一种用于检测jc病毒的引物、探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测JC病毒的引物、探针和试剂 盒。
【背景技术】
[0002] JC病毒（JC virus，JCV)属乳多空病毒科多瘤病毒种人类多瘤病毒分 支。1971年Pagett等首次从进行性多灶性白质脑病（progressive multifocal leucoencephalopathy，PML)患者脑组织中分离出JC病毒。JC病毒在人群中广泛存在，主 要潜伏在人的肾脏等组织内。JC病毒的感染发生在人的童年时期，呈持续亚临床潜伏感染 状态，免疫健全状态下可终生无症状，属于无症状感染，但对于AIDS患者或服用免疫抑制 药物的患者则可引发PML等系列疾病，PML是一种致死性中枢神经系统脱髓鞘疾病。近年来 研宄表明，JC病毒与多种人类肿瘤的发生相关，包括脑肿瘤、结直肠癌、胃癌、食道癌及B细 胞淋巴系统肿瘤等。随着我国HIV/AIDS患者人数的逐年增加，JC病毒感染作为HIV/AIDS 相关的机会感染也会逐年增多，以及肾移植等器官移植患者在施用免疫抑制药物后，JC病 毒感染引发PML的概率增大，JC病毒所带来的危害也会更加突出。
[0003] 对JC病毒感染的检测包括检测血清中特异性的VP1抗体，对感染者的尿液、脑脊 液、血液及病变组织进行JC病毒DNA检测，对活组织进行原位杂交及免疫组化检测等。由 于JC病毒在人群中感染率很高，抗体检测并不能准确证明样品是否被活动性JC病毒感染。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中抗体检测不准确的问题，本发明实施例提供了一种用于检测 JC病毒的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：
[0005] -方面，本发明实施例提供了一种用于检测JC病毒的引物和探针，所述引物和探 针包括：用于检测JC病毒的正向引物、用于检测JC病毒的反向引物和用于检测JC病毒的 探针，其中，
[0006] 所述用于检测JC病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示；
[0007] 所述用于检测JC病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示；
[0008] 所述用于检测JC病毒的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0009] 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3或Cy5,所述 探针的 3' 端连接有淬灭基团 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0010] 另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测JC病毒的试剂盒，所述试剂盒包括 上述的引物和探针。
[0011] 具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控 品、阴性质控品和工作标准品。
[0012] 具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作 标准品4,其中，
[0013] 所述工作标准品1为1 x 107拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段；
[0014] 所述工作标准品2为1 X 106拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段；
[0015] 所述工作标准品3为1 X 105拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段；
[0016] 所述工作标准品4为1 X 104拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段。
[0017] 具体地，所述阳性质控品为1. OX 106拷贝/mL的所述JC病毒的T抗原基因片段。
[0018] 具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0. 05-0. 9 yM，所述探针的终 浓度为 0.05-0. 9 yM。
[0019] 具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、终浓度为0. 2~0. 6mM的dNTPs、10XPCR缓冲液和终浓度为 1. 5~5. OmM的含Mg离子的溶液。
[0020] 具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0. 03-0. 3 %的聚乙二醇辛基苯基 醚、终浓度为0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值为8. 3的终浓度为0. 01-0. 1M 的三（羟甲基）氨基甲烷。
[0021] 具体地，所述临界阳性质控品为1. ox 104拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段。
[0022] 具体地，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理盐水。
[0023] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测 JC病毒的引物和探针，具有灵敏度高的特性，能够准确检测样品是否感染JC病毒，本发明 实施例提供的用于检测JC病毒的试剂盒，具有灵敏度高的特性，能够准确检测样品是否感 染JC病毒，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了检 测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检测；检测速度快， 整个检测过程共仅需2~3小时。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0025] 图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；
[0026] 图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；
[0027] 图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；
[0028] 图4是本发明实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；
[0029] 图5是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；
[0030] 图6是本发明实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为Log Starting Quantity copy number，纵坐标为 Threshold Cycle。
[0031] 图中：Cycles 为循环数，RFU 为焚光值，Log Starting Quantity copy number 为 水痘带状疱瘆病毒起始浓度的对数值，Ct (Threshold Cycle)值为循环数；la-实施例2中 样品1，4a-实施例2中样品4, 5a-实施例2中样品5,6a-实施例2中样品6, 7a-实施例2 中样品7。
【具体实施方式】
[0032] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方 式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程（大连）有限 公司。
[0033] 实施例1. 一种用于JC病毒核酸定量检测的引物和荧光探针
[0034] 本发明实施例提供了一种用于检测JC病毒的引物和探针，引物和探针包括：用于 检测JC病毒的正向引物、用于检测JC病毒的反向引物和用于检测JC病毒的探针，其中，
[0035] 用于检测JC病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示；
[0036] 用于检测JC病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示；
[0037] 用于检测JC病毒的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0038] 探针的5'端连接有荧光基团？411、册乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探针的3' 端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本发明实施例中，探针 的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm ;淬灭基团为Eclipse。 纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：
[0039] 表1.JC病毒引物和探针
【主权项】
1. 一种用于检测JC病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测 JC病毒的正向引物、用于检测JC病毒的反向引物和用于检测JC病毒的探针，其中， 所述用于检测JC病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； 所述用于检测JC病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； 所述用于检测JC病毒的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述探针 的 3' 端连接有淬灭基团 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2. -种用于检测JC病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的 引物和探针。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反 应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工 作标准品2、工作标准品3和工作标准品4,其中， 所述工作标准品1为I X IO7拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段； 所述工作标准品2为I X IO6拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段； 所述工作标准品3为I X IO5拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段； 所述工作标准品4为I X IO4拷贝/mL的所述JC病毒的基因片段。
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为1.0 X 10 6拷贝/mL 的所述JC病毒的T抗原基因片段。
6. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的终浓 度均为0. 05-0. 9 y M，所述探针的终浓度为0. 05-0. 9 y M。
7. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应 体系中包括：终浓度为0.0 lU/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、终浓度为0. 2~0. 6mM的dNTPs、 10XPCR缓冲液和终浓度为1. 5~5. OmM的含Mg离子的溶液。
8. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为 0.03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH 值为8. 3的终浓度为0? 01-0.1 M的三（羟甲基）氨基甲烷。
9. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品为1.0 X 10 4拷贝 AiL的所述JC病毒的基因片段。
10. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为浓度为0. 8%的生 理盐水。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测JC病毒的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测JC病毒的正向引物、用于检测JC病毒的反向引物和用于检测JC病毒的探针。所述试剂盒包括上述的引物和探针。所述引物、探针和试剂盒，具有灵敏度高的特性，能够准确检测样品是否感染JC病毒。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-70, C12R1-93, C12Q1-68
【公开号】CN104745724
【申请号】CN201510052911
【发明人】刘茹, 桑筱筱
【申请人】湖北永邦医疗科技有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年1月30日