重组小鼠eps8肿瘤疫苗及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：重组小鼠eps8肿瘤疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗，该疫苗可应用于乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等疾病的预防和诊断，属于疫苗基因工程技术领域。
背景技术：
20多年以来，有关人类肿瘤免疫反应研究结果显示，肿瘤细胞表达的抗原可引起特异性细胞与体液免疫反应，但具有能够通过内源性免疫机制自发清除肿瘤的能力者却极为罕见。2004年，Giorgio Parmiani指出应用以肽为基础的疫苗在治疗IV期黑色素瘤患者的临床I - II期过程中，仅有12%的患者在治疗后出现临床反应。近年来，与上述方法相 t匕，在使用自体树突状细胞(DCs)与肽或肿瘤裂解物一同进行治疗的病例中，虽然患者产生疫苗提呈性T细胞的概率增加，但有关临床反应仍未得到显著改善。免疫系统不能引起肿瘤消退是肿瘤疫苗研究中所面临的一个巨大困难。大量的研究证据表明，肿瘤存在着许多逃逸免疫系统识别和攻击的机制，包括HLA- I类抗原和免疫共刺激分子的表达下调或丢失、肿瘤抗原的表达下调、抑制性调节T淋巴细胞增多等。其中，肿瘤组织中的免疫反应抑制是肿瘤细胞逃逸免疫攻击的重要因素。多项证据表明，存在于肿瘤组织中的特异性活化T淋巴细胞可发生凋亡；将体外活化的肿瘤特异性T淋巴细胞输入肿瘤组织后，其杀伤活性消失；同时，还有许多具有免疫抑制功能的可溶性因子(TGF-β、IL-10、前列腺素E2、Fas、TRAIL和RACSl等)和细胞膜分子(CTLA4、B7_H1等)在肿瘤细胞表达上调。因此，研究肿瘤组织内有关针对免疫攻击的逃逸机制对于肿瘤免疫的治疗效果具有重要意义。Eps8在实体瘤中的研究近年来研究者应用微阵数列、RT-PCR、Western Blot、基因敲除、动物致瘤性试验等方法发现EpsS在乳腺癌、口腔鳞癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌等实体肿瘤中表达异常升闻，并发现Eps8异常闻表达提闻了肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭力，临床标本检测出EpsS与肿瘤侵袭转移相关，为预后不良的指标。研究者应用cDNA阵列比较基因组杂交(CGH)技术联合基因表达序列分析(SAGE)技术对乳腺肿瘤进展进行了分析，发现Eps8为有潜力的靶点之一，并通过荧光定量PCR验证发现与正常乳腺上皮细胞相比乳腺癌组织中EpsS表达异常增高。EpsS在鳞状上皮癌发生过程中的作用用EpsS低表达的HN4细胞和Eps8高表达的细胞HN12细胞做细胞迁移模型，发现Eps8高表达与细胞迁移正相关，敲除或干扰EpsS后这种影响变小，提示EpsS与鳞状上皮癌的发生密切相关。研究者同时认为EpsS通过与其蛋白整合功能，激活Racl使得口腔鳞癌细胞的侵袭力大大提高。在宫颈癌中研究表明，EpsS可对细胞周期进行调控，用沉默EpsS基因的细胞株注射动物成瘤后，沉默EpsS后的肿瘤细胞株成瘤较未沉默的肿块显著减小，并且EpsS可降低宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性，其机制可能是提高AKT的激活和降低P53的表达。在结肠癌中的研究表明EpsS通过激活粘附分子FAK蛋白的表达，来提高结肠癌细胞的增殖能力，诱导了细胞的附着、游动。在对胰腺腺管癌的研究中发现相对于慢性胰腺炎及正常胰腺，腺管癌中EpsS表达明显增高，并且EpsS通过改变肌动蛋白的形态，生出伪足导致细胞间连接的改变从而促使细胞的迁移。总之，Eps8在实体瘤中的研究表明Eps8与正常细胞的恶变、迁移密切相关，并能促进肿瘤细胞的浸润、转移，为肿瘤预后差的指标。Eps8CDS全长2466bp，(GenBank:U12535. I)其编码区基因定位于染色体12q23_q24，翻译成含821个氨基酸的蛋白。为表皮生长因子受体(EGFR)重要的激酶活性底物之一。1993年由Fazioli等人于鼠科纤维母细胞NIH3T3所发现并提出此概念。Eps8家族中除Eps8外还包括Eps8Ll、Eps8L2、Eps8L3。Eps8主要翻译的EPS8蛋白(97KDa/68KDa)。EpsS广泛分布在间质细胞、上皮细胞及少量存在于造血细胞中。主要位于细胞质、核膜及细胞膜周围，是一个接受器型的酪氨酸激酶受体(RTKs)，它本身除了受EGFR磷酸化外，还受其他RTKs磷酸化激活，EpsS可结合形成多蛋白复合体以传递生长因子信号激活Rho家族GTP酶。Eps8与EGFR结合后，使得细胞的DNA合成和癌化能力增加，此外有报告表明Eps8也是一个骨架蛋白，它对细胞的生长和迁移起着重要作用。Eps8可与F-actin及Cortractin结合使细胞骨架重组，细胞膜发生皱襞，促进细胞迁移。Eps8的结构和功能Eps8包括磷酸化酪氨酸蛋白结合区(phosphotyrosine binding protein, PTB), SH3 区和 SAM-PNT 区(sterile alpha-pointed)。PTB区可以磷酸酪氨酸依赖或不依赖的形式与多种多肽结合，因而可发挥从受体信号转导到蛋白靶向的多种功能；SAM-PNT区能介导同源或异源寡聚化和特定的蛋白-蛋白相互作用，在不同PH值条件下SH3区可呈现晶体结构(二聚体)或单体 结构，分别起“关闭”和“开启”信号的作用，调控蛋白-蛋白相互作用。