专利名称：鉴定番茄严重曲叶病毒的引物和探针及其检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种鉴定番茄严重曲叶病毒的引物和探针及其检测方法，特别涉及一种采用实时突光PCR的方法鉴定或辅助鉴定番爺严重曲叶病毒(Tomato severe leafcurlvirus, ToSLCV)的引物对、探针及其检测方法。
背景技术：
番爺严重曲叶病毒( Tomato severe leaf curl virus, ToSLCV)是近年发现的病毒新种，属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus),是番爺上的重要病害，特别是与番爺灼烧病毒(Tomato torrado virus,ToTV)共同侵染,导致许多寄主植物如番茄等的严重减产。ToSLCV是美国的检疫性有害生物，也是蔬菜生产的主要限制因素。这种病毒由粉虱传播，在生长季节，烟粉虱可将病毒传播至很多寄主植物上。为防止ToSLCV传入美国并扩散，美国农业部动植物检疫局(APHIS)2009年6月I日发布联邦法令，禁止以下来自加拿大以外所有国家的用于种植的寄主植物的进ロ，包括番爺属(Lycopersicon spp.)、辣椒属(Capsicum spp.)、爺属(Solanum spp.)、藜属(Chenopodium spp.)、寥属(Polygonum spp.)、滨藜属(Atriplex spp. )、Halogetum 属、烟草属(Nicotiana spp.)、独行菜属(Lepidium spp.)、拟漆姑属(Spergularia spp.)、觅属(Amaranthus spp.)及锦葵属(Malva spp.),直到风险评估完成并制定有效的缓解措施。目前该病毒主要分布于洪都拉斯、墨西哥、危地马拉及尼加拉瓜。ToSLCV可经介体传播，一旦田间有植株发病，病毒将快速扩散，往往在短时间内就会导致番爺大面积发病，导致严重的经济损失。我国质检总局也发布番茄严重曲叶病毒疫情警示，要求对上述寄主植物在入境时加强检疫，避免该病毒的传入。然而，我国目前还没有关于该病毒的研究，更没有相关的检测方法，因而有必要建立该病毒的检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供鉴定番茄严重曲叶病毒的组合物、试剂盒及其检测方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番爺严重曲叶病毒(Tomato severe leaf curlvirus, ToSLCV)的组合物，由一个引物对和ー个探针组成的组合物；所述引物对由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针可为TaqMan荧光探针，其核苷酸序列为序列表中序列3。其中，序列I有26个核苷酸组成；序列2由23个核苷酸组成；序列3由20个核苷
酸组成。TaqMan荧光探针是ー种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭荧光基团连接在探针的3’末端。PCR扩增时在加入ー对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增吋，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同歩。所述报告荧光基团可为Fam (FAM)、Hex(HEX)、Tet (TET)、Joe (JOE)、Vic(VIC)、Fite(FITE)、Cy3 (CY3)或 Cy5 (CY5)。所述淬灭荧光基团可为 Tamra (TAMRA)、Rox (ROX)、Dabcy (DABCY) ,Bhql (BHQl)或Bhq2 (BHQ2)。在本发明中，所述探针5’端标记的报告荧光基团具体为FAM荧光基团，3’端标记的淬灭荧光基团具体为TAMRA荧光基团。
鉴定或辅助鉴定番爺严重曲叶病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)的引物对和探针也分别属于本发明的保护范围。所述引物对具体为由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。所述探针可为TaqMan荧光探针，其核苷酸序列具体为序列表中序列3。在本发明中，所述探针5’端标记的报告荧光基团具体为FAM荧光基团，3’端标记的淬灭荧光基团具体为TAMRA荧光基团。上述组合物或引物对或探针在制备用于检测或辅助检测待测样品中是否携带番爺严重曲叶病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。本发明所提供的用于检测或辅助检测待测样品中是否携帯番茄严重曲叶病毒(Tomato severe leaf curl virus,ToSLCV)的试剂盒包含有上述组合物或引物对或探针。所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。该方法具体可包括如下I)或2)或3)的步骤I)将所述组合物中的所述探针，以及所述组合物中所述引物对的所述两条单链DNA分子分别单独包装；2)将所述引物对中的所述两条单链DNA分子分别单独包装；3)将所述探针单独包装。上述组合物或引物对或探针或试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否携带番爺严重曲叶病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)中的应用也属于本发明的保护范围。