专利名称：一种利用重组基因工程菌获得链霉菌胰蛋白酶酶原的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用重组基因工程菌获得链霉菌胰蛋白酶酶原的方法与应用，特别是一种高产胰蛋白酶酶原的基因工程菌及构建方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术：
链霉菌胰蛋白酶(SGT) (E. C. 3. 4. 21. 4)是一种来源于灰色链霉菌的碱性丝氨酸蛋白酶，其在氨基酸编码基因结构上属于pre-pro-protease类型,而通过对灰色链霉菌的基因组测序发现编码SGT的基因SprT中，除去SGT自身信号肽和链霉菌活性胰蛋白酶，在其成熟酶N端还具有一段前导肽(-Ala-Pr0-Asn-Pr0-)(图I);通过前人对链霉菌胰蛋白酶在灰色链霉菌中的分泌，纯化，氨基酸测序以及相关生理生化功能的研究，发现在链霉菌气生菌丝和营养菌丝分化时，链霉菌胞外开始出现活性胰蛋白酶，纯化和氨基酸测序也仅 能获得活性的胰蛋白酶的信息，而带有前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原的活化和活化机理却未有见到报道，并且对于链霉菌胰蛋白酶酶原的获得也未有报道，因此建立获得在N端具有野生前导肽的胰蛋白酶酶原的方法，对于链霉菌胰蛋白酶酶原晶体结构的研究，以及其激活机理的研究具有至关重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种产胰蛋白酶酶原(trypsinogen)的基因工程菌，其特征在于染色体上携带有胰蛋白酶酶原(trypsinogen)基因(pmt)。所述胰蛋白酶酶原(trypsinogen)的基因序列为SEQ ID N0:1。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种胰蛋白酶酶原基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤，见图I :第一步链霉菌胰蛋白酶酶原基因的获得及分析首先，合成灰色链霉菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶基因其次，毕赤酵母(Pichia pastoris)的表达系统有着特殊的密码子偏好性,如果不对类胰蛋白酶基因要表达的密码子的进行一定的分析，毕赤酵母(Pichia pastoris)可能无法正确翻译类胰蛋白酶基因。通过胰蛋白酶酶原基因在毕赤酵母中进行表达的密码子适用指数(CAI)分析，发现在胰蛋白酶酶原基因中并无毕赤酵母无法识别及利用的稀有密码子，其次，在类胰蛋白酶基因上下游分别加入EcoRI限制性内切酶位点和NotI限制性内切酶位点，进行体外扩增类胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序列为SEQ ID NO: I ;第二步链霉菌胰蛋白酶酶原重组质粒的构建为了使pmt基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有醇氧化酶基因(AOX)的启动子AOXI的毕赤酵母表达载体(例如pPIC9K，美国Invitrogen公司)，利用pmt基因序列5'端的EcoR I限制性内切酶位点与3'端的Not I限制性内切酶位点，将pmt基因克隆入载体PPIC9K。由于在AOXI强启动子后面有一段α-因子信号肽序列，这也为类胰蛋白酶在酵母中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于PPIC9K载体中含有卡那霉素、氨苄青霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便。将含有pmt基因的载体与要连接的表达载体PPIC9K进行EcoRI和NotI酶切，连接得到含有pmt基因的重组质粒pPIC9K-pmt。第三步链霉菌胰蛋白酶酶原基因工程菌的构建将重组质粒pPIC9K_pmt电击转化宿主毕赤酵母GS115，构建高效表达胰蛋白酶酶原的组成型毕赤酵母重组菌株。本步骤采用的含胰蛋白酶酶原基因的重组表达质粒pPIC9K_pmt可转化毕赤酵母(Pichia pastoris),成为能分泌表达外源类胰蛋白酶的功能酵母菌由于含外源基因的重组表达质粒pPIC9K-pmt上有毕赤酵母AOX基因的部分序列，当重组表达质粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，pPIC9K-pmt可以定向整合到毕赤酵母染色体DNA上。在外源诱导 物甲醇存在的情况下，AOXI启动子启动外源pmt基因，信号肽指导表达产物进入毕赤酵母的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物分泌至胞外。毕赤酵母的转化常采用电激法或化学转化法首先接种活化后的毕赤酵母GS115 —环于25mLYPD液体培养基中，28°C 30°C振荡培养过夜，然后将上述培养液转入IOOmLYPD (500mL三角瓶)液体培养基中，28°C 30°C振荡培养，每隔Ih测定，培养直至菌体浓度0D600为I. 3 I. 5，在冰水中冷却IOmin以上，然后在4°C环境下，8000r/min离心收集菌体，用40mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置lOmin，如此重复步骤4三次，即无菌水洗涤3次，用300 μ L预冷lmol/L山梨醇悬浮细胞,从而获得受体菌。然后取50 80 μ L受体菌和5 90 μ g线性化重组表达质粒DNA混匀，电击(电压1500V :电容25 μ F ;电阻200 Ω )处理，然后涂布于卡那霉素(10 μ g/mL)抗性平板筛选重组子。