’-引物，使用具有小鼠iggh链特异性序列的引物，作为vl扩增用3’-引物，使用具有小鼠iggl链特异性序列的引物。

5’-引物(f引物)：

5’-cgactggagcacgaggacactga-3’(序列号31)

3’-引物(r引物)：

vh：5’-gccagtggatagacagatgg-3’(序列号32)

vl：5’-gatggatacagttggtgcagc-3’(序列号33)

使用了上述各引物的pcr按照以下的反应液组成及反应条件进行。

＜反应液组成＞

<反应条件>

以“热变性·解离：98℃(10秒)→退火：57℃(10秒)→合成·伸长：72℃(60秒)”为1个循环，进行共35个循环。

将合成的vh及vl的cdna亚克隆到pcr4blunt-topovector(invitrogen)，确定碱基序列。解读多个vh克隆及vl克隆的碱基序列，鉴定了小鼠h链及l链的可变区中典型的碱基序列。图39及图40中示意出t6-16的vh及vl的共通cdna碱基序列以及推定氨基酸序列。

〔实施例32〕

[人源化k5-70抗体的设计]

对于之前的实施例中制作的k5-70抗体，按照queen等的方法(proc.natl.acad.sci.usa86：10029-10033，1989)如下进行其可变区(vh、vl)的人源化。首先，利用计算机进行k5-70抗体可变区的立体结构的分子建模，然后，通过与人抗体基因的可变区序列的同源性检索，选择genbank登录号为da980102的cdna序列(da980102vh)作为提供k5-70vh的人源化所需的框架(fr)区的接纳体(genomeres.16:55-65,2006)。同样地，选择genbank登录号为l41174的cdna序列(l41174vl)作为提供k5-70vl的人源化所需的框架(fr)区的接纳体(j.biol.chem.270:12457-12465,1995)。

在k5-70vh的人源化中，将k5-70vh的cdr序列置换插入作为接纳体的da980102vh的对应位置。通过利用计算机建模进行的立体结构解析，对于与k5-70vh的cdr相邻、被认为对其结构维持起到重要作用的氨基酸残基(第48位的异亮氨酸(i)、第66位的赖氨酸(k)、第67位的丙氨酸(a)、第71位的缬氨酸(v)、第93位的苏氨酸(t))，保持k5-70vh的氨基酸残基，将除此以外的fr区置换为接纳体序列。vh及vl内的氨基酸残基位置号根据kabat等的定义(sequencesofproteinsofimmunologicalinterests,fifthedition,nihpublicationno.91-3242,u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)。

此外，认为作为接纳体序列da980102vh的第82位的氨基酸残基的蛋氨酸(m)很可能为高突变所致的特殊的氨基酸残基。因此，为了减小潜在的抗原性，作为第82位的氨基酸残基，置换为最一般的亮氨酸(l)。如上所述设计的人源化k5-70vh(huk5-70vh)、k5-70vh及da980102vh的氨基酸序列比对示于图41。

关于人源化k5-70vl的设计，也同样地进行cdr序列的移植，对于cdr的结构维持重要的氨基酸残基(第49位的赖氨酸(k))保持k5-70vl的氨基酸残基，将除此以外的fr区置换为接纳体序列(huk5-70vl)。huk5-70vl、k5-70vl及l41174vl的氨基酸序列比对示于图42。

〔实施例33〕

[人源化t6-16抗体的设计]

对于之前的实施例中制作的t6-16抗体，按照queen等的方法(proc.natl.acad.sci.usa86：10029-10033，1989)如下进行其可变区(vh、vl)的人源化。首先，利用计算机进行t6-16抗体可变区的立体结构的分子建模，然后，通过与人抗体基因的可变区序列的同源性检索，选择genbank登录号为da935238的cdna序列(da935238vh)作为提供t6-16vh的人源化所需的框架(fr)区的接纳体(genomeres.16:55-65,2006)。同样地，选择genbank登录号为m99608的cdna序列(m99608vl)作为提供t6-16vl的人源化所需的框架(fr)区的接纳体(j.immunol.149:2518-2529,1992)。

在t6-16vh的人源化中，将t6-16vh的cdr序列置换插入作为接纳体的da935238vh的对应位置。通过利用计算机建模进行的立体结构解析，对于与t6-16vh的cdr相邻、被认为对其结构维持起到重要作用的氨基酸残基(第48位的异亮氨酸(i)、第67位的丙氨酸(a)、第73位的赖氨酸(k))，保持t6-16vh的氨基酸残基，将除此以外的fr区置换为接纳体序列(hut6-16vh1)。此外，关于第73位的赖氨酸残基(k)，有可能对抗原结合位点的适当形成影响小，另外设计了将hut6-16vh1的赖氨酸残基置换为更宽容的氨基酸残基苏氨酸(t)的氨基酸序列(hut6-16vh2)。设计的人源化t6-16vh(hut6-16vh1及hut6-16vh2)、t6-16vh及da935238vh的氨基酸序列比对示于图43。

关于人源化t6-16vl的设计，也同样地进行cdr序列的移植。对于cdr的结构维持重要的氨基酸残基在接纳体序列中被保持，fr序列使用了与接纳体序列相同的序列(hut6-16vl)。hut6-16vl、t6-16vl及l41174vl的氨基酸序列比对示于图44。

〔实施例34〕

[人源化k5-70vh及vl基因合成]

编码huk5-70vh及huk5-70vl的基因如下制作。在如上设计的huk5-70vh及vl的n末端侧分别添加来自k5-70vh、vl的信号肽序列，基于所得到的氨基酸序列进行基因合成(operon公司)。此时，在分别合成的huk5-70vh及huk5-70vl的基因序列的5’末端侧添加kozak序列(accacc)，此外在huk5-70vh的5’末端添加作为限制酶位点的ecori的位点(gaattc)，在3’末端添加nhei(gctagc)的位点。同样地，在huk5-70vl的5’末端添加作为限制酶位点的agei的位点(accggt)，在3’末端添加bsiwi的位点(cgtacg)。所合成的huk5-70vh基因及huk5-70vl基因通过ta克隆引入pcr2.1载体(invitrogen)中。通过基因合成制作的huk5-70vh及vl的基因序列分别示于图45及46。

〔实施例35〕

[人源化t6-16vh1、t6-16vh2及t6-16vl基因合成]

编码hut6-16vh1、hut6-16vh2及hut6-16vl的基因如下制作。在所设计的hut6-16vh1、hut6-16vh2的n末端侧添加来自t6-16vh的信号肽序列，在hut6-16vl的n末端侧添加来自t6-16vl的信号肽序列，基于所得到的氨基酸序列进行基因合成(operon公司)。此时，在分别合成的hut6-16vh1、hut6-16vh2及hut6-16vl的基因序列的5’末端侧添加kozak序列(accacc)，此外在hut6-16vh1及hut6-16vh2的5’末端添加作为限制酶位点的ecori的位点(gaattc)，在3’末端添加nhei的位点(gctagc)。同样地，在人源化t6-16vl的5’末端添加作为限制酶位点的agei的位点(accggt)，在3’末端添加bsiwi的位点(cgtacg)。所合成的hut6-16vh1基因和hut6-16vh2基因以及hut6-16vl基因通过ta克隆引入pcr2.1载体(invitrogen)中。

通过基因合成所制作的hut6-16vh1、hut6-16vh2及hut6-16vl的基因序列分别示于图47～49。

〔实施例36〕

[人源化k5-70vh及vl基因表达载体构建]

对于引入pcr2.1载体(invitrogen)中的huk5-70vh及vl基因，分别用限制酶ecori及nhei、agei及bsiwi消化，进行基因片段的回收。然后，所切出的huk5-70vh基因插入人igg1型的表达用的动物细胞表达载体的pfuse-chig-hg1载体(invivogen)的ecori/nhei位点(pfuse-chig-huk5-70)，huk5-70vl基因插入人igκ型表达用载体pfuse2-clig-hk载体(invivogen)的agei/bsiwi位点(pfuse2-clig-huk5-70)，分别完成构建。

〔实施例37〕

[人源化t6-16vh1、t6-16vh2及t6-16vl基因表达载体构建]