本发明所提供的检测或辅助检测待测样品中是否携帯番茄严重曲叶病毒(Tomatosevere leaf curl virus, ToSLCV)的方法具体可包括如下步骤以分离自所述待测样品的DNA为模板，利用上述组合物或引物对或探针或试剂盒进行PCR检测,从而确定所述待测样品中是否携带番爺严重曲叶病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)。在本发明中所述PCR具体为实时荧光PCR。所述PCR的体系中，所述引物对中的两条引物以及所述探针的摩尔比可为I :1 :1。在本发明的一个实施例中，反应起始时，所述引物对中的两条引物的浓度，以及所述探针的浓度均为0. 2 μ mol/L。所述PCR的退火温度可为60°C。在本发明的一个实施例中，所述实时荧光PCR的反应參数具体如下50°C 2min ；95°C IOmin ；95°C 5s,60°C lmin，共 40 个循环。本发明根据番爺严重曲叶病毒(Tomato severe leafcurl virus, ToSLCV)外壳蛋白基因保守区序列，设计用于实时荧光PCR检测的引物对(序列I和序列2)及探针(序列3)，通过对反应的退火温度的优化建立了该病毒的实时荧光PCR检测方法。实验证明该方法可以检测待测样品中是否携带番爺严重曲叶病毒(Tomato severe leaf curl virus,ToSLCV)，且具有快速灵敏及特异性强的优点。
图I为实时荧光PCR技术检测番茄严重曲叶病毒的特异性实验結果。其中，标号为I的曲线为ToSLCV DNA的扩增曲线；其余曲线为非洲木薯花叶病毒(African cassavamosaic virus, ACMV) DNA、棉花曲叶病毒(Cotton leafcurl virus, CLCuV) DNA 和番爺黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) DNA 的扩增曲线。图2为实时荧光PCR技术检测番茄严重曲叶病毒的灵敏度实验。其中，曲线1-8均为ToSLCV DNA的扩增曲线，分别是5^5^5^5^5^5^57和58倍比稀释；曲线9为空白对照的扩增曲线。图3为普通PCR检测番茄严重曲叶病毒的灵敏度实验結果。其中，泳道1-8依次为5\52,53,5\55,56,57 58倍比稀释;泳道9为空白对照;泳道M为DNA Marker DM500。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、鉴定番茄严重曲叶病毒的试剂盒的制备根据番爺严重曲叶病韋(Tomato severe leaf curl virus,ToSLCV)外壳蛋白基因(GenBank No. AJ850209. I)的公开序列,采用探针设计软件Express2. O设计探针及引物,用于制备试剂盒。试剂盒由如下引物对和探针(TaqMan探针)组成。引物对正向引物(ToSLCVF):5' -GTTGGTAAACGTTTCTGCGTTAAGTC-3 '(序列 I，GenBankNo. AJ850209. I 的第 152-177 位)反向引物(ToSLCVR)5 ' -GTGTGGTTCTTCAGCTTGATGTT-3 '(序列 2，GenBankNo. AJ850209. I的第212-234位的反向互补序列)探针(ToSLCVP):5 ' -ATATTAGGGAAGATCTGGAT-3 '(序列 3，GenBankNo. AJ850209. I 的第 185-204 位)探针ToSLCVP的5’端用报告荧光基团FAM标记，3’端用淬灭荧光基团TAMRA标记。实施例2、鉴定番茄严重曲叶病毒的试剂盒的特异性检测用实施例I制备的试剂盒分别以感染番茄严重曲叶病毒的番茄叶片(叶片表现严重曲叶，病毒英文名Tomato severe leaf curl virus,记载在First Report ofTomato severe leaf curl virus in Mexico, 2006, 9 (8) :1116.公众可从中国检验检疫科学研究院获得)、感染非洲木薯花叶病毒的木薯叶片(叶片表现花叶，病毒英文名African cassava mosaic virus, ACMV,记载在Multiplex PCR for the detection of African cassava mosaic virus and East Afrcan cassava mosaic Cameroon virusin cassava, 2008, 154:111-120.公众可从中国检验检疫科学研究院获得)和感染番茄黄化曲叶病毒的番爺叶片(叶片表现黄化曲叶，病毒英文名Tomato yellow leaf curlvirus，TYLCV，记载在北京番茄黄化曲叶病毒病的发生及分子检测，2010，(I) :28-30.公众可从中国检验检疫科学研究院获得)为实验材料，检测其是否携帯有番茄严重曲叶病毒(Tomato severe leaf curl virus, ToSLCV),以验证该试剂盒的特异性。姆个样品采用相同的检测方法，包括样本总DNA的提取和实时荧光PCR两个步骤。一、样品总DNA的提取取0. Ig (鲜重)样品，取适量液氮研磨后，按照植物病毒吸附DNA提取试剂盒(武汉哇哇噻纳技术开发有限公司，产品目录号EX1010)的操作步骤提取DNA。ニ、实时荧光PCR分别以步骤ー获得的各样品的总DNA为模板进行实时荧光PCR。