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种胰蛋白酶酶原基因工程菌的应用方法。为解决上述技术问题，提供如下技术方案第一步重组菌株的筛选所述重组表达质粒pPIC9K_pmt上含有卡那霉素抗性基因，如果重组质粒已经整合到染色体上，重组菌株具有卡那霉素抗性，可在含有卡那霉素的平板上生长；涂布含卡那霉素G418抗性平板，挑取阳性转化子，对转化子进行PCR验证，阳性即为产胰蛋白酶酶原基因工程菌。第二步菌株经培养分泌胰蛋白酶酶原培养基组成(g/L):种子培养基蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5_15 ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12 15，生物素O. 0002 O. 0005,甲醇10 50 ;微量元素溶液，MnSO4 · 4H20100, ZnCl270, Na2MoO4 · 2H2035, H3B0360, CoCl2 · 6H20200,CuSO4 · 5H2029, NiCl2 · 6H2025, 37% 盐酸 0. 9mL。优选培养基组成(g/L ):种子培养基蛋白胨15g/L,酵母提取物8g/L,葡萄糖15g/L,氯化钠10g/L ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12 15g/L，生物素O. 0002 O. 0005g/L,甲醇10 50g/L ;微量元素溶液，MnSO4 · 4H20100g/L, ZnCl270g/L, Na2MoO4 · 2H2035g/L, H3B0360g/L, CoCl2 · 6H20200g/L, CuSO4 · 5H2029g/L, NiCl2 · 6H2025g/L, 37% 盐酸 0. 9mL。培养方法种子培养接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度28°C 30°C，摇床转速200r/min，培养24h ；发酵培养离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL的三角瓶(500mL)中，发酵温度30°C，摇床转速200r/min，发酵时间3 4天。胰蛋白酶酶原检测方法将诱导获得的胞外上清进行SDS-PAGE检测，并同空白宿主菌作对比，按照理论分 子量估算链霉菌胰蛋白酶酶原分子量约为25kDa左右(图3)，同空白对照相比在相应蛋白条带处出现的条带即表明链霉菌胰蛋白酶酶原的表达。有益效果本发明的优点在于构建了一株高效分泌表达胰蛋白酶酶原的毕赤酵母基因工程菌，解决了胰蛋白酶酶原无法从野生灰色链霉菌中获得的问题；应用该菌种生产类胰蛋白酶酶原，产量高、工艺简单、便于工业化应用，该菌株生产的目的蛋白直接分泌到胞外，提取过程简单，产品纯度高。本发明为生物法产蛋白酶酶原的研究、开发、生产工作奠定了基础，特别有利于早日实现野生胰蛋白酶酶原晶体结构研究的基础问题。
图I链霉囷膜蛋白酶如体组成结构不意2产胰蛋白酶酶原的基因工程菌整合质粒的构建图3链霉菌胰蛋白酶酶原的表达检测
具体实施例方式实施例I :胰蛋白酶酶原基因的获得胰蛋白酶酶原(Trypsinogen)的基因来源于灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中含胰蛋白酶酶原基因的编码序列(GenBank Accession No. M64471 )，其中第628位到第1307位是编码pmt的基因。在对基因进行密码子偏好性等分析后，在其5'端及3'端分别加上EcoRI和NotI酶切位点，SprT基因其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1，采用化学法进行全合成。实施例2 :含胰蛋白酶酶原基因(pmt)重组质粒pPIC9K_pmt的构建pmt基因体外扩增片段的和表达载体pPIC9K分别进行NotI和EcoRI双酶切，回收后用T4连接酶进行连接。连接反应体系为(IOyL):目的基因片断2 μ L，载体DNA2 μ L，10 X Τ4 连接酶 Bufferl μ L, T4DNA 连接酶 I μ L, ddH204 μ L。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下(I)无菌状态下取感受态细胞200 μ L置于无菌的微量离心管中；(2)每管加入I 2 μ L重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min ；(3)42°C热休克90sec (准确)，不要摇动离心管；(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却I 2min ；(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800 μ L ;
(6)用无菌铺菌器将200 μ L菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板,37°C平放20min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。实施例3 :胰蛋白酶酶原基因工程菌的构建将表达载体pPIC9K_pmt用SalI酶切线形化。酶切体系(50 μ L体系)重组质粒10 μ L, Buffer5 μ L, SalI3y L, ddH2032 y L0 37°C水浴 3h，用 PCR 产物纯化试剂盒对线形化产物进行纯化回收，电击法转化毕赤酵母GSl 15，具体方法如下(I)接种活化后的毕赤酵母GS115 —环于25mLYPD液体培养基中，28°C 30°C振荡培养过夜；