EpsS包括2个功能区，分别为表皮生长因子受体(EGFR)结合区和C末端效应器区。前者可能起介导EPS8和基于EPS8的复合物结合至EGFR的作用，从而促进信号传递；后者可激活Sosl (Ras和Rac蛋白的双重鸟嘌呤核苷酸交换因子)，从而直接作用于丝状肌动蛋白。因而，Eps8通过形成蛋白复合物Eps8_Abil (E3bl)-Sosl,参与Rac引导的肌动蛋白重组而影响细胞膜的流动、伪足生成及细胞的增殖活性，在细胞粘附和运动中起重要作用。另外Funato等研究发现IRSp53/Eps8复合物通过上调Rac使癌症细胞迁移/侵袭能力提高。Rac亚家族是GTP酶Rho家族成员，在细胞的粘附和运动中起重要作用。Rac有促使⑶34+细胞向骨髓基质细胞迁移的能力。Gao等研发一种Rac抑制剂(NSC23766)明显阻止小鼠模型中白血病的进展及CD34+的克隆增殖。近年来，针对人类自身蛋白的单克隆抗体在治疗急、慢性疾病的过程中显示出了良好的效果。但是，造价的昂贵和使用上的不便限制了单克隆抗体的广泛应用，因此，由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对人类自身蛋白的主动免疫疫苗，既用主动免疫的治疗方式替代被动免疫，成为蛋白药物的发展方向。目前，治疗性疫苗的研究已成为一个热点，涉及很多疾病，如慢性病毒感染、过敏、肿瘤、阿尔海默茨病、糖尿病、高血压、肥胖症以及风湿性关节炎等。治疗性免疫使人的免疫系统发生有利于患者的反应。大部分的免疫可分为两大类一类是诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体另一类是诱导机体发生细胞免疫反应，产生细胞毒性T细胞(CTLs)。后一类治疗性疫苗主要用于肿瘤和病毒感染性疾病的治疗。绝大多数的预防性疫苗都是通过诱导抗体的产生来保护机体的，这就证明通过诱导抗体治疗感染性疾病是一种有效的治疗方法。与预防性疫苗相比，治疗性疫苗的发展就要缓慢的多，直到近几年治疗性疫苗才看到成功的希望。同时，单克隆抗体在治疗疾病方面所取得的巨大成功预示着能够在体内诱导抗体产生的治疗性疫苗有着广阔的发展前景。实际上，已经有动物试验表明诱导出一定水平的内源性特异性抗体来治疗疾病是可能的，如阻断TNF-α单克隆抗体已经被证明在治疗类风湿性关节炎和Crohns病方面十分有效。目前已经有几种TNF-Ad阻断剂上市,包括两种单克隆抗体(infliximab,adalimumab)和一种阻断剂(etanercept),它们正在帮助成千上万的病人减轻痛苦,年收益达到20亿美元。在动物试验中已经证实,通过主动免疫可以特异性诱导出TNF-α的中和性抗体，诱导的抗体滴度足以治疗动物关节炎模型。其他的动物试验表明可以通过诱导体内产生高滴度抗体来治疗以下疾病针对血管紧张素的疫苗可以治疗高血压；针对IL-9的疫苗可以治疗病原体引起的嗜酸性细胞增多症；针对IL-5的疫苗可以治疗哮喘；针对N-methyl-D-aspartate receptor-1 (NMDARI)的疫苗可以治疗中风。另外，针对一些性激素如人绒毛促性腺激素(human chorionic-pinHCG)的免疫可以降低妇女体内的激素水平而达到避孕效果；针对促性腺素释放激素(GnRH)的疫苗可以用于治疗晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治疗性疫苗诱导出针对胃泌素(gastrin)的抗体可以延长病人的生命。EpsS蛋白在乳腺癌、宫颈癌、甲状腺鳞癌、胰腺癌、表皮鳞癌及转移癌组织中异常 高表达。我们选用研制肿瘤疫苗的氨基酸序列具有良好的免疫原性，且EPS8在恶性肿瘤细 胞中异常高表达，在健康正常组织细胞中微量表达。此段EPS8氨基酸序列较好的作为肿瘤疫苗研发的祀点。仅仅选择了靶分子构建一种自身蛋白的治疗性疫苗还需要诱导自身免疫系统产生针对自身蛋白的抗体。要产生足够高滴度的特异性抗体以治疗相关疾病，治疗性疫苗必须克服三个障碍τ细胞耐受、B细胞耐受、在没有佐剂和抗原长效抑制的情况下诱导出抗体。众所周知，人体免疫系统主要是对外来入侵者发动攻击的，而对机体本身是不攻击的，这可能是由于机体具有能够识别“非我”与“自我”的能力。免疫系统的这种特异性通常被称为耐受或无反应性。对许多抗原来说，在发生T细胞耐受的同时，正常的B细胞株却在体内存在。实际上，有三种机制导致了免疫耐受细胞株剔除，即特异性的淋巴细胞从淋巴细胞群中被彻底剔除；免疫无能，即特异性的淋巴细胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴细胞存在，但是由于没有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不能被激活。对T细胞来说，诱导免疫耐受和免疫无能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但诱导免疫耐受也可以在外周进行。B细胞耐受主要在骨髓中诱导，但也可以在外周诱导。通常，对于普遍表达的抗原的免疫耐受更容易阐明。在针对外来抗原的免疫反应中,T细胞和B细胞互相配合有效地产生抗体当受到外来抗原刺激时，特异性B细胞结合抗原，产生起始的激活信号。另外，B细胞内吞抗原，在其表面呈现抗原肽和MHC II类分子和复合物。通常，B细胞不能激活Th细胞。要激活Th细胞，树突状细胞是必不可少的，树突状细胞摄取抗原，并在其细胞表面呈递抗原肽和MHC II类分子的复合物，激活Th细胞。激活后的Th细胞识别B细胞表面呈递的抗原肽和MHC II类分子的复合物，引起B细胞增殖、抗体的产生以及抗体类别的转换。如果因为免疫耐受而缺乏Th细胞的协同作用，那么就不会产生抗体。在针对自身蛋白的疫苗的设计过程中，如果将自身抗原与外源蛋白或多肽载体融合或偶联在一起，就是可能绕过Th细胞耐受自身抗原特异的B细胞就能够摄取该自身抗原以及与其相连的载体蛋白，并在其表面呈递载体肽与MHC II类分子的复合物，由于Th细胞对载体蛋白没有免疫耐受，所以能够被激活，从而协同抗原特异性的B细胞产生针对自身抗原的特异性抗体。