对于引入pcr2.1载体(invitrogen)中的t6-16vh1、t6-16vh2基因，利用限制酶ecori及nhei消化，t6-16vl基因用agei及bsiwi消化，进行基因片段的回收。然后，所切出的t6-16vh1基因插入pfuse-chig-hg1载体(invivogen)的ecori/nhei位点(pfuse-chig-hut6-16-1)，t6-16vh2基因也同样地插入pfuse-chig-hg1载体(invivogen)的ecori/nhei位点(pfuse-chig-hut6-16-2)，t6-16vl基因插入pfuse2-clig-hk载体(invivogen)的agei/bsiwi位点(pfuse2-clig-hut6-16)，分别完成构建。

〔实施例38〕

[稳定表达huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的293f细胞株的建立]

在freestyle293expressionmedium(invitrogen)中维持、培养293f细胞(invitrogen)。向293f细胞的基因导入使用293fectin试剂(invitrogen)、根据所附的方案进行。将pfuse-chig-huk5-70和pfuse2-clig-huk5-70均导入293f细胞中，利用博莱霉素(zeocin)(invivogen)和杀稻瘟菌素(blasticidin)(invivogen)进行药剂筛选，由此建立稳定表达huk5-70抗体的细胞株。同样地，将pfuse-chig-hut6-16-1和pfuse2-clig-hut6-16均导入293f细胞，进行上述药剂筛选，由此建立稳定表达hut6-16-1抗体的细胞株。此外，同样地将pfuse-chig-hut6-16-2和pfuse2-clig-hut6-16导入293f细胞，进行上述药剂筛选，由此建立稳定表达hut6-16-2抗体的细胞株。

〔实施例39〕

[huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体蛋白的纯化]

所建立的各抗体表达细胞株按照1～2.5x10⁵细胞/ml接种到freestyle293表达培养基(invitrogen)中，进行滚瓶培养6～8天。回收培养上清后，使用rproteinasepharosefastflow(gehealthcare)根据常规方法进行各人源化抗体的纯化。

图50示出利用蛋白印迹法确认了表达huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的293f细胞的培养上清中的各人源化抗体蛋白的表达的图。具体而言，进行sds-page后，转印到pvdf膜(immobilon-p,millipore,ipvh00010)上。对于膜，使用含有5％脱脂乳的tbs(tris-bufferedsaline)在室温下进行30分钟封闭。用0.1％tbst(含有0.1％tween20的tbs)以5分钟各洗涤3次后，与一抗进行反应。

条带1表示未进行基因导入的293f细胞的培养上清(阴性对照)，条带2表示导入了pfuse-chig-huk5-70和pfuse2-clig-huk5-70的293f细胞的培养上清。huk5-70抗体的重链及轻链蛋白的检测使用生物素标记的抗人iggf(ab’)²抗体(rockland)。条带3表示在293f细胞中导入了pfuse-chig-hut6-16-1及pfuse2-clig-hut6-16的293f细胞的上清，条带4表示导入了pfuse-chig-hut6-16-2及pfuse2-clig-hut6-16的293f细胞的上清，hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的重链蛋白用生物素标记的抗人iggfc抗体(rockland)检测，hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的轻链蛋白用生物素标记的抗人iggf(ab’)²抗体(rockland)检测。

其结果为，huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体均在重链及轻链蛋白的培养上清中确认了表达。

此外，图51表示将纯化的huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体用sds-page展开后进行了cbb染色的图。在还原条件下，均检测到约50kd的重链和约25kd的轻链，在与利用上述蛋白印迹法检测出的各重链及轻链相同的位置确认了条带。由以上结果确认了huk5-70抗体蛋白、hut6-16-1抗体蛋白及hut6-16-2抗体蛋白的产生。

〔实施例40〕

[人源化k5-70抗体(huk5-70)及人源化t6-16抗体(hut6-16-1,hut6-16-2)的抗原亲和性]

通过facs和使用了elisa的方法对纯化的huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体的抗原亲和性进行了研究。

facs使用实施例5中记载的使hek293细胞稳定表达人全长trop-2基因的hek293-htrop-2细胞和在细胞表面内源性表达人trop-2蛋白的胰脏癌细胞株pk-59进行。对于通过胰蛋白酶处理由培养皿剥离的细胞(hek293-htrop-2细胞或pk-59细胞)的悬浮液(5x10⁵细胞)，加入用含有10％fcs的培养基稀释成1μg/ml的抗体溶液100μl作为一抗，在4℃温育20分钟。然后，用1ml的含有10％fcs的培养基洗涤，加入将藻红蛋白(pe)标记抗小鼠igg抗体(bdpharmingen)及生物素标记抗人iggfc抗体(rockland)分别稀释200倍、2000倍的二抗溶液100μl。在4℃温育20分钟后，再次用1ml的含有10％fcs的培养基进行洗涤。在使用生物素标记抗人iggfc抗体作为二抗时，作为萤光标记试剂加入将链霉亲和素标记pe(bdpharmingen)稀释400倍的标记溶液100μl，在4℃温育20分钟后，用1ml的含有10％fcs的培养基进行洗涤。然后，含有标记细胞的样品悬浮于1ml的含有1％fcs、2mmedta的pbs中，使用facscalibur(bectondickinson)进行解析。其结果是，在hek293-htrop-2细胞中、在pk-59细胞中，huk5-70抗体均显示出与小鼠k5-70抗体同等的反应性。同样地，hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体也显示出与t6-16抗体同等的反应性(图52)。

进一步利用elisa法对抗原亲和性进行了验证。elisa使用将实施例3所示的htrop-2细胞外区域的重组蛋白固相化的elisa板进行。具体而言，对于96孔板(bdfalcon)，以50μl/孔用以pbs稀释为0.5μg/ml的htrop-2细胞外区域的重组蛋白进行包覆(4℃、一晩)。用洗涤缓冲液(含有0.05％tween20的pbs)洗涤后，以200μl/孔添加封闭缓冲液(含有2％脱脂乳、0.05％tween20的pbs)进行封闭(室温、1小时)。用洗涤缓冲液洗涤后，对于huk5-70抗体、hut6-16-1抗体、hut6-16-2抗体、k5-70抗体及t6-16抗体，用elisa缓冲液(含有1％脱脂乳、0.025％tween20的pbs)在3.05x10^-4～5μg/ml的范围制备2倍稀释系列样品，按照各50μl/孔进行添加(室温、2小时)。用洗涤缓冲液洗涤后，作为检测用抗体，以50μl/孔添加用elisa缓冲液稀释2000倍的hrp标记山羊抗人κ链抗体(southernbiotech)或者稀释2000倍的hrp标记绵羊抗小鼠igg抗体(gehealthcare)(室温、1小时)。用洗涤缓冲液洗涤后，以50μl/孔添加tmb(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、sigma)作为底物溶液，进行显色反应。以25μl/孔加入1m硫酸使反应停止后，使用酶标仪model550(biorad)，将655nm的吸光度作为参照来测定450nm的吸光度。其结果是，k5-70和huk5-70的反应曲线几乎重叠，ec50分别为27ng/ml、22ng/ml(图53)。同样地，t6-16、hut6-16-1及hut6-16-2的反应曲线也几乎重叠，ec50分别为30ng/ml、27ng/ml、27ng/ml(图54)。由这些结果可以明确，huk5-70抗体、hut6-16-1抗体及hut6-16-2抗体分别显示出与人源化前的母源抗体k5-70或t6-16抗体同等的抗原亲和性。

〔实施例41〕

[人源化抗htrop-2抗体(huk5-70)的体内的抗肿瘤活性]

然后，在使用在细胞表面内源性表达人trop-2的人大肠癌细胞株sw480的异种移植治疗模型中研究了huk5-70抗体的体内的抗肿瘤活性。将5×10⁶细胞的sw480细胞移植到7周龄雌性nod-scid小鼠的右胁腹皮下(1天)，在肿瘤平均体积达到100mm³的阶段进行分组(9天)，从第9天起按每3天1次的投与间隔开始抗体的腹腔内投与。癌细胞移植后第39天(day39)的对照组(投与pbs，n＝8)的肿瘤体积为824.3±188.8mm³，与此相对，huk5-70抗体投与组(10mg/kg体重,n＝8)则为455.5±208.6mm³(p<0.01，利用学生t检验)，肿瘤形成受到显著抑制(抑制率44.7％)(图55a)。肿瘤重量方面，对照组为0.509±0.161g，与此相对，huk5-70抗体投与组则为0.272±0.162g(p<0.05，利用学生t检验)，为46.6％的抑制率(图55b)。