(2)将上述培养液转入IOOmLYPD (500mL三角瓶)液体培养基中，28°C 30°C振荡培养，每隔Ih测定，培养直至菌体浓度0D_为I. 3 I. 5 ;(3)在冰水中冷却IOmin以上；(4) 40C，8000r/min离心收集菌体，用40mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置IOmin ；(5)重复步骤4三次，即无菌水洗涤3次；(6)用300 μ L预冷lmol/L山梨醇悬浮细胞；(7)加入10 μ L线形化质粒，在冰水中混匀5min ；(8)放入冰预冷的无菌电转化杯(O. 2cm)中，在1500V，电击I 2次；(9)加入ImL预冷的lmol/L的山梨醇溶液；(10)取上述100 200 μ L涂布YNB平板(或离心涂布100 μ L)；(11)28°C 30°C倒置培养I 2天，挑选白色菌落。实施例4 :重组菌株的筛选I、酵母重组子的G418筛选接种转化子于25mLYPD液体培养基中，28°C 30°C振荡培养过夜，离心收集菌体，无菌水悬浮，取100 μ L分别涂布于含G418终浓度为O. 5、I. 0、2mg/mL的YPD平板培养基上，筛选转化子。2、双酶切验证提取转化子质粒，进行EcoRI和Nco I双酶切，对产物进行电泳验证。3、类胰蛋白酶酶活性测定(I)重组子和空载体pPIC9K转化的毕赤酵母GSl 15分别接种于20mLYPD液体培养基，30°C振荡培养过夜(稳定期)；(2)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入IOOmLMGY培养基(加入ImLlOO X生物素)中；30°C，200r/min 振荡培养 48h ；(3)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入30mL丽液体培养基(加入300 μ L甲醇，300 μ L100X生物素)中；30°C，200r/min振荡培养7天；定时进行酶活测定。胰蛋白酶酶原表达检测方法将诱导获得的胞外上清进行SDS-PAGE检测，并同空白宿主菌作对比，按照理论分子量估算链霉菌胰蛋白酶酶原分子量约为25kDa左右，同空白对照相比在相应蛋白条带处出现的条带即表明链霉菌胰蛋白酶酶原的表达
实施例5 :重组菌株的培养种子培养基蛋白胨15g/L,酵母提取物8g/L,葡萄糖15g/L,氯化钠10g/L ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12 15g/L，生物素O. 0002 O. 0005g/L,甲醇10 50g/L ;微量元素溶液，MnSO4 · 4H20100g/L, ZnCl270g/L, Na2MoO4 · 2H2035g/L, H3B0360g/L, CoCl2 · 6H20200g/L, CuSO4 · 5H2029g/L, NiCl2 · 6H2025g/L, 37% 盐酸 0. 9mL。培养方法种子培养接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度28°C 30°C，摇床转速200r/min，培养24h ；发酵培养离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液 量为50mL的三角瓶(500mL)中，发酵温度30°C，摇床转速200r/min，3 4天后，检测发酵液中胞外总蛋白含量从原来的140 μ g/mL，提高到表达胰蛋白酶酶原时的211 μ g/mL，总蛋白含量提高到原来的I. 5倍；经相同的纯化方法得到的胰蛋白酶酶原蛋白含量为28 μ g/mL，与表达成熟胰蛋白酶时纯化得到的胰蛋白酶时的15 μ g/mL相比，提高到原来的1.86倍。同直接表达成熟链霉菌胰蛋白酶相比，表达酶原可以降低胰蛋白酶对细胞的毒性，增加重组蛋白的产量，这为后续的胰蛋白酶酶原相关的基础研究奠定了基础虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.ー种利用重组基因工程菌获得链霉菌胰蛋白酶酶原的方法，其特征在于以重组基因工程菌毕赤酵母GSl 15为种子，活化后按10%的接种量接入发酵培养基中中，控制发酵温度300C，摇床转速200r/min，发酵3_4天，所述重组基因工程菌染色体上携带有胰蛋白酶酶原的基因。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶酶原的基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: I 所示。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤 第一歩化学全合成链霉菌属胰蛋白酶酶原基因； 第二歩将第一歩得到的类胰蛋白酶酶原基因片段与毕赤酵母常用表达载体PPIC9K双酶切、连接，得到含有胰蛋白酶酶原基因的重组质粒； 第三步将重组质粒电击转化宿主毕赤酵母GSl 15，构建高效表达胰蛋白酶酶原的组成型毕赤酵母重组菌株。
全文摘要
本发明公开了一种利用重组基因工程菌获得链霉菌胰蛋白酶酶原的方法，本发明通过化学全合成胰蛋白酶酶原基因连接到毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)染色体上，构建了一株高效分泌表达胰蛋白酶酶原的基因工程菌，发酵3～4天后，可得到链霉菌胰蛋白酶酶原的表达，解决了长期无法从野生灰色链霉菌中获得胰蛋白酶酶原的问题。应用该菌种生产胰蛋白酶酶原，产量高、工艺简单、便于基础中进行链霉菌晶体结构研究及其激活机理研究之用。
文档编号C12R1/84GK102851269SQ201210274589
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者陈坚, 令桢明, 堵国成, 康振, 李江华 申请人:江南大学