与T细胞耐受相比，B细胞耐受更普遍。实际上，在许多情况下，自身特异性B细胞在体内以正常的频率出现，如果受到抗原和Th细胞的共同作用就会被激活。所以对许多可溶性自身蛋白来讲，体内存在其特异性B细胞株，尤其当这种蛋白微量表达的时候更是这样。对于这类蛋白或多肽，将其与载体蛋白相连，绕过T细胞耐受，就有可能产生有效的疫苗。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种重组小鼠EPS8肿瘤疫苗，该疫苗能够延长4T1荷瘤小鼠的生存时间，抑制小鼠体内4T1乳腺癌细胞的增殖。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种重组小鼠EPS8肿瘤疫苗，序列为Pro Pro Met Leu AsnPhe Met Gly Ala Pro Thr GluGln Asp Met Tyr151015 Gln Leu Ala Glu SerVal Ala Asn Ala Glu His GlnArg Lys Gln Asp202530Ser Lys Arg Leu SerThr Glu His Ser Asn Val SerAsp Tyr Pro Pro354045Ala Asp Gly Tyr AlaTyr Ser Ser Ser Met Tyr HisArg Gly Pro His505560Ala Asp His Gly GluAla Ala Met Pro Phe Lys SerThr Pro Asn His65707580Gln Val Asp Arg AsnTyr Asp Ala Val Lys Thr GlnPro Lys Lys Tyr859095Ala Lys Ser Lys TyrAsp Phe Val Ala Arg Asn SerSer Glu Leu Ser100105110Val Met Lys Asp AspVal Leu Glu He Leu Asp AspArg Arg Gln Trp115120125Trp Lys Val Arg AsnAla Ser Gly Asp Ser Gly PheVal Pro Asn Asn130135140He Leu Asp He MetArg Thr Pro Glu Ser Gly ValGly Arg Ala Asp145150155160Pro Pro Tyr Thr HisThr He Gln Lys Gln Arg ThrGlu Tyr Gly Leu165170175Arg Ser Ala Asp ThrPro Ser Ala Pro Ser Pro ProPro Thr Pro Ala180185190Pro Val Pro Val ProLeu Pro Pro Ser Val Pro AlaPro Val Ser Val195200205Pro Lys Val Pro AlaAsp Val Thr Arg Gln Asn SerSer Ser Ser Asp210215220Ser Gly Gly Ser HeVal Arg Asp Ser Gln Arg TyrLys Gln Leu Pro
225230235240Val Asp Arg Arg Lys Ser Gln Met Glu Glu Val Gln Asp Glu Leu Phe245250255Gln Arg Leu Thr He Gly Arg Ser Ala Ala Gln Arg Lys Phe His。260265270重组小鼠EPS8肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤
(I)重组小鼠rmHiS-EpS8基因的克隆及原核表达载体的构建采用RT-PCR方法获得EpsS第一个胞外区基因片段(第440位氨基酸至第710位氨基酸)，插入pET28a原核表达载体，转入大肠杆菌BL21，在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到rmHis-Eps8蛋白(“rmHis”是recombinant mouse Hisdinine,即重组小鼠组氨酸的意思,是将小鼠Eps8基因利用基因工程技术进行重新组合，并用组氨酸进行标记)。(2)重组蛋白表达将构建好的pET28a_EPS8重组质粒转化大肠杆菌BL21，在大肠杆菌BL21中获得高效表达后，经Ni-NTA柱亲和层析纯化后，得到rmHiS-EpS8蛋白。(3)融合蛋白的提取和纯化表达产物经裂菌、Ni-NTA柱亲和层析纯化、超滤柱浓缩蛋白，蛋白纯度可达95%以上。具体地包括以下步骤(I)重组小鼠rmHiS-EpS8基因的克隆及原核表达载体的构建按照GeneBank的小鼠EpsS的基因片段，采用RT-PCR常规方法设计引物，上游引Λ BamHI酶切位点，下游引入Sail酶切位点获得Eps8 440aa_710aa，插入pET28a原核表达载体。