〔实施例42〕

[人源化抗htrop-2抗体(huk5-70和hut6-16-2)在人大肠癌细胞株sw480细胞异种移植治疗模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性]

在使用人大肠癌细胞株sw480的异种移植治疗模型中对huk5-70及hut6-16-2抗体的用量依赖性的抗肿瘤活性进行了研究。将5×10⁶细胞的sw480细胞移植到7周龄雌性nod-scid小鼠的右胁腹皮下(1天)，癌细胞移植后第9天(9天)在肿瘤平均体积达到100mm³的阶段进行分组，分成对照组(pbs投与组、n＝8，101.65±8.35mm³)、1mg/kg体重的huk5-70抗体投与组(n＝8，103.18±9.86mm³)、5mg/kg体重的huk5-70抗体投与组(n＝8，101.34±8.94mm³)、10mg/kg体重的huk5-70抗体投与组(n＝8，101.53±8.98mm³)、1mg/kg体重的hut6-16-2抗体投与组(n＝8，103.18±9.86mm³)、5mg/kg体重的hut6-16-2抗体投与组(n＝8，101.34±8.94mm³)、10mg/kg体重的hut6-16-2抗体投与组(n＝8，101.53±8.98mm³)，从第9天起按每3天1次的间隔进行抗体的腹腔内投与。癌细胞移植后第48天(48天)的对照组的肿瘤体积为754.67±276.05mm³，与此相对，在huk5-70抗体投与组中，1mg/kg体重投与组为521.81±183.45mm³(抑制率30.9％)，5mg/kg体重投与组为258.78±137.02mm³(抑制率65.7％,p<0.01，利用学生t检验)，10mg/kg体重投与组为314.60±152.89mm³(抑制率58.3％,p<0.01，利用学生t检验)(图56a)。在hut6-16-2抗体投与组中，1mg/kg体重投与组为600.41±319.84mm³(抑制率20.4％)，5mg/kg体重投与组为315.32±189.02mm³(抑制率58.2％,p<0.01，利用学生t检验)，10mg/kg体重投与组为270.79±266.71mm³(抑制率64.1％,p<0.01，利用学生t检验)(图57a)。第48天的肿瘤重量方面，对照组为0.422±0.201g，与此相对，在huk5-70抗体投与组中，1mg/kg体重投与组为0.301±0.160g(抑制率28.7％)，5mg/kg体重投与组为0.115±0.083g(抑制率72.7％,p<0.01，利用学生t检验)，10mg/kg体重投与组为0.244±0.181g(抑制率42.2％)(图56b)。在hut6-16-2抗体投与组中，1mg/kg体重投与组为0.422±0.255g(抑制率0％)，5mg/kg体重投与组为0.247±0.151g(抑制率41.5％)，10mg/kg体重投与组为0.190±0.190g(抑制率53.1％,p<0.01，利用学生t检验)(图57b)。由这些结果确认了huk5-70和hut6-16-2抗体的用量依赖性的抗肿瘤活性。

〔实施例43〕

[抗htrop-2小鼠单克隆抗体k5-70及t6-16在人卵巢癌细胞株sk-ov-3细胞异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性]

在使用在细胞表面内源性表达htrop-2的人卵巢癌细胞株sk-ov-3的异种移植治疗模型中对母源抗体k5-70及t6-16抗体的体内的抗肿瘤活性进行了研究。将5×10⁶细胞的sk-ov-3细胞移植到7周龄雌性裸小鼠的右胁腹皮下(1天)，癌细胞移植后第11天(11天)对确认了明确的肿瘤形成的个体(肿瘤平均体积约50mm³)进行分组，从第11天起按照每周2次的投与间隔进行抗体的腹腔内投与。癌细胞移植后第56天(56天)的对照组(投与pbs，n＝8)的肿瘤体积为652.6±349.1mm³，与此相对，k5-70抗体投与组(10mg/kg体重，n＝8)则为253.7±137.3mm³(p<0.01，利用学生t检验)，肿瘤形成受到显著抑制(抑制率61.1％)，t6-16抗体投与组(10mg/kg体重，n＝8)则为214.6±98.6mm³(p<0.01，利用学生t检验)，肿瘤形成受到显著抑制(抑制率67.1％)(图58a)。肿瘤重量方面，对照组为0.413±0.218g，与此相对，k5-70抗体投与组则为0.194±0.112(g)(p<0.05，利用学生t检验)、为53.0％的抑制率，t6-16抗体投与组则为0.183±0.093(g)(p<0.05，利用学生t检验)、为55.7％的抑制率(图58b)。

〔实施例44〕

[抗htrop-2小鼠单克隆抗体k5-70及t6-16在人乳腺癌细胞株mda-mb-468细胞异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性]

同样地，在使用在细胞表面内源性表达htrop-2的人乳腺癌细胞株mda-mb-468的异种移植治疗模型中对k5-70以及t6-16抗体的体内的抗肿瘤活性进行了研究。将5×10⁶细胞的mda-mb-468细胞移植到7周龄雌性裸小鼠的右胁腹皮下(1天)，癌细胞移植后第12天(12天)对确认了明确的肿瘤形成的个体(肿瘤平均体积约50mm³)进行分组，从第12天起按照每周2次的投与间隔进行抗体的腹腔内投与。癌细胞移植后第54天(54天)的对照组(投与pbs，n＝8)的肿瘤体积为218.6±75.5mm³，与此相对，k5-70抗体投与组(10mg/kg体重，n＝8)则为70.2±37.4mm³(p<0.01，利用学生t检验)，肿瘤形成受到显著抑制(抑制率67.9％)，t6-16抗体投与组(10mg/kg体重，n＝8)则为88.3±42.9mm³(p<0.01，利用学生t检验)，肿瘤形成受到显著抑制(抑制率59.6％)(图59a)。第54天的肿瘤重量方面，对照组为0.142±0.049g，与此相对，k5-70抗体投与组则为0.050±0.033(g)(p<0.01，利用学生t检验)、为64.8％的抑制率，t6-16抗体投与组则为0.077±0.046(g)(p<0.05，利用学生t检验)、为45.8％的抑制率(图59b)。

〔实施例45〕

[抗htrop-2小鼠单克隆抗体k5-70及t6-16在人肺癌细胞株calu-3细胞异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性]

同样地，在使用在细胞表面内源性表达htrop-2的人肺癌细胞株calu-3的异种移植治疗模型中对k5-70抗体的体内的抗肿瘤活性进行了研究。将5×10⁶细胞的calu-3细胞移植到7周龄雌性裸小鼠的右胁腹皮下(1天)，癌细胞移植后第9天(9天)对确认了明确的肿瘤形成的个体(肿瘤平均体积约100mm³)进行分组，从第9天起按照每周2次的投与间隔进行抗体的腹腔内投与。癌细胞移植后第41天(41天)的对照组(投与pbs，n＝8)的肿瘤体积为395.7±221.2mm³，与此相对，k5-70抗体投与组(10mg/kg体重，n＝8)则为120.7±125.6mm³(p<0.01，利用学生t检验)，肿瘤形成受到显著抑制(抑制率69.5％)，t6-16抗体投与组(10mg/kg体重，n＝8)则为146.3±128.4mm³(p<0.05，利用学生t检验)，肿瘤形成受到显著抑制(抑制率63.0％)(图60a)。肿瘤重量方面，对照组为0.301±0.189g，与此相对，k5-70抗体投与组则为0.08±0.085(g)(p<0.01，利用学生t检验)、为73.5％的抑制率，t6-16抗体投与组则为0.106±0.096(g)(p<0.05，利用学生t检验)、为64.9％的抑制率(图60b)。

〔实施例46〕

[抗htrop-2小鼠单克隆抗体k5-70在人胆管癌细胞株tfk-1细胞异种移植预防模型中的抗肿瘤活性]

