一种快速检测水貂阿留申病毒的引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物疾病检测诊断方法技术领域，特别是涉及一种快速检测水貂阿留申病毒的引物、试剂盒及方法，非常适合在现场对水貂阿留申病毒进行定性及定量检测，对于饲养场早期检测诊断、流行病学疫情调查及进出口岸检测具有重要作用。
【背景技术】
[0002]自20世纪50年代发现水貂阿留申病(ADM)以来，由于ADM致病机理比较特殊，所以至今尚未研制出有效预防该病的常规疫苗，生产上主要以预防为主，目前主要通过检测阿留申病毒(AMDV)发现阳性者淘汰净群控制ADM。所以建立一种有效的诊断方法对ADM的防治有重要意义，传统的AMDV检测方法包括:病原的分离和生物学实验、电镜技术等病原学诊断方法，碘凝集试验(IAT)和对流免疫电泳(CIEP)、补体结合试验、免疫复合物检测法(CIC)等血清学检测方法；基因芯片技术、聚合酶链式反应(PCR)、核酸杂交技术等分子生物学诊断方法。这些方法普遍存在如周期长、操作繁琐、特异性、敏感性和重复性差等缺点，不适合大批量自动化检测，给ADM的防控带来一定困难。
[0003]荧光定量PCR由于采用了完全闭管检测，不需凝胶电泳等PCR后处理，避免了交叉污染，整个检测过程可实现自动化，且反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰、劳动强度小，易于批量化、标准化应用。随着荧光定量PCR仪和相应耗材价格的降低，尤其是小型实时荧光定量PCR和配套自动化操作设备的出现，极大地降低了荧光定量PCR的成本，简化了定量检测的过程，提高了工作效率。可以预见不久将来，随着荧光定量PCR相关成本进一步下降和可携带全自动荧光定量PCR仪出现，采用该技术对AMDV进行现场检测将成为控制ADM的一种有效方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种快速检测水貂阿留申病毒的引物、试剂盒及方法，用于对AMDV的检测。
[0005]为了实现快速检测AMDV，本发明是通过以下技术方案实现的:
一种快速检测水貂阿留申病毒的引物、试剂盒及方法，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID N0.1 5’- CCCTCCAGGTCAACTCTTTGTTAAA-3’和下游引物序列为SEQ ID N0.2 5’-GCCTCTCCAAGTAAAGTAACCATAGG-3’。
[0006]一种快速检测水貂阿留申病毒的引物、试剂盒及方法，该试剂盒包括I)含有上述的上游引物和下游引物以及SYBR Green染料的PCR Master mix，上、下游引物终浓度均为0.25 μ mol/L ；2)病毒裂解液；3)阴性对照_无菌超纯水；4)阳性对照_ 12Copies/ μ L连有病毒部分序列amdv-fl的似19-T_amdv-fI质粒，amdv-fI序列如SEQ ID N0.3所不；5)异丙醇；6)75%乙醇。
[0007]/7細19-T-amdv-f I阳性质粒制备方法如下:利用上游引物SEQ ID N0.1和下游引物SEQ ID N0.2以水貂AMDV-G株为模板，在EasyCycler基因扩增仪(Analytikjena)进行。反应体系为 20 yL，包括:10yLPremixTaq，8yLddH20，1“14莫板，上下游引物(各5 4!1101/L)混合物I μ L0扩增参数为:94°C预变性1s ;94°C变性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，共30个循环；72°C后延伸7 min。
[0008]反应产物利用2%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒对PCR产物纯化回收，将回收的PCR产物用pMD19-T Vector进行连接，在0.2 mL的PCR管中，取PCR回收产物4 μ?和pMD19-TVector ?μ?，加5μ?连接缓冲液，16°C过夜连接。连接液全量(10 μ L)加入至100 4 1^水中溶解1^&1185 0感受态细胞中，冰中放置30 min。42°C加热45 S后，再在冰中放置lmin。加入89(^1^0(:培养基，371:振荡培养601^11。在含有X_Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。从平板上挑取4个克隆接种于5 mL 100 μ g/mL氨苄的LB培养基中，37 °C培养14h。取4mL过夜培养菌液，用质粒提取试剂盒抽提质粒，送质粒测序。将测序结果正确的质粒命名为似19-T-amdv-fl并在B1Photometer (eppendorf )上测定浓度,根据重组质粒提取物浓度计算拷贝数。