连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，挑取单克隆菌培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，进行测序；测序正确的质粒命名为pET28a-rmHis_EPS8工程菌命名为pET28a-rmHis-EPS8/BL21其特异性氨基酸序列为ProPro Met Leu Asn Phe Met Gly Ala Pro Thr GluGln Asp MetTyrI51015Gln Leu Ala Glu Ser Val Ala Asn Ala Glu His Gln Arg Lys Gln Asp202530Ser Lys Arg Leu Ser Thr Glu His Ser Asn Val Ser Asp Tyr Pro Pro354045Ala Asp Gly Tyr Ala Tyr Ser Ser Ser Met Tyr His Arg Gly Pro His505560Ala Asp His Gly Glu Ala Ala Met Pro Phe Lys Ser Thr Pro Asn His65707580Gln Val Asp Arg Asn Tyr Asp Ala Val Lys Thr Gln Pro Lys Lys Tyr859095Ala Lys Ser Lys Tyr Asp Phe Val Ala Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ser100105110Val Met Lys Asp Asp Val Leu Glu He Leu Asp Asp Arg Arg Gln Trp
115120125Trp Lys Val Arg Asn Ala Ser Gly Asp Ser Gly Phe Val Pro Asn Asn130135140He Leu Asp He Met Arg Thr Pro Glu Ser Gly Val Gly Arg Ala Asp145150155160Pro Pro Tyr Thr His Thr He Gln Lys Gln Arg Thr Glu Tyr Gly Leu165170175Arg Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro Pro Thr Pro Ala 180185190Pro Val Pro Val Pro Leu Pro Pro Ser Val Pro Ala Pro Val Ser Val195200205Pro Lys Val Pro Ala Asp Val Thr Arg Gln Asn Ser Ser Ser Ser Asp210215220Ser Gly Gly Ser He Val Arg Asp Ser Gln Arg Tyr Lys Gln Leu Pro225230235240Val Asp Arg Arg Lys Ser Gln Met Glu Glu Val Gln Asp Glu Leu Phe245250255Gln Arg Leu Thr He Gly Arg Ser Ala Ala Gln Arg Lys Phe His。260265270(2)重组蛋白表达挑取工程菌单菌落接种于5ml含Kana (终浓度为50 μ g/ml)的LB培养液中，37°C摇床过夜，次日以I : 100的比例转接到含Kana的LB培养液中，在37°C摇床培养4h至对数生长中期(0D600为0. 4-0. 6)，加入IPTG(终浓度为lmmol/L)，继续培养4h，离心收取菌体。表达产物鉴定SDS-PAGE 电泳将IPTG诱导前的菌液、诱导后的菌液、纯化时的洗脱液及纯化后的蛋白液各30 μ I分别加入30 μ I 2 X上样缓冲液混匀，煮沸5min，12000rpm离心5min，取10 μ L上清加样于5%浓缩胶12%分离胶，上样后电压为60V15min，进入分离胶后电压调整为100V1. 5-2. Oh,电泳结束后用0. 5%考马斯亮蓝R-250震荡染色，脱色至背景清晰后制备干
胶保存。免疫印迹反应将提取纯化的蛋白液按BCA法测定蛋白浓度，根据浓度调整上样量，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将电泳凝胶转膜(转膜液25mmol/L Tris、192nmol/L甘氨酸、20%甲醇)，100V恒压2h，电转移将蛋白由凝胶转移至NC膜上(硝酸纤维素膜)，TBST缓冲液洗涤三次后，加入5%脱脂奶粉室温封闭lh，TBST缓冲液洗涤三次，加山羊抗小鼠EPS8，37°C孵育4h，TBST缓冲液洗涤三次，加兔抗山羊IgG-HRP 二抗，37°C孵育lh，TBST缓冲液洗涤三次，TBS缓冲液洗涤三次，于暗室中加入ECL显色液进行显影定影反应，观察结果。(3)融合蛋白的提取和纯化取含pET28a-EPS8重组质粒的菌株大量诱导菌液，4°C,，8000rpm,离心5min,收菌，冰浴条件下超声裂菌，40C，IOOOOrpm,离心30min，收集上清液。取Ni-NTA亲和层析柱，将柱中20%乙醇倒出，用水洗柱子20次，双蒸水洗20次，加入约500微升的5%Ni-NTA (量可根据蛋白量而定)，随后用Lysis Buffer加满柱子,拔下下面盖子,待Lysis Buffer全部流出后，加入菌裂解液的上清，用Lysis Buffer填满，盖好盖子，缓慢摇匀，4°C，IOOrpm振摇l-2h。取出柱子,打开出口，弃去流出液,用4-8ml wash buffer洗柱2次,弃去流出液，用约Iml elution buffer洗脱蛋白4次,用EP管收集洗脱液待用。取出超滤柱,倒出其中的PBS，加入洗脱蛋白液，40C，4000rpm,离心30min，弃去离心管的废液，超滤柱中加满PBS，4°C，4000rpm，离心30min。