同样地，在使用在细胞表面内源性表达htrop-2的人胆管癌细胞株tfk-1的异种移植预防模型中对k5-70抗体的体内的抗肿瘤活性进行了研究。将5×10⁶细胞的tfk-1细胞移植到7周龄雌性裸小鼠的右胁腹皮下(1天)，从该天起按照每周2次的投与间隔开始抗体的腹腔内投与。癌细胞移植后第31天(31天)的对照组(投与pbs，n＝5)的肿瘤体积为1000.4±268.9mm³，与此相对，k5-70抗体投与组(10mg/kg体重，n＝5)则为197.2±215.5mm³(p<0.01，利用学生t检验)，肿瘤形成受到显著抑制(抑制率80.3％)(图61a)。肿瘤重量方面，对照组为0.443±0.070g，与此相对，k5-70抗体投与组则为0.063±0.052(g)(p<0.01，利用学生t检验)、为85.8％的抑制率(图61b)。

〔实施例47〕

[huk5-70及hut6-16-2抗体的亲合力解析]

关于huk5-70及hut6-16-2抗体的抗原结合活性，通过使用了将低密度的抗原固相化的96孔板的elisa法(低密度抗原固相化elisa)进行了研究。在96孔板中按照50μl/孔添加用0.1m乙酸缓冲液(ph5.3)制备成0.1μg/ml的重组htacstd2-fc-his蛋白(creativebiomart)，在4℃包覆一晩后，进行与实施例40同样的解析。对于被测抗体，用elisa缓冲液(含有1％脱脂乳、0.025％tween20的pbs)由20μg/ml开始制作2倍稀释系列(15点)而使用。其结果是，hut6-16-2抗体为与t6-16抗体几乎同等的结合活性(ec50值分别为49ng/ml和41ng/ml)，与此相对，huk5-70抗体的ec50值为k5-70抗体的约20倍(分别为222ng/ml、12ng/ml、图62)。

接下来，通过解析一价的抗原-抗体反应的elisa对huk5-70及k5-70抗体的抗原结合活性进行了研究。在96孔板中按照50μl/孔添加用0.1m乙酸缓冲液(ph5.3)稀释成1μg/ml的山羊抗人igg(fcγ特异性的)(southernbiotech)及稀释成3μg/ml的山羊抗小鼠igg(γ链特异性的)(southernbiotech)，在4℃包覆一晩。用洗涤缓冲液(含有0.05％tween20的pbs)洗涤后，按照200μl/孔添加封闭缓冲液(含有2％脱脂乳、0.05％tween20的pbs)进行封闭(室温、1小时)。用洗涤缓冲液洗涤后，按照50μl/孔添加用elisa缓冲液(含有1％脱脂乳、0.025％tween20的pbs)稀释成1μg/ml的试验抗体。此时，向包覆了山羊抗人igg(fcγ特异性的)的孔中添加huk5-70抗体，向包覆了山羊抗小鼠igg(γ链特异性的)的孔中添加k5-70抗体。在室温下静置1小时后，用洗涤缓冲液洗涤，对于实施例3所示的htrop-2细胞外区域的重组蛋白(htrop-2ec)，用elisa缓冲液由5μg/ml起制作3倍稀释系列(10点)，按照各50μl/孔进行添加。在室温下静置1小时后，用洗涤缓冲液洗涤，按照50μl/孔添加用elisa缓冲液稀释成2μg/ml的抗his(g-18)(santacruz)作为一抗。在室温下静置1小时后，用洗涤缓冲液洗涤，按照50μl/孔添加用elisa缓冲液稀释1000倍的hrp标记抗兔igg(gehealthcare)作为二抗。在室温下静置1小时后，用洗涤缓冲液洗涤，按照50μl/孔添加tmb(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，sigma)作为底物溶液，进行显色反应。以25μl/孔加入1m硫酸使反应停止后，使用酶标仪model550(biorad)，将655nm的吸光度作为参照来测定450nm的吸光度。其结果是，由htrop-2ec蛋白与k5-70及huk5-70抗体的结合曲线计算出的ec50分别为7ng/ml、6ng/ml(图63)。由此表示，在一价的抗原-抗体反应中huk5-70抗体和k5-70抗体为同等的抗原亲和性(亲和)。

如实施例40所示，在使用了将高密度的抗原(0.5μg/ml)固相化的96孔板的elisa法(抗原固相化elisa)中，k5-70抗体和huk5-70抗体的抗原亲和性同等(图53)，因而，作为在将低密度的抗原(0.1μg/ml)固相化的elisa法中huk5-70抗体的抗原结合活性比k5-70抗体相对低的原因，认为是在huk7-50抗体中与2个抗原结合臂的运动能力有关的柔软性、即所谓“亲合力(avidity)”方面与k5-70抗体相比相对较低。

〔实施例48〕

[人源化k5-70抗体的突变体的制作和特性描述]

为了提高huk5-70抗体的“亲合力(avidity)”，进行了以下的实验。

利用以下的实验对如上所述huk5-70抗体的“亲合力(avidity)”相对较低是起因于vh和vl中哪一个进行了研究。首先，通过基因合成制作了编码母源抗体k5-70抗体的h链可变区(k5-70vh)及l链可变区(k5-70vl)的基因(operon公司)。此时，在k5-70vh及k5-70vl的基因序列的5’末端侧添加kozak序列(accacc)。进而在k5-70vh的5’末端附加了作为限制酶位点的ecori的位点(gaattc)，在3’末端附加了nhei的位点(gctagc)。同样地，在k5-70vl的5’末端附加了作为限制酶位点的agei的位点(accggt)，在3’末端附加了bsiwi的位点(cgtacg)。所合成的k5-70vh基因及k5-70vl基因被引入pcr2.1载体(invitrogen)中。通过基因合成所制作的k5-70vh及vl的基因序列分别示于图64和图65中。被引入pcr2.1载体中的k5-70vh及k5-70vl基因分别利用限制酶ecori及nhei、agei及bsiwi消化，进行基因片段的回收。然后，所切出的k5-70vh基因插入人igg1型表达用载体pfuse-chig-hg1载体(invivogen)的ecori/nhei位点，k5-70vl基因插入人igκ型表达用载体pfuse2-clig-hk载体(invivogen)的agei/bsiwi位点，完成了小鼠-人嵌合结构(pfuse-chig-muk5-70、pfuse2-clig-muk5-70)。

将上述所制作的结构与实施例36中制作的huk5-70h链表达载体(pfuse-chig-huk5-70)及huk5-70l链表达载体(pfuse2-clig-huk5-70)以下表的1～4所示的组合在293f细胞(invitrogen)中共表达。

向293f细胞(invitrogen)的转染使用neofection试剂(astec)按照所附方法进行。转染后，使用freestyle293表达培养基(invitrogen)在37℃、co2浓度8％的co2培养箱中进行5天的培养，之后回收培养上清。培养上清中的抗体浓度用夹心elisa法进行测定。具体而言，在96孔板中以50μl/孔添加用pbs稀释成1μg/ml的山羊抗人igg(fcγ特异性的)(southernbiotech)，在4℃包覆一晩。用洗涤缓冲液(含有0.05％tween20的pbs)洗涤后，以200μl/孔添加封闭缓冲液(含有2％脱脂乳和0.05％tween20的pbs)，在室温下进行1小时封闭。用洗涤缓冲液洗涤后，以50μl/孔添加用elisa缓冲液(含有1％脱脂乳和0.025％tween20的pbs)稀释成适当稀释倍率的培养上清，在室温下反应2小时。作为标准品，使用huk5-70抗体。用洗涤缓冲液洗涤后，以50μl/孔添加用elisa缓冲液稀释1,000倍的hrp标记山羊抗人kappa(κ链特异性的)(southernbiotech)作为检测用抗体，在室温下反应1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，以50μl/孔添加tmb(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，sigma)底物溶液，进行显色反应。以25μl/孔加入1m硫酸使反应停止后，使用imark酶标仪(biorad)，将655nm的吸光度作为参照来测定450nm的吸光度。4种培养上清中的抗体与htrop-2的结合利用前述的低密度抗原固相化elisa进行测定。其结果是，由小鼠k5-70vh和huk5-70vl构成的muvh/huvl抗体对于htrop-2的结合与chk5-70抗体同等，但是由huk5-70vh和小鼠k5-70vl构成的huvh/muvl抗体对于htrop-2的结合活性与chk5-70相比相对较低(图66)。由此表示huk5-70vh与huk5-70的“亲合力”有关。因而，为了制作提高了huk5-70抗体的“亲合力”的改变抗体，进行了huk5-70vh的氨基酸的置换。由图41所示的huk5-70vh与k5-70vh的氨基酸序列的比对可知，氨基酸号为5、7、11、12、13、20、38、40、44、73、75、81、82c、83、87、108及109位的合计17个氨基酸在huk5-70vh与k5-70vh之间不同(氨基酸号根据kabat等的定义(1991))。通过基因合成制作将huk5-70vh的这些氨基酸分别一个一个地置换成对应的k5-70vh的氨基酸的突变体，制作了表达载体(pfuse-chig-huk5-70突变体)。此外，根据landolfi等的报道(j.immunol.166:1748,2001)，vh的第11位和第38位的氨基酸与人源化抗体的亲合力有关，通过将这两个氨基酸置换成对应的小鼠来源的氨基酸，亲合力及生物活性提高。因而，一并制作了第11位和第38位氨基酸的双重突变体。图67中示出所制作的18种huk5-70vh突变体的名称和氨基酸序列。

