专利名称：检测单头烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测单头烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的试剂盒。
背景技术：
番爺黄化曲叶病毒(To mato yellow leaf curl virus,TYLCV)是引起番爺生产上一种毁灭性病害“番茄黄化曲叶病毒病”的重要毒源，已给我国的番茄生产造成了严重的经济损失。该病毒的传播介体为烟粉風(Bemisia tobaci Gennadius),烟粉風在作物和蔬菜以及杂草上发生十分普遍，危害十字花科、葫芦科、豆科、茄科、锦葵科等植物，为害的主要经济作物有棉花、烟草、番茄、甘薯等。烟粉虱经刺吸植物获毒后终生带毒。在保护地栽培条件下，烟粉虱在北方能够安全越冬并成周年发生，由于烟粉虱个体微小，繁殖能力强，且生产上难以根除，已成为导致番茄黄化曲叶病快速扩展和大流行的重要原因。检测烟粉虱是否带毒是进行番茄黄化曲叶病毒病预测和综合防治的关键技术和措施。在番茄黄化曲叶病毒病的综合防治中，使用无毒番茄幼苗和监测烟粉虱带毒情况是成功进行综合防治的关键，单头带毒的烟粉虱刺吸番茄植株即可造成病害，随即造成病害流行和大发生，给番茄生产造成毁灭性灾害，鉴于此，必须及时、快速、简便地对烟粉虱进行带毒检测，这就需要开发一种简单、快速、灵敏的检测方法用于单头烟粉虱是否携带TYLCV。目前检测烟粉虱是否携带TYLCV常见的有2种方法，一是分子生物学检测方法，主要是利用PCR方法，但PCR检测耗时，产物不便检测，操作繁琐，反应需要PCR仪和特殊试齐U，不适于生产一线使用。二是血清学检测方法，主要是ELISA方法，但ELISA的检测灵敏度上以及特异性不高，不适于快速准确检测。现有技术的不足主要有一是现有的引物不适于我国发生的TYLCV的检测，使得检测效率低，假阴性率高；二是目前的技术需要提取DNA，过程复杂，不易推广应用；三是现有技术不能适于单头烟粉虱简便快捷检测。近几年逐渐发展起来的环介导恒温扩增技术(Loop mediated isothermalamplification, LAMP)以快速高效、简便易行、灵敏特异等优势正在被用于病原微生物的检测工作中。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测番茄黄化曲叶病毒的环介导等温扩增引物组。本发明提供的引物组，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物组由引物I、引物2、引物3和引物4组成，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4的摩尔比具体为I :1 8 :8。本发明的另一个目的是提供一种检测番茄黄化曲叶病毒的环介导等温扩增试剂。
本发明提供的环介导等温扩增试剂，包括上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱和水。上述环介导等温扩增试剂还包括DNA聚合酶，所述环介导等温扩增试剂由上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、dNTPs、硫酸镁、DNA聚合酶、甜菜碱和水组成；所述引物I和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均具体为O. 2 μ mol/L,所述引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均具体为
I.6 μ mol/L。本发明的第三个目的是提供一种检测番茄黄化曲叶病毒的环介导等温扩增试剂
盒。 本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的环介导等温扩增试剂。上述的引物组、上述环介导等温扩增试剂或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测烟粉虱中是否携带番茄黄化曲叶病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述环介导等温扩增反应的温度为63_65°C，所述环介导等温扩增反应的时间为45-60分钟。上述检测和/或辅助检测待测烟粉虱中是否携带番茄黄化曲叶病毒为用上述环介导等温扩增试剂对待测烟粉虱进行环介导恒温扩增反应，检测环介导恒温扩增反应产物；所述检测环介导恒温扩增反应产物的方法为如下I)或2):I)将所述环介导恒温扩增反应产物中加入染色剂反应5min，得到染色后反应产物；若染色后反应产物的颜色为绿色，则待测烟粉虱携带或候选携带番茄黄化曲叶病毒，若染色后反应产物的颜色为橙色，则待测烟粉虱不携带或候选不携带番茄黄化曲叶病毒；2)将所述环介导恒温扩增反应产物电泳，若反应产物呈典型的连续梯状条带，则说明待测烟粉虱携带或候选携带番茄黄化曲叶病毒，若反应产物无典型的连续梯状条带，则说明待测烟粉虱不携带或候选不携带番茄黄化曲叶病毒。上述染色剂为SYBR Green I。上述待测烟粉虱为单头待测烟粉虱。本发明的实验证明，本发明针对单头烟粉虱，根据我国发生的TYLCV优势株系的基因组序列设计LAMP引物，通过实验提出了直接利用牙签或吸头穿刺烟粉虱，不需提取DNA，直接进行LAMP反应，具有简便、快速、灵敏等优势，克服了传统技术中耗时、提取核酸、仪器要求高、步骤繁琐等缺点。利用该方法进行检测，具有操作简便、反应快速、灵敏度高等优势，克服了传统技术中耗时、提取核酸、仪器要求高、步骤繁琐等缺点，为单头烟粉虱是否携带番茄黄化曲叶病毒的检测提供了一种便于推广应用检测方法。