重复三次，用加样枪吸出超滤柱中液体，即为EPS8蛋白液。采用BCA法测定蛋白浓度。所需试剂配制Lysis Buffer :准确称取 6. 90g NaH2PO4 · 12H20，17. 54g NaCl 和 O. 68g 咪唑，溶解于双蒸水中，调PH至8. O。·Wash Buffer :准确称取 6. 90g NaH2PO4 · 12H20,17. 54g NaCl 和 I. 36g 咪唑，溶解于双蒸水中，调PH至8. O。Elution Buffer :准确称取 6. 90g NaH2PO4 · 12H20,17. 54g NaCl 和 17. OOg 咪唑，溶解于双蒸水中，调PH至8. O。动物模型实验小鼠分组与免疫方案(I)分组将16只BABL/c雌性小鼠随机分2组佐剂对照组和EPS8疫苗组，每组8只。(2)免疫乳剂制备A. EPS8疫苗组将rmHiS-EpS8按需要量与等体积完全/不完全弗氏佐剂混合，用5mL—次性注射器不断推吸直到二者混合成稳定乳剂；B.佐剂对照组将PBS溶液与等体积完全/不完全弗氏佐剂混合制成乳剂，方法同EPS8疫苗组。(3)免疫途径颈背部及掌心皮下多点注射。(4)注射剂量EPS8疫苗组小鼠rmHiS-EpS8蛋白用量为100 μ g/只注射，佐剂对照组每只小鼠按与EPS8疫苗组小鼠同等剂量注射。(5)免疫程序1周I次，共3次。①EPS8疫苗组第I次注射完全弗氏佐剂rmHiS-EpS8乳剂，第2和第3次注射不完全弗氏佐剂rmHis-Eps8乳剂；②佐剂对照组第I次注射完全弗氏佐剂PBS乳剂，第2和第3次注射不完全弗氏佐剂PBS乳剂。间接Elisa法检测抗EPS8特异性抗体效价两组小鼠分别于免疫前、免疫I次、免疫2次和免疫3次后一周颊部取血,收集抗血清。通过间接Elisa法检测抗EPS8特异性抗体效价。每个样品均设三个复孔。Elisa实验方法如下所需溶液的配置a.包被缓冲液(O. 05M碳酸盐缓冲液pH 9. 6)Na2C03L59g，NaHC032.93g，超纯水定容至lOOOmL，有效期两周。b.封闭液(5%脱脂奶粉):脱脂奶粉5. 0g，超纯水定容至100mL。c.洗涤缓冲液(0. 05%PBST) 0. 5mL Tween-20加入IOOOmLPBS中混合均匀。d.稀释液PBS。e.底物缓冲液A液(0. IM柠檬酸水溶液)C6H807 *H20 21. Olg，超纯水定容至IOOOmL ;B液(O. 2M磷酸氢二钠水溶液)Na2HP04 · 12H20 71. 60g，超纯水定容至 IOOOmL0 A 液、B 液、超纯水按 24. 3:25. 7:50 的体积比混合即为底物缓冲液，4°C贮存。f.底物显色液TMB 0. 5mg,30%H20210yL, IOml底物缓冲液。h.终止液2M H2S04。操作方法包被取纯化的EPS8蛋白用包被缓冲液稀释成浓度为10μ g/ml，加入96孔酶标板,100 μ I/孔，4°C过夜。次日弃去孔中溶液,用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4min，加入封闭液，37°C温育lh，弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4min。加样每孔分别加入倍比稀释的抗血清，100 μ I/孔37°C温育lh，然后用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4min ;加入1:2000 稀释的 HRP goat anti-mouse 羊抗鼠二抗，100 μ I/孔，37°C温育 O. 5h,弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4min ;加入底物显色液，100 μ I/孔，37°C温育10_30min ;加入2M H2S04, 50 μ I/ 孔，酶标仪 450nm 测 OD 值。 抑瘤实验实验细胞培养小鼠乳腺癌4T1细胞株来源于中国科学院上海生命科学院，由本实验室培养，保存。培养体系为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，37°C、5%C02培养箱中培养。动物免疫将32只4-6周龄雌性BABL/c小鼠，16_18g，按随机分组法分为4组EPS8疫苗I组、EPS8疫苗2组、佐剂对照I组和佐剂对照2组，每组8只。制备免疫乳剂A. EPS8疫苗I组和EPS8疫苗2组将EPS8按需要量与等体积完全/不完全弗氏佐剂混合制成稳定乳剂；B.佐剂对照I组和佐剂对照2组将PBS溶液与等体积完全/不完全弗氏佐剂混合制成乳齐U，每组小鼠分别颈背部及掌心皮下多点注射，EPS8疫苗组小鼠EPS8蛋白用量为100 μ g/只注射，佐剂对照组每只小鼠按与EPS8疫苗组小鼠同等剂量注射。I周I次，共3次。建立肿瘤模型常规方法培养乳腺癌细胞4T1细胞，于小鼠第三次免疫7天后，皮下接种4T1细胞，接种部位为右腋下，接种细胞数量为7 X IO6个/只。动态观察EPS8疫苗I组和佐剂对照I组肿瘤形成情况，肿瘤形成后每3天用游标卡尺测量肿瘤的最大直径(a)和最小半径
(b)，计算小鼠肿瘤体积，并记录小鼠生存期。EPS8疫苗2组和佐剂对照2组小鼠在接种肿瘤后第28天处死，剥离肿瘤称重，比较两组小鼠肿瘤重量差异。与现有技术相比，本发明的优点在于所得疫苗能够延长4T1荷瘤小鼠的生存时间，抑制小鼠体内4T1乳腺癌细胞的增殖，为临床上对于难治复发性恶性肿瘤的治疗提高新的策略，以减轻乳腺癌、宫颈癌、甲状腺鳞癌、胰腺癌、表皮鳞癌及转移癌免疫治疗中手术切除复发率高、化疗和放疗毒副作用强以及单抗治疗费用高等问题。