将所制作的18种huk5-70vh突变体(pfuse-chig-huk5-70突变体的表达载体)分别与huk5-70l链表达载体(pfuse2-clig-huk5-70)组合，转染到hek293细胞，使用其培养上清通过低密度抗原固相化elisa研究了各氨基酸置换抗体与htrop-2的结合活性。其结果是，在18种huk5-70vh突变体中，在将huk5-70vh的第44位r(精氨酸)置换为g(甘氨酸)的r44g突变体(huk5-70r44g；以下为huk5-70-2)中确认到明确的抗原结合活性的提高(图68)。huk5-70vhr44g(以下为huk5-70vh2)基因的序列示于图69。

〔实施例49〕

[huk5-70-2抗体的纯化及特性描述]

作为huk5-70r44g突变型抗体的huk5-70-2抗体如下纯化。将pfuse-chig-huk5-70r44g和pfuse2-clig-huk5-70转染到293f细胞，进行5天培养后，回收培养上清。使用rproteinasepharosefastflow(gehealthcare)由所回收的培养上清纯化huk5-70-2抗体。在还原条件下利用sds-page将所纯化的huk5-70-2抗体展开，结果确认到约50kda的h链和约25kda的l链，各个抗体的纯度为95％以上(图70)。

利用高密度抗原固相化elisa及低密度抗原固相化elisa对纯化的huk5-70-2及huk5-70抗体与htrop-2的结合活性进行了研究。利用高密度抗原固相化elisa(使用将1μg/ml的htrop-2固相化的96孔板)进行了亲和性的验证，结果huk5-70抗体与huk5-70-2抗体的结合曲线几乎重叠，两者的亲和性相同，接下来利用低密度抗原固相化elisa(使用将0.1μg/ml的htrop-2固相化的96孔板)进行了亲合力的验证，结果与使用培养上清时的结果同样，huk5-70-2抗体的抗原结合活性比huk5-70抗体明显更高(图71)。具体而言，ec50值方面，k5-70抗体为11.4ng/ml、huk5-70抗体为33.4ng/ml、huk5-70-2抗体为11.4ng/ml，huk5-70-2抗体与huk5-70抗体相比“亲合力”提高，表明具有与k5-70抗体同等的活性。

〔实施例50〕

[人源化抗htrop-2抗体的抗体依赖性细胞毒(adcc)活性的测定]

(1)靶细胞溶液的调整

作为靶细胞，使用内源性表达htrop-2的人大肠癌细胞株sw480、人胰脏癌细胞株pk-59、人前列腺癌细胞株pc-3。通过胰蛋白酶处理从板上剥离用10cm细胞培养皿所培养的靶细胞，悬浮于检测培养基中。adcc检测用的培养基使用加入了0.5％fbs的leivovitzl-15培养基(sw480细胞)或rpmi-1640培养基(pk-59、pc-3细胞)。离心后(1000rpm、3分钟、室温)，用同样的培养基将颗粒制备成2×10⁵细胞/ml的细胞密度，制成靶细胞溶液。

(2)人末梢血单核细胞的分离

对健康人静脉血进行肝素采血，用pbs稀释2倍后，重叠在lymphoprep(第一化学药品)上并离心(室温、750rpm、5分钟，接着2000rpm、20分)。离心后，回收位于中间层级分的单核细胞(健康人末梢血单核细胞)，用pbs洗涤3次后，用检测培养基制备细胞悬浮液，作为效应细胞使用。

(3)人源化抗htrop-2抗体(huk5-70、huk5-70-2及hut6-16-2抗体)的adcc活性

将所制备的靶细胞溶液100μl(2×10⁴细胞/孔)分注到96孔平底板(falcon公司制)中。然后，按照效应细胞：靶细胞的比为40：1的方式添加人末梢血单核细胞(效应细胞)。此外，作为被测抗体，按照最终浓度为0.1～30μg/ml的方式加入人源化抗htrop-2抗体(huk5-70、huk5-70-2及hut6-16-2抗体)，使总量为200μl，在co2培养箱内(37℃、5％co2)进行6小时培养。培养后，使用细胞毒性检测试剂盒(ldh)(roche,cat.no.11644793001)，根据试剂盒所附的方案，测定由因效应细胞而受到伤害的靶细胞的细胞质放出到培养上清中的乳酸脱氢酶(ldh)的活性，以该测定结果为指标来评价adcc活性。

如图72a～72c所示，可以明确：对于在细胞表面表达htrop-2的人大肠癌细胞株sw480(图72a)、人胰癌细胞株pk-59(图72b)、人前列腺癌细胞株pc-3(图72c)，huk5-70及hut6-16-2抗体用量依赖性地发挥出adcc活性。另外，如图72b及图72c所示，可以明确：huk5-70-2抗体对于人胰癌细胞株pk-59及人前列腺癌细胞株pc-3细胞发挥出比huk5-70抗体更强的adcc活性。如前所述，huk5-70-2抗体是通过将huk5-70vh的第44位的r(精氨酸)置换为g(甘氨酸)、从而对于htrop-2的结合能力(亲合力)提高的抗体，表明与huk5-70抗体相比提高的亲合力反映到adcc活性上。因此，huk5-70-2抗体在体内也具有与huk5-70抗体同样优异的抗肿瘤活性(优选能够具有比huk5-70抗体更高的抗肿瘤活性)。由以上结果表明，huk5-70、huk5-70-2及hut6-16-2抗体是对于在细胞表面表达htrop-2的癌有效的治疗用抗体。

产业上的可利用性

根据本发明，可以提供与htrop-2特异性反应、在体内具有高抗肿瘤活性的抗体，具体而言可以提供以低用量在体内具有高抗肿瘤活性的单克隆抗体，特别是该抗体中的人源化抗体。进而，本发明可以提供产生该抗体的杂交瘤、该抗体的片段、该抗体等与各种药剂的复合物、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤的检测方法、肿瘤的检测用或诊断用试剂盒。

序列表自由文本

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序列表

<110>株式会社立富泰克（livtech,inc.）

<120>在体内具有抗肿瘤活性的抗人trop-2抗体

<130>pct12-0027

<150>us61/562,672

<151>2011-11-22

<160>234

<170>patentinversion3.4

<210>1

<211>2080

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<220>

<221>cds

<222>(339)..(1310)