[0009]制备I X 101° copies/ μ L的溶液作为标准品原液，_80°C保存。将标准品原液10倍梯度稀释成101(l-10°COpies/ μ L标准品在荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR检测，以ddH20为模板为阴性对照，以阈值循环数(Ct)彡30出现标准“S”型扩增曲线的最低浓度梯度作为检测的灵敏度。反应体系如下:2XPCRmix (Power SYBR Green PCR Master Mix,Applied B1systems) 10 μι,模板 I μ L,上下游引物混合物(5 μ mol/L) I μ L, ddH20 8 μ L0扩增程序如下:95 °C预变性10 min ；95 °C变性15 s、60 °C退火60 s，40个循环。本方法结果显示该方法的敏感性达到10 copies/ μ L, 12Copies/ μ L及以上时具有良好的特异性和重复性，在阴性对照无扩增，表明该方法特异性良好。
[0010]将标准品原液10 倍梯度稀释取 109、108、107、106、105、104、103、102 copies/μ L 作为标准品，在荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR检测，每个样品3次重复，反应条件如上，根据Ct值以及模板起始拷贝数制作标准曲线和标准方程。从扩增曲线(图1)可以看出:总体看所有曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显；从图2熔解曲线可以看出，模板梯度熔解曲线仅有I个明显峰，说明引物设计合理没有产生非特异性扩增和二聚体。本方法建立AMDV实时荧光PCR定量标准曲线(图3)方程:Y = -3.082Χ +36.762，r 2= 0.995，其中Y代表Ct值，X代表模板量的对数值。其线性范围可达8个数量级。
[0011]快速检测水貂阿留申病毒试剂盒生产组装及应用:快速检测水貂阿留申病毒试剂盒的规格为96个反应/盒。因此根据检测数量对试剂的各组分进行制备和分装。
[0012]试剂盒生产组装:
(I)对照品及水
阳性对照:IXlO2 copies/ μ L的/7細19-T-amdv质粒分装为25 μ L/管，_20°C保存。
[0013]阴性对照和溶解DNA用水:超纯水高压灭菌后，分装为2.5mL/管，_20°C保存。
[0014](2)试剂
病毒裂解液:配制含3mol/L异硫氰酸胍、0.4%十二烧基肌氨酸钠、0.12 mmol/L β -巯基乙醇、20mmol/L柠檬酸钠的病毒裂解液，40mL/瓶分装，_4°C保存。
[0015]异丙醇:60 mL/瓶分装，常温保存。
[0016]75%乙醇:超纯水高压灭菌后配制75%乙醇，120mL/瓶分装，常温保存。
[0017]PCR Master mix:取商品化 2 X SYBR Green PCR Master mix、无菌超纯水、5 μ mol/L上下游引物混合物按10:7:1比例混合，18 μ L/管分装于8连管或96孔板中，_20°C避光保存。
[0018](3)试剂盒组装
阳性对照、阴性对照和溶解DNA用水各I管，病毒裂解液、异丙醇、75%乙醇各I瓶，1.5mL离心管96个，含18 μ L/管PCR Master mix 8联PCR反应管12组或含18 μ L/管PCRMaster mix 96 孔板 I 块。
[0019]本发明还提供了一种采用上述的试剂盒检测水貂阿留申病毒方法，包括以下步骤:
(I)待检样本的DNA提取；每个1.5mL塑料离心管中加入200 μ L待测液体样本(血清、组织液、尿液等)。加入400 μ L病毒裂解液，振荡40s后室温放置lOmin。振荡30s混匀后加入600 μ L异丙醇，振荡45s混匀后，15000g室温离心16min。移弃上清，加入1.2mL75%乙醇，振荡15秒后15000g室温离心5min，弃上清，离心15s弃残留残留，开盖静置30s，加20 μ L超纯水,振荡溶解待用。
[0020](2)荧光PCR检测；取上述溶液2 μ L同时各取阴阳性对照2 μ L加入含18 μ L/管PCR Master mix 8联PCR反应管或含18 μ L/管PCR Master mix 96孔板中混匀后在荧光定量PCR仪上进行扩增扩增程序如下:95 °C预变性10 min ；95 °C变性15 s、60 °C退火60 s，40个循环。
[0021](3)结果判定:反应液测定Ct值均大于35或无数值的标本为阴性；Ct ( 30的标本为阳性标本；测定30〈 Ct〈 35的标本需复测，复测结果Ct < 35为阳性，复测结果C