图I为重组表达质粒pET28a-rmHis_EPS8的酶切鉴定(目的片段大小约801bp)的电泳图。图2是鉴定EPS8的表达的SDS-PAGE电泳图。图3是EPS8蛋白表达与纯化的免疫印迹鉴定的电泳图。
图4是荷4T1乳腺癌小鼠肿瘤体积生长曲线图。图5是荷4T1乳腺癌小鼠生存期曲线图。图6是荷4T1乳腺癌小鼠肿瘤重量图。
具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。一、本发明所提供的重组小鼠EPS8肿瘤疫苗(pET28a-rmHis-EPS8)，其氨基酸序列为Pro Pro Met Leu Asn Phe Met Gly Ala Pro Thr Glu Gln Asp Met Tyr151015Gln Leu Ala Glu Ser Val Ala Asn Ala Glu His Gln Arg Lys Gln Asp202530Ser Lys Arg Leu Ser Thr Glu His Ser Asn Val Ser Asp Tyr Pro Pro354045Ala Asp Gly Tyr Ala Tyr Ser Ser Ser Met Tyr His Arg Gly Pro His505560Ala Asp His Gly Glu Ala Ala Met Pro Phe Lys Ser Thr Pro Asn His65707580Gln Val Asp Arg Asn Tyr Asp Ala Val Lys Thr Gln Pro Lys Lys Tyr859095Ala Lys Ser Lys Tyr Asp Phe Val Ala Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ser100105110Val Met Lys Asp Asp Val Leu Glu He Leu Asp Asp Arg Arg Gln Trp115120125Trp Lys Val Arg Asn Ala Ser Gly Asp Ser Gly Phe Val Pro Asn Asn130135140He Leu Asp He Met Arg Thr Pro Glu Ser Gly Val Gly Arg Ala Asp145150155160Pro Pro Tyr Thr His Thr He Gln Lys Gln Arg Thr Glu Tyr Gly Leu165170175Arg Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro Pro Thr Pro Ala180185190Pro Val Pro Val Pro Leu Pro Pro Ser Val Pro Ala Pro Val Ser Val195200205Pro Lys Val Pro Ala Asp Val Thr Arg Gln Asn Ser Ser Ser Ser Asp210215220Ser Gly Gly Ser He Val Arg Asp Ser Gln Arg Tyr Lys Gln Leu Pro225230235240Val Asp Arg Arg Lys Ser Gln Met Glu Glu Val Gln Asp Glu Leu Phe
245250255Gln Arg Leu Thr He Gly Arg Ser Ala Ala Gln Arg Lys Phe His。260265270二、上述重组小鼠EPS8肿瘤疫苗(pET28a-rmHis_EPS8)制备方法，依次包括以下步骤I.重组小鼠rmHiS-EpS8基因的克隆及原核表达载体的构建采用RT-PCR方法获得Eps8第一个胞外区基因片段(第440位氨基酸至第710位氨基酸)，插入pET28a原核表达载体，转入大肠杆菌BL21，在大肠杆菌中获得高效表达，挑取单克隆培养过夜，经酶切后获得预期大小的插入片段(如图I所示)经纯化后得到rmHis-Eps8蛋白。测序正确的质粒命名为pET28a-rmHis_EPS8。工程菌命名为 pET28a-rmHiS-EPS8/BL2I。2.重组蛋白表达挑取工程菌单菌落接种于5ml含Kana (终浓度为50 μ g/ml)的LB培养液中，37°C摇床过夜，次日以I : 100的比例转接到含Kana的LB培养液中，在37°C摇床培养4h至对数生长中期(0D600为O. 4-0. 6)，加入IPTG(终浓度为lmmol/L)，继续培养4h，离心收取菌体。对上述的表达产物鉴定①SDS-PAGE 电泳将IPTG诱导前的菌液、诱导后的菌液、纯化时的洗脱液及纯化后的蛋白液各30 μ I分别加入30 μ I 2 X上样缓冲液混匀，煮沸5min，12000rpm离心5min，取10 μ L上清加样于5%浓缩胶12%分离胶，上样后电压为60V15min，进入分离胶后电压调整为100V1. 5-2. Oh,电泳结束后用O. 5%考马斯亮蓝R-250震荡染色，脱色至背景清晰后制备干胶保存(参见图2)。②免疫印迹反应将提取纯化的蛋白液按BCA法测定蛋白浓度，根据浓度调整上样量，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将电泳凝胶转膜(转膜液25mmol/L Tris、192nmol/L甘氨酸、20%甲醇)，100V恒压2h，电转移将蛋白由凝胶转移至NC膜上(硝酸纤维素膜)，TBST缓冲液洗涤三次后，加入5%脱脂奶粉室温封闭lh，TBST缓冲液洗涤三次，加山羊抗小鼠EPS8，37°C孵育4h，TBST缓冲液洗涤三次，加兔抗山羊IgG-HRP 二抗，37°C孵育lh，TBST缓冲液洗涤三次，TBS缓冲液洗涤三次，于暗室中加入ECL显色液进行显影定影反应，观察结果(参见图3)。