<400>1

gcgggtccccagaagcctacaggtgagtatcggttctccccttcccggctttcggtccgg60

aggaggcgggagcagcttccctgttctgatcctatcgcgggcggcgcagggccggcttgg120

ccttccgtgggacggggaggggggcgggatgtgtcacccaaataccagtggggacggtcg180

gtggtggaaccagccgggcaggtcgggtagagtataagagccggagggagcggccgggcg240

gcagacgcctgcagaccatcccagacgccggagcccgagccccgacgagtccccgcgcct300

catccgcccgcgtccggtccgcgttcctccgccccaccatggctcggggccccggc356

metalaargglyprogly

15

ctcgcgccgccaccgctgcggctgccgctgctgctgctggtgctggcg404

leualaproproproleuargleuproleuleuleuleuvalleuala

101520

gcggtgaccggccacacggccgcgcaggacaactgcacgtgtcccacc452

alavalthrglyhisthralaalaglnaspasncysthrcysprothr

253035

aacaagatgaccgtgtgcagccccgacggccccggcggccgctgccag500

asnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysgln

404550

tgccgcgcgctgggctcgggcatggcggtcgactgctccacgctgacc548

cysargalaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthr

55606570

tccaagtgtctgctgctcaaggcgcgcatgagcgcccccaagaacgcc596

serlyscysleuleuleulysalaargmetseralaprolysasnala

758085

cgcacgctggtgcggccgagtgagcacgcgctcgtggacaacgatggc644

argthrleuvalargprosergluhisalaleuvalaspasnaspgly

9095100

ctctacgaccccgactgcgaccccgagggccgcttcaaggcgcgccag692

leutyraspproaspcysaspprogluglyargphelysalaarggln

105110115

tgcaaccagacgtcggtgtgctggtgcgtgaactcggtgggcgtgcgc740

cysasnglnthrservalcystrpcysvalasnservalglyvalarg

120125130

cgcacggacaagggcgacctgagcctacgctgcgatgagctggtgcgc788

argthrasplysglyaspleuserleuargcysaspgluleuvalarg

135140145150

acccaccacatcctcattgacctgcgccaccgccccaccgccggcgcc836

thrhishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

155160165

ttcaaccactcagacctggacgccgagctgaggcggctcttccgcgag884

pheasnhisseraspleuaspalagluleuargargleupheargglu

170175180

cgctatcggctgcaccccaagttcgtggcggccgtgcactacgagcag932

argtyrargleuhisprolysphevalalaalavalhistyrglugln

185190195

cccaccatccagatcgagctgcggcagaacacgtctcagaaggccgcc980

prothrileglnilegluleuargglnasnthrserglnlysalaala

200205210

ggtgacgtggatatcggcgatgccgcctactacttcgagagggacatc1028

glyaspvalaspileglyaspalaalatyrtyrphegluargaspile

215220225230

aagggcgagtctctattccagggccgcggcggcctggacttgcgcgtg1076

lysglygluserleupheglnglyargglyglyleuaspleuargval

235240245

cgcggagaacccctgcaggtggagcgcacgctcatctattacctggac1124

argglygluproleuglnvalgluargthrleuiletyrtyrleuasp

250255260

gagattcccccgaagttctccatgaagcgcctcaccgccggcctcatc1172

gluileproprolysphesermetlysargleuthralaglyleuile

265270275

gccgtcatcgtggtggtcgtggtggccctcgtcgccggcatggccgtc1220

alavalilevalvalvalvalvalalaleuvalalaglymetalaval

280285290

ctggtgatcaccaaccggagaaagtcggggaagtacaagaaggtggag1268

leuvalilethrasnargarglysserglylystyrlyslysvalglu

295300305310

atcaaggaactgggggagttgagaaaggaaccgagcttgtag1310

ilelysgluleuglygluleuarglysgluproserleu

315320

gtacccggcggggcaggggatggggtggggtaccggatttcggtatcgtcccagacccaa1370

gtgagtcacgcttcctgattcctcggcgcaaaggagacgtttatcctttcaaattcctgc1430

cttccccctcccttttgcgcacacaccaggtttaatagatcctggcctcagggtctcctt1490

tctttctcacttctgtcttgaaggaagcatttctaaaatgtatcccctttcggtccaaca1550

acaggaaacctgactggggcagtgaaggaagggatggcatagcgttatgtgtaaaaaaca1610

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<210>2

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<212>prt

<213>智人（homosapiens）

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151015

leuleuleuvalleualaalavalthrglyhisthralaalaglnasp

202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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195200205

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leuiletyrtyrleuaspgluileproprolysphesermetlysarg

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leuthralaglyleuilealavalilevalvalvalvalvalalaleu

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proserleu

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130

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<211>134

<212>prt

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asp

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<212>prt

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130

<210>45

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<212>prt

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ser

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<210>53

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130

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asp

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<211>11

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130

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<212>prt

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130135140

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130

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<220>

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cyslysalaserglytyrthrphethrasntyralaleuhistrpval

25303

cgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacact260

argglnalaproglyglnargleuglutrpmetglytrpileasnthr

404550

ggcaatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcacc308

glyasnglyasnthrlystyrserglnlyspheglnglyargvalthr

556065

cttaccagtgacacatccgcgagcacagcctacatggagatgagcagc356

leuthrseraspthrseralaserthralatyrmetglumetserser

70758085

ctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgaggagcagtggc404

leuargsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargsersergly

9095100

tggtacgtttggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtc452

trptyrvaltrppheaspprotrpglyglnglythrleuvalthrval

105110115

tcctcagcttccaccaagggcccatcggttttccccctggcgccctgctccaggag508

serser

cacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaa563

<210>85

<211>119

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>85

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr

202530

alaleuhistrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpmet

354045

glytrpileasnthrglyasnglyasnthrlystyrserglnlysphe

505560

glnglyargvalthrleuthrseraspthrseralaserthralatyr

65707580

metglumetserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargserserglytrptyrvaltrppheaspprotrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserser

115

<210>86

<211>384

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<220>

<221>cds

<222>(1)..(384)

<400>86

atggaagtcctcgtgcagcttctcttcctcctgctactctggctccca48

metgluvalleuvalglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro

151015

gataccaccggagaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtct96

aspthrthrglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser

202530

ttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagt144

leuserproglygluargalathrleusercysargalaserglnser

354045

gttagcagctacttagcctggtatcaacagaaacctggccaggctccc192

valsersertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro

505560

aggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagcc240

argleuleuiletyraspalaserasnargalathrglyileproala

65707580

aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagc288

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser

859095

agcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagc336

serleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargser

100105110

aactggcctcggtcgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacga384

asntrpproargserpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

115120125

<210>87

<211>128

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>87

metgluvalleuvalglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro

151015

aspthrthrglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser

202530

leuserproglygluargalathrleusercysargalaserglnser

354045

valsersertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro

505560

argleuleuiletyraspalaserasnargalathrglyileproala

65707580

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser

859095

serleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargser

100105110

asntrpproargserpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

115120125

<210>88

<211>601

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<220>

<221>cds

<222>(112)..(477)

<400>88

acccaaaaaccacacccctccttgggagaatcccctagatcacagctcctcaccatggac60

tggacctggagcatccttttcttggtggcagcagcaacaggtgcccactcccaggtt117

glnval

1

cagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtg165

glnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaserval

51015

aaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagttatggtatc213

lysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyrglyile

202530

agttgggtgcgccaggcccctggacaagggcttgagtggatgggattg261

sertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetglyleu

35404550

atcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggc309

ileseralatyrasnglyasnthrasntyralaglnlysleuglngly

556065

agagtcaccatgaccgtagacacgtctacgagcacagcctatatggaa357

argvalthrmetthrvalaspthrserthrserthralatyrmetglu

707580

ctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtctattactgtgcgaga405

leuargserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcysalaarg

859095

gatggaatagcagtggcgaccaaagatgcttttgatatctggggccaa453

aspglyilealavalalathrlysaspalapheaspiletrpglygln

100105110

gggacaatggtcaccgtctcttcagcacccaccaaggctccggatgtgttcccc507

glythrmetvalthrvalserser

115120

atcatatcagggtgcagacacccaaaggataacagccctgtggtcctggcatgcttgata567

actgggtaccacccaacgtccgtgactgtcacct601

<210>89

<211>122

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>89

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

glyilesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

354045

glyleuileseralatyrasnglyasnthrasntyralaglnlysleu

505560

glnglyargvalthrmetthrvalaspthrserthrserthralatyr

65707580

metgluleuargserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargaspglyilealavalalathrlysaspalapheaspiletrp

100105110

glyglnglythrmetvalthrvalserser

115120

<210>90

<211>342

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<220>

<221>cds

<222>(1)..(342)