实时突光PCR 反应体系2XGoldStar Taqman Mixture (Cffbio. Co. Ltd,Cat#CW0932) 10 μ I ；DNA 模板 2 μ I ;ToSLCVF、ToSLCVR 及 ToSLCVP (浓度均为 10 μ mol/L)各0. 4 μ L ；DEPC-H20补至20 μし该反应体系中，反应初始吋，上下游引物以及探针的浓度均为0. 2 μ mol/L。同时以水代替DNA模板作为空白対照。将样品管放入Roche LightCycler 480 II突光PCR仪后,设置如下条件进行反应50°C 2min ；95°C IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，共 40 个循环；60°C收集荧光信号。反应结束后根据扩增曲线判定結果。结果如图I所示，只有感染番茄严重曲叶病毒的番茄叶片这一祥品，通过实时荧光PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而其它样品与空白对照一祥，荧光强度均没有变化，表明所设计的探针引物对番茄严重曲叶病毒具有良好的特异性。实施例3、鉴定番茄严重曲叶病毒的试剂盒的灵敏度检测用DEPC水按51、52、53、54、55、56、57和58倍比，将实施例2中的感染番茄严重曲叶病毒的番茄叶片的DNA (ToSLCV的DNA)进行稀释，分别作为DNA模板，进行实时荧光PCR检测，同时以普通PCR作为对照。实时荧光PCR反应体系和反应程序均如实施例2所述。不同稀释度的DNA模板在20 μ L反应体系中，终浓度由大到小以此为15ng/ μ L、3ng/ μ L、0. 6ng/ μ L、120pg/ μ L、24pg/μ L、4. 8pg/μ L、960fg/μ L、192fg/μ L。普通PCR反应体系(20μL):10XPCR buffer(含Mg2+)2 μ L，dNTP MixtureC IOmmol/L) 0· 6 μ L, ToSLCVF 及 ToSLCVR (均为 10 μ mol/L)各 0· 5 μ L，2U/ μ L Taq 酶 I μ L, DNA 模板 2 μ L，以及 DEPC-H2O 13. 4 μ し反应程序94で5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；72で 8min。实时荧光PCR检测结果如图2所示，对ToSLCV DNA的最低检测限是57稀释度(960fg/yL)。普通PCR检测结果如图3所示，对ToSLCV DNA的最低检测限是56稀释度(4. 8pg/y L)(大小为 83bp 的目的条带，GenBank No. AJ850209. I 的第 152-234)。这表明，利用实施例I制备的试剂盒对ToSLCV DNA进行实时荧光PCR比普通PCR灵敏度高约5倍。
权利要求
1.鉴定或辅助鉴定番茄严重曲叶病毒的组合物，由一个引物对和一个探针组成的组合物；所述引物对由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。
2.鉴定或辅助鉴定番茄严重曲叶病毒的引物对或探针； 所述引物对由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。
3.根据权利要求I所述的组合物，或权利要求2所述的探针，其特征在于所述探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有TAMRA荧光基团。
4.权利要求1-3中任一所述组合物，或所述引物对，或所述探针在制备用于检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄严重曲叶病毒的试剂盒中的应用。
5.用于检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄严重曲叶病毒的试剂盒，包含有权利要求1-3中任一所述组合物，或所述引物对，或所述探针。
6.权利要求5所述试剂盒的制备方法，包括如下I)或2)或3)的步骤 1)将权利要求I或3所述组合物中的所述探针，以及所述组合物中所述引物对的所述两条单链DNA分子分别单独包装； 2)将权利要求2所述引物对中的所述两条单链DNA分子分别单独包装； 3)将权利要求2或3所述探针单独包装。
7.权利要求1-3中任一所述组合物，或所述引物对，或所述探针，或权利要求5所述试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄严重曲叶病毒中的应用。
8.检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄严重曲叶病毒的方法，包括如下步骤以分离自所述待测样品的DNA为模板，利权利要求1-3中任一所述组合物，或所述引物对，或所述探针，或权利要求5所述试剂盒进行PCR检测，从而确定所述待测样品中是否携带番茄严重曲叶病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述PCR的体系中，所述引物对中的两条引物以及所述探针的摩尔比为I :1 :1。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于所述PCR的退火温度为60°C。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定番茄严重曲叶病毒的引物和探针及其检测方法。本发明提供了鉴定或辅助鉴定番茄严重曲叶病毒(Tomato severe leaf curl virus，ToSLCV)的组合物，该组合物由一个引物对和一个探针组成的组合物；所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。实验证明利用本发明所提供的引物和探针通过实时荧光PCR的方法可以检测待测样品中是否携带番茄严重曲叶病毒(Tomato severe leaf curl virus，ToSLCV)，且该方法具有灵敏准确特异性好的优点。
文档编号C12Q1/70GK102676696SQ20121014094
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者张永江, 朱水芳, 牟海青, 辛言言, 鲁洁 申请人:中国检验检疫科学研究院