③融合蛋白的提取和纯化取含pET28a-EPS8重组质粒的菌株大量诱导菌液，4°C,，8000rpm,离心5min,收菌，冰浴条件下超声裂菌，40C，IOOOOrpm,离心30min，收集上清液。取Ni-NTA亲和层析柱，将柱中20%乙醇倒出，用水洗柱子20次，双蒸水洗20次，加入约500微升的5%Ni-NTA (量可根据蛋白量而定)，随后用Lysis Buffer加满柱子,拔下下面盖子,待Lysis Buffer全部流出后，加入菌裂解液的上清，用Lysis Buffer填满，盖好盖子，缓慢摇匀，4°C，IOOrpm振摇l-2h。取出柱子,打开出口，弃去流出液,用4-8ml wash buffer洗柱2次,弃去流出液，用约Iml elution buffer洗脱蛋白4次,用EP管收集洗脱液待用。取出超滤柱,倒出其中的PBS，加入洗脱蛋白液，40C，4000rpm,离心30min，弃去离心管的废液，超滤柱中加满PBS，4°C，4000rpm，离心30min。重复三次，用加样枪吸出超滤柱中液体，即为EPS8蛋白液。采用BCA法测定蛋白浓度(参见图2)。三、动物模型实验I.小鼠分组与免疫方案(I)分组将16只BABL/c雌性小鼠随机分2组佐剂对照组和EPS8疫苗组，每组8只。(2)免疫乳剂制备A. EPS8疫苗组将rmHis-Eps8按需要量与等体积完全/不完全弗氏佐剂混合，用5mL —次性注射器不断推吸直到二者混合成稳定乳剂；B.佐剂对照组将PBS溶液与等体积完全/不完全弗氏佐剂混合制成乳剂，方法同EPS8疫苗组。(3)免疫途径颈背部及掌心皮下多点注射。 (4)注射剂量EPS8疫苗组小鼠rmHiS-EpS8蛋白用量为100 μ g/只注射，佐剂对照组每只小鼠按与EPS8疫苗组小鼠同等剂量注射。(5)免疫程序1周I次，共3次。①EPS8疫苗组 第I次注射完全弗氏佐剂rmHis-Eps8乳剂，第2和第3次注射不完全弗氏佐剂rmHis-Eps8乳剂；②佐剂对照组第I次注射完全弗氏佐剂PBS乳剂，第2和第3次注射不完全弗氏佐剂PBS乳剂。2.间接Elisa法检测抗EPS8特异性抗体效价两组小鼠分别于免疫前、免疫I次、免疫2次和免疫3次后一周颊部取血,收集抗血清。通过间接Elisa法检测抗EPS8特异性抗体效价。每个样品均设三个复孔。Elisa实验方法如下(I)所需溶液的配置a.包被缓冲液(O. 05M碳酸盐缓冲液pH 9. 6) Na2C03
I.59g, NaHC03 2. 93g，超纯水定容至lOOOmL，有效期两周。b.封闭液(5%脱脂奶粉)脱脂奶粉5. Og,超纯水定容至IOOmL0 c.洗涤缓冲液(O. 05%PBST) :0. 5mL Tween-20加入IOOOmLPBS中混合均匀。d.稀释液PBS。e.底物缓冲液A液(O. IM柠檬酸水溶液)C6H807 *H20 21. Olg，超纯水定容至IOOOmL ;B液(O. 2M磷酸氢二钠水溶液)Na2HP04 · 12H20 71. 60g，超纯水定容至 IOOOmL0 A 液、B 液、超纯水按 24. 3:25. 7:50 的体积比混合即为底物缓冲液，4°C贮存。f.底物显色液TMB 0. 5mg, 30%H202 10 μ L，IOml底物缓冲液。h.终止液2M H2S04。(2)操作方法包被取纯化的EPS8蛋白用包被缓冲液稀释成浓度为10μ g/ml，加入96孔酶标板,100 μ I/孔，4°C过夜。次日弃去孔中溶液,用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4min，加入封闭液，37°C温育lh，弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4min。加样每孔分别加入倍比稀释的抗血清，100 μ I/孔37°C温育lh，然后用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4min ;加入1:2000 稀释的 HRP goat anti-mouse 羊抗鼠二抗，100 μ I/孔，37°C温育 0. 5h,弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4min ;加入底物显色液，100 μ I/孔，37°C温育10_30min ;加入2M H2S04, 50 μ I/ 孔，酶标仪 450nm 测 OD 值。3.抑瘤实验(I)实验细胞培养
小鼠乳腺癌4T1细胞株来源于中国科学院上海生命科学院，由本实验室培养，保存。培养体系为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，37°C、5%C02培养箱中培养。(2)动物免疫将32只4-6周龄雌性BABL/c小鼠，16_18g，按随机分组法分为4组EPS8疫苗I组、EPS8疫苗2组、佐剂对照I组和佐剂对照2组，每组8只。制备免疫乳剂A. EPS8疫苗I组和EPS8疫苗2组将EPS8按需要量与等体积完全/不完全弗氏佐剂混合制成稳定乳剂；B.佐剂对照I组和佐剂对照2组将PBS溶液与等体积完全/不完全弗氏佐剂混合制成乳齐U，每组小鼠分别颈背部及掌心皮下多点注射，EPS8疫苗组小鼠EPS8蛋白用量为100 μ g/只注射，佐剂对照组每只小鼠按与EPS8疫苗组小鼠同等剂量注射。I周I次，共3次。(3)建立肿瘤模型常规方法培养乳腺癌细胞4T1细胞，于小鼠第三次免疫7天后，皮下接种4T1细 胞，接种部位为右腋下，接种细胞数量为7 X IO6个/只。动态观察EPS8疫苗I组和佐剂对照I组肿瘤形成情况，肿瘤形成后每3天用游标卡尺测量肿瘤的最大直径(a)和最小半径
