一种禽流感病毒纯化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及兽用生物制品行业的兽用疫苗制造领域，更具体地说，设及一种禽流 感病毒纯化的方法。
【背景技术】
[0002] 禽流感是一种由A型流感病毒引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为A类传 染病。按病原性的致病力，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性Ξ大类。非致病性 禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类 出现轻度呼吸道症状，食量减少、产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发 病率和死亡率高。
[0003] 禽流感疫苗主要通过鸡胚繁殖病毒而生产。该种疫苗具有制备工艺简单，免疫效 果确实，免疫持续时间较长等特点，己被许多国家地区在家禽中使用，并在预防和控制禽流 感暴发中起到一定积极作用。
[0004] 在规模化生产禽流感油乳剂灭活苗中，通过对原辅材料、生产过程关键技术地控 制和工艺改进等措施，生产出高效、稳定的产品。生产过程的关键技术直接关系到产品的质 量，是生产高效优质产品的保障。鸡胚含有大量的蛋白、脂类、细胞碎片等杂质，运些物质和 病毒抗原结合在一起。运些异源性物质容易引起的鸡应激，降低生产性能，例如生长缓慢、 产蛋量下降等，在蛋鸡上表现尤为明显。因此，为了提高禽流感疫苗的品质有必要去除胚液 中部分异源性物质。
[0005] 目前，有许多研究致力于从胚液中纯化病毒或者生产相应产品。有人通过乙酸等 化学试剂从浓缩的胚液中提取病毒提高病毒产量。提取病毒的目的在于，病毒颗粒与细胞 碎片或者块状物质分离开。有人通过离子交换层析分离病毒;也有人通过，通过中等速度离 屯、去除胚液中的大块物质，然后通过CaHP〇4凝胶吸附澄清胚液中的病毒颗粒，达到纯化病 毒的目的。有人研究发现，流感病毒液中加入〇.3MNaCl降低纯化后的流感病毒聚集。虽然有 不少人对采用了不同方法对禽流感病毒进行了分离纯化，但是运些方法明显存在W下缺 点:处理量小，例如高速离屯、，回收率低，对病毒抗原存在影响，例如使用乙酸等化学试剂从 浓缩的胚液中提取病毒。运些因素均不利于产业化。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种禽流感病毒 纯化的方法，该方法处理量大，处理速度快，能够去除胚液中80% W上的异源蛋白，病毒回 收率大于85%，并且不影响病毒HA效价。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种禽流感病毒纯化的方法， 具体包括如下步骤：
[0008] (1)-次过滤:采用不诱钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的半成品胚液进行一 次过滤，收集滤出液A;
[0009] (2)二次过滤:采用不诱钢筛网对步骤(1)中滤出液A进行二次过滤，收集滤出液B;
[0010] (3)离屯、:对步骤(2)的滤出液B进行离屯、，收集上清液C和沉淀D;
[0011] (4)溶解:在步骤(3)得到的沉淀D中加入0.1M的PBS溶液重新溶解，并且揽拌，得到 溶液E;
[0012] (5)离屯、:对步骤(4)得到的溶液E进行离屯、，收集上清液F;
[0013] (6)浓缩:将步骤(3)与步骤(5)中得到的上清液C和上清液F合并，然后采用孔径为 30-500K的膜包对合并液进行浓缩，浓缩至原始体积的（1/2)-(1/8),得到浓缩液G;
[0014] (7)分子筛层析：W葡聚糖凝胶G200为层析填料，采用纯净水平衡层析柱，W0.05M 的PBS溶液为洗脱液，对步骤(6)中得到浓缩液G进行分子筛层析，回收禽流感病毒液H;
[0015] (8)浓缩:采用孔径为30-500K的膜包对步骤(7)回收禽流感病毒液Η使用进行浓 缩，获得纯化后的禽流感病毒I。
[0016] 本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤（1)中不诱钢筛网的目数为 150-250 目。
[0017] 本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(2)中不诱钢筛网的目数为 550-550 目。
[0018] 本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤（3)中离屯、速度为4000-GOOOrmp/min，离屯、时间为30-60min。
[0019] 本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(4)中揽拌速度为6000-100(K)rpm/min，揽拌时间为30min-化，加入的PBS溶液的体积与步骤（1)中的半成品胚液的 体积相等。
[0020] 本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(5)中的离屯、速度为4000-GOOOrmp/min，离屯、时间为30-60min。
[0021] 本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(6)中膜包的孔径为100-300K。
[0022] 本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(8)中膜包的孔径为100-300K。
[0023] 实施本发明的禽流感病毒纯化的方法，具有W下有益效果：
[0024] (1)根据本申请的纯化方法能够去除含禽流病毒胚液中80% W上的异源蛋白，并 且禽流病毒回收率大于85%。说明本方法采用简单物理过程对禽流感病进行纯化，能够保 持有效去除异源蛋白同时保留禽流感病毒；
[0025] (2)另外，与未加 PBS溶液的胚液相比，本发明加入0.1M和0.05M的PBS溶液进行处 理后并未降低禽流感病毒血凝性(HA价），由此可见，0.1M和0.05M的PBS溶液对禽流感病毒 血凝性没有影响，说明本方法采用简单物理过程对禽流感病进行纯化，能够保持禽流感病 毒原有的HA价，并未设及到化学或者其它导致病毒变性。
[0026] (3)与高速离屯、等不同纯化方法，本发明的纯化方法处理量大，处理速度快，回收 率高。
【附图说明】
[0027] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0028] 图1是本发明实施例1中经G200分子筛层析后的禽流感病毒液哺勺分离效果图；
[0029] 其中，具有两个峰值的曲线为禽流感病毒粗纯样品通过G200层析填料分离情况； 具有一个峰值的曲线为溶液中电导(各种离子浓度)变化情况;黑色箭头为禽流感病毒峰。
【具体实施方式】
[0030] 下面，结合附图W及【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0031] -种禽流感病毒纯化的方法，具体包括如下步骤：
[0032] (1) -次过滤:采用目数为150-250目的不诱钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的 半成品胚液进行一次过滤，收集滤出液A;
[0033] (2)二次过滤:采用目数为550-550目的不诱钢筛网对步骤（1)中滤出液A进行二次 过滤，收集滤出液B;
[0034] (3)离屯、：对步骤(2)的滤出液B进行离屯、，离屯、速度为4000-6000rmp/min，离屯、时 间为30-60min，收集上清液C和沉淀D;
[0035] (4)溶解:在步骤(3)得到的沉淀D中加入0.1M的PBS溶液重新溶解，并且揽拌，揽拌 速度为6000-10000巧m/min，揽拌时间为30min-化，加入的PBS溶液的体积与步骤(1)中的半 成品胚液的体积相等，得到溶液E;
[0036] (5)离屯、：对步骤(4)得到的溶液E进行离屯、，离屯、速度为4000-6000rmp/min，离屯、 时间为30-60min，收集上清液F;
[0037] (6)浓缩:将步骤(3)与步骤(5)中得到的上清液C和上清液F合并，然后采用孔径为 30-500K的膜包对合并液进行浓缩，浓缩至原始体积的（1/2)-(1/8),得到浓缩液G;进一步 优选地，本步骤中膜包的孔径为100-300K。