<400>90

gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctgga48

aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagt96

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisser

202530

aatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtct144

asnglytyrasntyrleuasptrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

ccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccct192

proglnleuleuiletyrleuglyserasnargalaserglyvalpro

505560

gacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatc240

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

agcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagct288

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

ctacaaactctggggctcactttcggcggagggaccaaggtggagatc336

leuglnthrleuglyleuthrpheglyglyglythrlysvalgluile

100105110

aaacga342

lysarg

<210>91

<211>114

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>91

aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisser

202530

asnglytyrasntyrleuasptrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrleuglyserasnargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

leuglnthrleuglyleuthrpheglyglyglythrlysvalgluile

100105110

lysarg

<210>92

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>重组蛋白

<400>92

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethriletyr

202530

trpileasntrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpile

354045

glyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasnglnlysphe

505560

lysasplysalathrleuthrvalaspthrseralaserthralatyr

65707580

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr

100105110

valserser

115

<210>93

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>重组蛋白

<400>93

gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnserileglythrser

202530

ilehistrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile

354045

lystyralasergluserileserglyileproalaargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro

65707580

gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserasnsertrpprophe

859095

thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105

<210>94

<211>122

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>重组蛋白

<400>94

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

asnmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile

354045

glytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasnglnargphe

505560

lysserargalathrmetthrvalasplysserthrserthralatyr

65707580

metgluleuargserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarggluasptyrglyserserprosertyralametasptyrtrp

100105110

glyglnglythrmetvalthrvalserser

115120

<210>95

<211>122

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>重组蛋白

<400>95

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

asnmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile

354045

glytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasnglnargphe

505560

lysserargalathrmetthrvalaspthrserthrserthralatyr

65707580

metgluleuargserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarggluasptyrglyserserprosertyralametasptyrtrp

100105110

glyglnglythrmetvalthrvalserser

115120

<210>96

<211>111

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>重组蛋白

<400>96

aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuvalhisgly

202530

asnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysserglnthr

859095

thrhisvalprothrpheglyglyglythrlysvalgluilelys

100105110

<210>97

<211>134

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成结构（重组蛋白）

<400>97

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

valhisserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

202530

proglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thriletyrtrpileasntrpvalargglnalaproglyglnglyleu

505560

glutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasn

65707580

glnlysphelysasplysalathrleuthrvalaspthrseralaser

859095

thralatyrmetgluleuserserleuargsergluaspthralaval

100105110

tyrtyrcysthrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythr

115120125

leuvalthrvalserser

130

<210>98

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>重组蛋白

<400>98

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethriletyr

202530

trpileasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile

354045

glyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasnglnlysphe

505560

lysasplysalathrleuthrvalaspthrseralaserthralatyr

65707580

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr

100105110

valserser

115

<210>99

<211>420

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>重组dna

<220>

<221>cds

<222>(13)..(414)

<400>99

gaattcaccaccatgggatggtcctgcattattctctttctcgtcgccacc51

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathr

1510

gccacaggcgtgcacagccaggttcaactgcagcaacctggggcagag99

alathrglyvalhisserglnvalglnleuglnglnproglyalaglu

152025

ctggttcggccaggggcctccgtcaaactgtcctgcaaagcttctggc147

leuvalargproglyalaservallysleusercyslysalasergly

30354045

tacactttcaccatctactggatcaactgggtgaagcagaggcccggc195

tyrthrphethriletyrtrpileasntrpvallysglnargprogly

505560

cagggcctggaatggatcggaaatatctatcctagcgattcttacaca243

glnglyleuglutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthr

657075

aattacaaccagaagttcaaggacaaggctaccctgaccgtggacaaa291

asntyrasnglnlysphelysasplysalathrleuthrvalasplys

808590

tctagctccacagcctacatgcagctgagcagccccactagcgaggat339

serserserthralatyrmetglnleuserserprothrsergluasp

95100105

agcgcagtgtattattgtaccagaaccagcatggccgactattgggga387

seralavaltyrtyrcysthrargthrsermetalaasptyrtrpgly

110115120125

cagggcacaactctgaccgtgagcagcgctagc420

glnglythrthrleuthrvalserser

130

<210>100

<211>399

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>重组dna

<220>

<221>cds

<222>(13)..(393)

<400>100

accggtaccaccatggttagcacacctcaatttctggtcttcctgctcttc51

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphe

1510

tggattcctgccagcagaggagatatcctcctgacacaaagccccgca99

trpileproalaserargglyaspileleuleuthrglnserproala

152025

atcctgagcgtgtcccccggagagcgcgtgagctttagctgccgggcc147

ileleuservalserproglygluargvalserphesercysargala

30354045

agccagagcattggaaccagcatccactggtatcagcagagaaccaac195

serglnserileglythrserilehistrptyrglnglnargthrasn

505560

gggtctcccaggctgctgattaaatacgcttctgagtctatttccggg243

glyserproargleuleuilelystyralasergluserilesergly

657075

atcccaagcagattctccggctctggcagcggcactgattttactctg291

ileproserargpheserglyserglyserglythraspphethrleu

808590

tctatcaacagcgtggagtccgaagacatcgccgactactattgtcag339

serileasnservalglusergluaspilealaasptyrtyrcysgln

95100105

cagagcaattcctggccattcacctttggcagcggcaccaagctggaa387

glnserasnsertrpprophethrpheglyserglythrlysleuglu

11011512012

atcaagcgtacg399

ilelys

<210>101

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>101

asnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysgln

151015

cysargalaleuglyserglymetalavalaspcysserthr

202530

<210>102

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>102

thrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargala

151015

leuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthrser

202530

<210>103

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>103

thrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcys

151015

glncysargalaleuglyserglymetalavalaspcysser

202530

<210>104

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>104

metthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysarg

151015

alaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthr

202530

<210>105

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>105

lysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncys

151015

argalaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleu

202530

<210>106

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>106

prothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyarg

151015

cysglncysargalaleuglyserglymetalavalaspcys

202530

<210>107

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>107

valcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

glyserglymetalavalaspcysserthrleuthrserlys

202530

<210>108

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>108

cysalaalavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuarg

151015

cysalaalavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuarg

202530

cys

<210>109

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>109

cysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglygly

151015

argcysglncysargalaleuglyserglymetalavalasp

202530

<210>110

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>110

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

<210>111

<211>32

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>111

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

151015

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

202530

<210>112

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>112

argleuphearggluargtyrargleuhisprolysphevalalaala

151015

valhistyrgluglnprothrileglnilegluleuarggln

202530

<210>113

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>113

alavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuarggln

151015

<210>114

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>114

cysalaglyalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargarg

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>115

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>115

cysprolysphevalalaalavalhistyrgluglnprothrilegln

151015

cysglyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluarg

202530

cys

<210>116

<211>23

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>116

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

151015

cysglyleuaspleuargval

20

<210>117

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>117

pheglnglyargglyglyleuaspleuargvalargglyglupro

151015

<210>118

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>118

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

<210>119

<211>23

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>119

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

151015

cysargglygluproleugln

20

<210>120

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>120

cysthrileglnilegluleuargglnasnthrserglnlysalaala

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

<210>121

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>121

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>122

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>122

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>123

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>123

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

<210>124

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>124

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysglyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluarg

202530

cys

<210>125

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>125

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

<210>126

<211>17

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>126

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cys

<210>127

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>127

cysalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargargleuphe

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

<210>128

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>128

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>129

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>129

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

<210>130

<211>32

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>130

valhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasncys

151015

glyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluargcys

202530

<210>131

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>131

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

<210>132

<211>32

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>132

alavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglncys

151015

alavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglncys

202530

<210>133

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>133

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

<210>134

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>134

thrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcys

151015

glncysargalaleuglyserglymetalavalaspcysser

202530

<210>135

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>135

asnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysgln

151015

cysargalaleuglyserglymetalavalaspcysserthr

202530

<210>136

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>136

lysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncys

151015

argalaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleu

202530

<210>137

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>137

metthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysarg

151015

alaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthr

202530

<210>138

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>138

cysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglygly

151015

argcysglncysargalaleuglyserglymetalavalasp

202530

<210>139

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>139

thrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargala

151015

leuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthrser

202530

<210>140

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>140

thrcysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyprogly

151015

glyargcysglncysargalaleuglyserglymetalaval

202530

<210>141

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>141

prothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyarg

151015

cysglncysargalaleuglyserglymetalavalaspcys

202530

<210>142

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>142

valcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

glyserglymetalavalaspcysserthrleuthrserlys

202530

<210>143

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>143

cysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleugly

151015

serglymetalavalaspcysserthrleuthrserlyscys

202530

<210>144

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>144

cysthrcysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglypro

151015

glyglyargcysglncysargalaleuglyserglymetala

202530

<210>145

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>145

asncysthrcysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspgly

151015

proglyglyargcysglncysargalaleuglyserglymet

202530

<210>146

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>146

aspasncysthrcysprothrasnlysmetthrvalcysserproasp

151015

glyproglyglyargcysglncysargalaleuglysergly

202530

<210>147

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>147

cysthrvalalaserproaspglyproglyglyargalaglnalaarg

151015

cysleuglyserglymetalavalaspalaserthrleuthrserlys

202530

cys

<210>148

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>148

glnaspasncysthrcysprothrasnlysmetthrvalcysserpro

151015

aspglyproglyglyargcysglncysargalaleuglyser

202530

<210>149

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>149

serproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleuglyser

151015

glymetalavalaspcysserthrleuthrserlyscysleu

202530

<210>150

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>150

cysthrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyarg

151015

cysglncysargalaleuglyserglymetalavalaspalaserthr

202530

cys

<210>151

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>151

thrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysarg

151015

<210>152

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>152

cysalaprolysasnalaargthrleuvalargprosergluhisala

151015

cysalaargthrleuvalargprosergluhisalaleuvalaspasn

202530

cys

<210>153

<211>32

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>153

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

151015

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

202530

<210>154

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>154

thrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargala

151015

leuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthrser

202530

<210>155

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>155

asnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysgln

151015

cysargalaleuglyserglymetalavalaspcysserthr

202530

<210>156

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>156

thrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcys

151015

glncysargalaleuglyserglymetalavalaspcysser

202530

<210>157

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>157

metthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysarg

151015

alaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthr

202530

<210>158

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>158

lysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncys

151015

argalaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleu

202530

<210>159

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>159

cysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglygly

151015

argcysglncysargalaleuglyserglymetalavalasp

202530

<210>160

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>160

prothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyarg

151015

cysglncysargalaleuglyserglymetalavalaspcys

202530

<210>161

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>161

cysalaglyalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargarg

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>162

<211>17

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>162

cysthrhishisileleuileaspleuarghisargprothralagly

151015

cys

<210>163

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>163

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>164

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>164

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>165

<211>32

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>165

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

151015

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

202530

<210>166

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>166

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>167

<211>19

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>167

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysprolys

<210>168

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>168

valcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

glyserglymetalavalaspcysserthrleuthrserlys

202530

<210>169

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>169

aspleuserleuargcysaspgluleuvalargthrhishisileleu

151015

ileaspleuarghisargprothralaglyalapheasnhis

202530

<210>170

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>170

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

<210>171

<211>17

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>171

cyspheglnglyargglyglyleuaspleuargvalargglyglupro

151015

cys

<210>172

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>172

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

<210>173

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>173

cysglyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluarg

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>174

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>174

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>175

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>175

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>176

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>176

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

<210>177

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>177

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysargglygluproleuglnvalgluargthrleuiletyrtyrleu

202530

cys

<210>178

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>178

cysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

<210>179

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>179

cysthrvalalaserproaspglyproglyglyargalaglnalaarg

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

<210>180

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>180

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

<210>181

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>181

leuserleuargcysaspgluleuvalargthrhishisileleuile

151015

aspleuarghisargprothralaglyalapheasnhisser

202530

<210>182

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>182

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>183

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>183

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

151015

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthr

202530

cys

<210>184

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>184

proaspcysaspprogluglyargphelysalaargglncysasn

151015

<210>185

<211>31

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>185

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasncyspro

151015

aspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasncys

202530

<210>186

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>186

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

<210>187

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>187

valcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargala

151015

<210>188

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>188

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

<210>189

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>189

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthr

151015

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

202530

cys

<210>190

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>190

aspcysaspprogluglyargphelysalaargglncysasngln

151015

<210>191

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>191

cysthrvalalaserproaspglyproglyglyargalaglnalaarg

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>192

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>192

cysaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasngln

151015

cysaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasngln

202530

cys

<210>193

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>193

cysglyargphelysalaargglnalaasnglnthrservalalatrp

151015

cysalaargthrleuvalargprosergluhisalaleuvalaspasn

202530

cys

<210>194

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>194

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthr

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

<210>195

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>195

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

<210>196

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>196

cysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

<210>197

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>197

cysgluglyargphelysalaargglnalaasnglnthrservalala

151015

cysgluglyargphelysalaargglnalaasnglnthrservalala

202530

cys

<210>198

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>198

cysthrvalalaserproaspglyproglyglyargalaglnalaarg

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

<210>199

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>199

cysglyleutyraspproaspalaaspprogluglyargphelysala

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

<210>200

<211>31

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>200

aspproaspcysaspprogluglyargphelysalaargglncysasn

151015

cysglnthrservalcystrpcysvalasnservalglyvalarg

202530

<210>201

<211>32

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>201

cysprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthrserval

151015

cysaspgluleuvalarghishisileleuileaspleuarghiscys

202530

<210>202

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>202

cysproaspglyproglyglyargalaglnalaargalaleuglyser

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>203

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>203

cysthrleuvalargprosergluhisalaleuvalaspasnaspgly

151015

cysglyargphelysalaargglnalaasnglnthrservalalatrp

202530

cys

<210>204

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>204

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

151015

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

202530

cys

<210>205

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>205

cysglyleutyraspproaspalaaspprogluglyargphelysala

151015

cysprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthrserval

202530

cys

<210>206

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>206

tyraspproaspcysaspprogluglyargphelysalaarggln

151015

<210>207

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>207

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

151015

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthr

202530

cys

<210>208

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>208

cysaspprogluglyargphelysalaargglncysasnglnthr

151015

<210>209

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>209

cysvalasnservalglyvalargargthrasplysglyaspleuser

151015

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

202530

cys

<210>210

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>210

cysservalglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuarg

151015

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

202530

cys

<210>211

<211>32

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>211

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

151015

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

202530

<210>212

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>212

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

<210>213

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>213

cysvalasnservalglyvalargargthrasplysglyaspleuser

151015

leuargcysaspgluleuvalargthrhishisileleuile

202530

<210>214

<211>30

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>214

valargargthrasplysglyaspleuserleuargcysaspgluleu

151015

valargthrhishisileleuileaspleuarghisargpro

202530

<210>215

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>215

cysvalgluargthrleuiletyrtyrleuaspgluileproprolys

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>216

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>216

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>217

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>217

cysvalasnservalglyvalargargthrasplysglyaspleuser

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

<210>218

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>218

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>219

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<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>219

valglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuargcysasp

151015

gluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

<210>220

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>220

cysalaglyalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargarg

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>221

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>221

cysservalglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuarg

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

<210>222

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>222

cysvalargprosergluhisalaleuvalaspasnaspglyleutyr

151015

cysservalglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuarg

202530

cys

<210>223

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>223

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

<210>224

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>224

cysservalglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuarg

151015

cysasnaspglyleutyraspproaspalaaspprogluglyargphe

202530

cys

<210>225

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<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>225

cysvalasnservalglyvalargargthrasplysglyaspleuser

151015

cysglyleutyraspproaspalaaspprogluglyargphelysala

202530

cys

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<213>智人（homosapiens）

<400>226

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

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<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>227

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

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<212>prt

<213>智人（homosapiens）

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cysalaglyalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargarg

151015

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202530

cys

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<211>33

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<213>智人（homosapiens）

<400>229

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

<210>230

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>230

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

<210>231

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<213>智人（homosapiens）

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cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

<210>232

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

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cysglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuargalaasp

151015

cysglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuargalaasp

202530

cys

<210>233

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>233

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151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

<210>234

<211>33

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>234

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151015

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202530

cys