(b)，计算小鼠肿瘤体积(参见图4)，并记录小鼠生存期(参见图5)。EPS8疫苗2组和佐剂对照2组小鼠在接种肿瘤后第28天处死，剥离肿瘤称重，比较两组小鼠肿瘤重量差异(参见图6)。四、综上所述，本发明的效果如下①设计并构建了 EPS8融合蛋白疫苗。②通过动物实验证实rmEPS8融合蛋白能够在荷瘤小鼠体内诱导出高滴度中和抗体1:320以上。③该抗体(抗rmEPS8多克隆抗体)可以与小鼠4T1细胞相结合。④该蛋白作为肿瘤疫苗可以抑制小鼠体内乳腺癌4T1细胞的生长。
权利要求
1.一种重组小鼠EPS8肿瘤疫苗，其特征在于含有如下氨基酸序列的蛋白质Pro Pro Met Leu Asn Phe Met Gly Ala Pro Thr Glu Gln Asp Met Tyr151015Gln Leu Ala Glu Ser Val Ala Asn Ala Glu His Gln Arg Lys Gln Asp202530Ser Lys Arg Leu Ser Thr Glu His Ser Asn Val Ser Asp Tyr Pro Pro354045Ala Asp Gly Tyr Ala Tyr Ser Ser Ser Met Tyr His Arg Gly Pro His505560Ala Asp His Gly Glu Ala Ala Met Pro Phe Lys Ser Thr Pro Asn His65707580Gln Val Asp Arg Asn Tyr Asp Ala Val Lys Thr Gln Pro Lys Lys Tyr859095Ala Lys Ser Lys Tyr Asp Phe Val Ala Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ser100105110 Val Met Lys Asp Asp Val Leu Glu He Leu Asp Asp Arg Arg Gln Trp115120125Trp Lys Val Arg Asn Ala Ser Gly Asp Ser Gly Phe Val Pro Asn Asn130135140 He Leu Asp He Met Arg Thr Pro Glu Ser Gly Val Gly Arg Ala Asp 145150155160Pro Pro Tyr Thr His Thr He Gln Lys Gln Arg Thr Glu Tyr Gly Leu165170175Arg Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro Pro Thr Pro Ala180185190Pro Val Pro Val Pro Leu Pro Pro Ser Val Pro Ala Pro Val Ser Val195200205Pro Lys Val Pro Ala Asp Val Thr Arg Gln Asn Ser Ser Ser Ser Asp210215220 Ser Gly Gly Ser He Val Arg Asp Ser Gln Arg Tyr Lys Gln Leu Pro 225230235240Val Asp Arg Arg Lys Ser Gln Met Glu Glu Val Gln Asp Glu Leu Phe245250255 Gln Arg Leu Thr He Gly Arg Ser Ala Ala Gln Arg Lys Phe His0260265270
2.权利要求I所述的重组小鼠EPS8肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤 重组小鼠rmHis-Eps8基因的克隆及原核表达载体的构建采用RT-PCR方法获得Eps8第一个胞外区第440位氨基酸至第710位氨基酸的基因片段，插入pET28a原核表达载体，转入大肠杆菌BL21，在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化和超滤柱浓缩蛋白后得到重组小鼠组氨酸标记的EpsS基因蛋白，该蛋白含有权利要求I所述的氨基酸序列。
3.权利要求I所述的重组小鼠EPS8肿瘤疫苗在制备肿瘤药剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种重组小鼠EPS8肿瘤疫苗，本发明还公开了该疫苗的制备方法，包括如下步骤重组小鼠rmHis-Eps8基因的克隆及原核表达载体的构建采用RT-PCR方法获得Eps8第一个胞外区第440位氨基酸至第710位氨基酸的基因片段，插入pET28a原核表达载体，转入大肠杆菌BL21，在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化和超滤柱浓缩蛋白后得到。所得疫苗能够延长4T1荷瘤小鼠的生存时间，抑制小鼠体内4T1乳腺癌细胞的增殖，为临床上对于难治复发性恶性肿瘤的治疗提供新的策略。
文档编号C12N15/12GK102793913SQ201210274620
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者李玉华, 李超, 胡亮杉, 贺艳杰, 王磊 申请人:南方医科大学珠江医院