图I为LAMP反应检测感染番茄黄化曲叶病毒的单头烟粉虱的结果图2为常规方法检测感染番茄黄化曲叶病毒的单头烟粉虱的结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中番茄黄化曲叶病毒记载在如下文章中北京地区番茄黄化曲叶病毒病的鉴定及防治对策讨论，周涛，师迎春，陈笑瑜，范在丰，植物保护，2010年第2期，公众可从中国农业大学、北京市植物保护站获得。下述实施例中烟粉虱记载在如下文章中梁彦，师迎春，崔小英，马永军，周涛.北京地区传播番茄黄化曲叶病毒的烟粉虱；生物型初步鉴定；《中国植物病理学会2011年学术年会论文集》2011年，公众可从中国农业大学、北京市植物保护站获得。实施例I、检测单头烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的试剂盒制备I、引物的设计根据我国发生的番茄黄化曲叶病毒优势株系的核酸序列设计引物，引物序列如下 TYLCV-C-F3: 5，-AACGCCATTCTCTGCTTGA-3’(序列 I)TYLCV-C-B3: 5，-GAGCCACTGTTCGCAAGT-3，(序列 2 )TYLCV-C-FIP: 5，-ACTACCTCCACATCAACTGCAAGGAGCAGTGATGAGTTCCC-3，(序列 3)TYLCV-C-BIP: 5，-ATGAGCAGCCACAGTCTAGGTGGTTCAACACAAGATAGCCA-3’(序列 4)2、番茄黄化曲叶病毒检测反应液及试剂盒的制备反应液每管24yL，其组成为加入的引物及终浓度分别为TYLCV-C-F3 (终浓度为 O. 2 μ mol/L)、TYLCV-C-B3 (终浓度为 O. 2 μ mol/L)、TYLCV-C-FIP (I. 6 μ mol/L)和TYLCV-C-BIP (I. 6 μ mol/L);其他组分及终浓度分别为甜菜碱5mol/L、dNTPsl0mmol/L、I倍的 Thermopol buffer (含 MgSO4 2mmol/L, New England Biolabs Inc,目录号 B9004S))、MgSO4 50mmol/L 和水。番茄黄化曲叶病毒检测试剂盒包括4条引物或上述反应液。实施例2、检测单头烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的试剂盒的应用一、检测单头烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的试剂盒的LAMP反应I、取样及LAMP反应在番茄生产田或周围捕捉编号为1-4的4头烟粉虱，分别用牙签(也可用吸头)直接在塑料薄膜上碾碎单头烟粉虱，然后将覆有碾碎后单头烟粉虱的牙签分别放入装有由实施例I制备的反应液小管内，轻轻搅拌2次，移除牙签，再分别向管中补充BstDNA聚合酶(8U/ μ L) I μ L，共计25 μ L反应体系。总体系为25yL，其组成为I μ L Bst DNA聚合酶(终浓度为O. 32U/μ L，NewEngland Biolabs Inc,目录号 M0275S))、终浓度为 0. 2 μ mol/L TYLCV-C-F3、终浓度为 0· 2 μ mol/L TYLCV-C-B3、终浓度为 I. 6 μ mol/L TYLCV-C-FIP 和终浓度为 I. 6 μ mol/LTYLCV-C-BIP、甜菜喊 5mol/L、dNTPs 10mmol/L、l 倍的 Thermopol buffer (含 MgS042mmol/L)、MgSO4 50mmol/L 和水。反应条件将上述25 μ L反应体系短暂离心后，放入65°C恒温水浴锅反应45分钟，得到LAMP产物。2、鉴定I)直接用肉眼观察颜色变化加荧光染料直接判别结果反应结束后，将LAMP产物放置冰上(0°C )10分钟，短暂离心后向产物中加入1μ I SYBR Green I (Invitrogen, S7563,按体积比1:10000稀释)，5min后观察结果。若反应管颜色为绿色，则说明待测烟粉虱携带或候选携带番茄黄化曲叶病毒，若反应管颜色为橙色，则说明待测烟粉虱不携带或候选不携带番茄黄化曲叶病毒；结果如图IA所示，从左到右依次为编号为1-4的烟粉虱和空白对照，可以看出，编号为1-3的烟粉虱反应管颜色为绿色，说明携带番茄黄化曲叶病毒；编号为4的烟粉虱反应管颜色为橙色，说明不携带番茄黄化曲叶病毒。2)电泳检测分别取5 μ L LAMP产物经2 %琼脂糖凝胶在O. 5 X TBE缓冲液和160V电压条件下电泳30min，在O. 5μ g/mL的溴化乙锭(EB)中染色lOmin，染色后于凝胶成像系统中观察。
若反应产物有明亮的呈弥散状的核酸泳带且呈典型的连续梯状，则说明待测烟粉虱携带或候选携带番茄黄化曲叶病毒，若反应产物无明亮的呈弥散状的核酸泳带且呈典型的连续梯状，则说明待测烟粉虱不携带或候选不携带番茄黄化曲叶病毒；结果如图IB所示，1-5依次为编号为1-4的烟粉虱和空白对照，可以看出，编号为1-3的烟粉虱反应产物呈典型的连续梯状泳带，说明携带番茄黄化曲叶病毒；编号为4的烟粉虱反应产物不呈典型的连续梯状泳带，说明不携带番茄黄化曲叶病毒。二、常规检测编号为1-4的烟粉風进行如下检测，参照Lefeuvre P, Hoareau M, DelatteH, Reynaud B, Lett J-M(2007)A multiplex PCR method discriminating between theTYLCV and TYLCV-Mld clades of Tomato yellow leaf curl virus. J. Virol. Methods144:165-168的方法，具体步骤如下I、烟粉虱总DNA的提取上述将LAMP方法中穿刺过的编号1-4烟粉風，提取总DNA ;具体如下I)吸取 10 μ I 裂解液(裂解液成分50mM KCl，IOmM Tris-HCl pH 8. 4,0. 45%Tween20,0. 2% gelatin (明胶)，0. 45%NP40，60mg/ml proteinase K)于封口膜上，将一头烟粉虱置于提取液中，用0. 2ml PCR管底部将烟粉虱充分研磨匀浆；2)把匀浆液吸入1.5ml离心管中，再取15 μ I裂解液清洗封口膜研磨处，将清洗液与匀浆液合并。3)65t^Km30min;4)沸水浴IOmin,使蛋白酶K失活；5)经短暂离心后，即可用于PCR反应，或储藏于_20°C冰箱中。2、PCR扩增、克隆和序列测定根据Lefeuvre et al. (2007)报道的检测番茄黄化曲叶病毒的多重PCR引物 TYLCV-1840F 5 ' -GGTCTACGTCATCAATGAC-3 '(基因组上的位置 1840-1858)；Mld-2354R 5 ' -AGGGAGCTAAATCCAGTT-3 '(基因组上的位置 2354-2367) ;IL_2642R 5' -ACACCGATTCATTTCAAC-3'(基因组上的位置 2642-2659)进行 PCR 扩增。建立25 μ L PCR反应体系烟粉虱总DNA 0. 5 μ L,反应的终浓度为PCR反应缓冲液 I X，d NTPs 0. 2mM、TYLCV-1840F I μ M、Mld_2354R 0· 5 μ M、IL-2642R 2 μ Μ, Taq DNAPolymerase I. 25U, ddH20 18.75 μ L。
PCR反应条件94°C变性2min，按下列条件进行32个循环(94°C变性30S，58°C复性30S，72°C延伸30S)，72°C延伸lOmin。全部PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳分离，染色后观察条带位置。经电泳凝胶成像仪拍照后，结果如图2所示，1-4分别为编号1-4烟粉虱和空白对照，可以看出，仅编号1-3烟粉虱出现SOObp左右的目标条带，对目标条带进行克隆测序(序列如下序列5)，经比对分析此片段与GenBank中登录号JQ038238. I的第1829-2633位核苷酸完全一致，说明编号1-3烟粉風被番爺黄化曲叶病毒感染。 从上述结果可以看出本发明的引物和方法正确。
权利要求
1.检测番茄黄化曲叶病毒的环介导等温扩增引物组，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ； 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根据权利要求I所述的引物组，其特征在于所述引物组由引物I、引物2、引物3和引物4组成；所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4的摩尔比为I :1 8 :8。
3.检测番茄黄化曲叶病毒的环介导等温扩增试剂，包括权利要求I或2所述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱和水。
4.根据权利要求3所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于所述环介导等温扩增试 剂还包括DNA聚合酶，所述环介导等温扩增试剂由权利要求I或2所述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、dNTPs、硫酸镁、DNA聚合酶、甜菜碱和水组成； 所述引物I和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为0. 2 u mol/L, 所述引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为I. 6 u mol/L。
5.检测番茄黄化曲叶病毒的环介导等温扩增试剂盒，包括权利要求I或2所述的引物组或权利要求3或4所述的环介导等温扩增试剂。
6.权利要求I或2所述的引物组、权利要求3或4所述环介导等温扩增试剂、权利要求5所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测烟粉虱中是否携带番茄黄化曲叶病毒产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述环介导等温扩增反应的温度为63-65°C，所述环介导等温扩增反应的时间为45-60分钟。
全文摘要
本发明公开了一种检测单头烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的试剂盒。本发明提供的引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，本发明针对单头烟粉虱，根据我国发生的TYLCV优势株系的基因组序列设计LAMP引物，通过实验提出了直接利用牙签或吸头穿刺烟粉虱，不需提取DNA，直接进行LAMP反应，具有简便、快速、灵敏等优势，克服了传统技术中耗时、提取核酸、仪器要求高、步骤繁琐等缺点。
文档编号C12Q1/70GK102776296SQ20121027439
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者周涛, 师迎春, 梁彦, 范在丰, 郑建秋 申请人:中国农业大学, 北京市植物保护站