一种纯化脊髓灰质炎病毒液的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品制备领域，具体地，涉及一种脊髓灰质炎病毒灭活疫苗制备 过程中的纯化脊髓灰质炎病毒液的方法。
【背景技术】
[0002] 脊髓灰质炎病毒属于小RNA病毒科（Picornaviridae)肠道病毒属 (Enterovirus)，内含单股正链RNA基因，蛋白衣壳为二十面体立体对称结构，无包膜。脊髓 灰质炎病毒有3种血清型，分别为I、II和III型。脊髓灰质炎病毒颗粒包括实心结构病毒颗 粒和空心结构病毒颗粒，其中实心结构病毒颗粒能与机体细胞反应产生中和抗体。
[0003] 脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的具有很强传染力的疾病，主要感染五岁以 下的儿童。1/200的患者会产生不可逆的腿部瘫痪，更严重的会导致吞咽和说话的困难。有 5-10%的患者因为呼吸肌麻痹导致死亡。目前尚无治疗脊灰的有效手段，脊髓灰质炎疫苗 的接种是最有效的预防该疾病发生和传染的方法。
[0004]目前上市的脊髓灰质炎病毒疫苗有减毒疫苗（0PV)和灭活疫苗（IPV)。0PV是多 数国家计划免疫中的主要疫苗品种之一。1985年至2003年有超过5. 5亿儿童在94个国家 已经接种了 0PV疫苗。虽然0PV为消除脊灰发挥了重要作用，但0PV的接种引起的脊灰疫 苗相关病例（VAPP)和脊髓灰质炎疫苗衍生株（VDPV)威胁始终存在，甚至成为影响公众健 康、社会稳定的问题。为了彻底消除脊灰，WHO制定了全球消除脊灰行动计划，预计到2015 年消除脊灰野病毒并在2018年认证全球无脊灰状态。在此过程中，将逐步使用IPV和sIPV 代替0PV。
[0005]IPV使用野毒株salk株作为生产原料，对生物安全等级要求严格，因此生产商的 数量十分有限；此外，由于IPV的价格相对高昂，主要用于发达国家的计划免疫和发展中国 家的私人市场。
[0006]WHO推荐发展中国家在消灭脊灰最后阶段使用一种由减毒株（Sabin株）生产的新 型灭活脊灰疫苗来代替0PV疫苗的使用，从而彻底消除因接种该疫苗导致的VDPV和VAPP 的发生。这在消灭脊灰的最后阶段并全面使用灭活疫苗的背景下，具有重要的补充意义：使 用减毒株生产的Sabin-IPV，较使用野毒株（Salk株）生产的IPV灭活疫苗，具有生产更安 全、成本更低廉的特点，更适合在发展中国家推广使用。在中国境内不允许使用野毒株来生 产IPV，所以用Sabin株生产IPV成为必然。
[0007] 传统的sIPV疫苗纯化工艺通常包括超滤浓缩、离子交换层析、除菌过滤等步骤。 离子交换层析的分离方法在sIPV疫苗纯化工艺中成本比较高，且无法有效地将实心病毒 颗粒与空心病毒颗粒分离。此外，由于实心病毒能与机体细胞反应，诱导机体产生中和抗 体，并经大鼠体内免疫原性试验证实：实心病毒颗粒产生的中和抗体至少是空心病毒颗粒 的10倍。因此，亟待需要一种新的纯化方法，可以将sIPV两种不同的病毒形态分离，以提 高脊髓灰质炎病毒液的有效滴度。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种纯化脊髓灰质炎病毒液的方法。
[0009] 本发明对sIPV的传统纯化工艺进行了改进，将原有的离子交换层析工艺步骤替 换为密度梯度离心（或者连续流密度梯度离心）工艺。纯化脊髓灰质炎病毒采用的密度 介质为蔗糖溶液，蔗糖分为高浓度蔗糖溶液和低浓度蔗糖溶液。高浓度蔗糖溶液为55%~ 60%，低浓度蔗糖溶液为：25%~45%。根据蔗糖密度可以有效的分离具有免疫原性的实 心病毒颗粒（沉降系数约150S)和免疫原性较差或无免疫原性的空心病毒颗粒（沉降系数 约80S)，从而达到选择性收集目标区域的目的。
[0010] 本发明有效地解决了层析方法不能将实心病毒颗粒与空心病毒颗粒分离的难题， 不仅提高了单位剂量sIPV病毒液的免疫原性，而且大大降低了以此病毒液制备得到的疫 苗使用后的副反应，同时降低了生产成本。
[0011] 本发明提供了一种纯化病毒液的方法，包括：
[0012] (1)待纯化的病毒超滤浓缩液进行蔗糖密度梯度离心；
[0013] (2)监测糖度，收集合并处于相同位置的离心液。
[0014] 步骤⑴的蔗糖密度梯度离心方法为：
[0015] 依次从离心机边孔以50~lOOrpm依次栗入超离缓冲液，病毒超滤浓缩液，低 浓度蔗糖溶液，最后以50~150rpm栗入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体；离心转速为 28000~35000rpm，离心时间为：6~20小时，离心温度为2~8°C。
[0016] 本发明纯化病毒液的方法中，超离缓冲液与病毒超滤浓缩液的体积比为1 :5~1: 10;病毒超滤浓缩液与低浓度蔗糖溶液的体积比为1 :1~2 :1;高浓度蔗糖加入标准为只 要离心机中空流出液体即可停止加入高浓度蔗糖。
[0017] 所述低浓度蔗糖质量百分比为25%~45%，高浓度蔗糖质量百分比为55%~ 60%〇
[0018] 超离缓冲液选自0. 1M~0. 5M的PB、PBS和PBST中的一种。
[0019] 根据不同性质的病毒颗粒沉降系数不同，导致其处于不同糖度位置，进而分离不 同的超离液（离心液），本发明方法中，步骤（2)的收集合并处于相同位置的离心液是收集 并合并处于相同位置的离心液，其中含实心病毒的离心液位于糖度54%的糖度位置，含空 心病毒和少量实心病毒的离心液位于50% -54%的糖度位置。其余糖度的离心液作为废液 处理。
[0020] 收集离心液后，还包括采用离子交换层析方法对离心液进行纯化，具体为：使用 DEAES印haroseFastFlow，分别检测I、II、III型病毒颗粒的260/280或254/280值，收集 流穿峰。离子交换的pH值根据病毒型别稳定性的差异，选择范围为pH6. 5-7. 5。平衡缓冲 液和样品的电导率控制在15_45ms/cm范围内。
[0021] 优选地，本发明方法中所述的病毒为脊髓灰质炎病毒。
[0022] 进一步地，所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎病毒减毒株Sabin株I型、II型、III 型。
[0023] 更进一步地，本发明方法中，当脊髓灰质炎病毒为Sabin株脊髓灰质炎病毒I、Π 时，超离缓冲液的pH值为：6. 0~7. 0 ;当脊髓灰质炎病毒为Sabin株脊髓灰质炎病毒III型 时，超离心缓冲液的pH值为：6.5~7. 5。
[0024] 采用本发明纯化病毒液的方法制备得到的疫苗也属于本发明的保护范围。
[0025] 本发明提供一种利用上述方法制备得到的脊髓灰质炎病毒Sabin株灭活疫苗。
[0026] 进一步地，本发明的灭活疫苗是将脊髓灰质炎减毒株Sabin株I型、II型、III型 的单价病毒纯化液灭活后混合，添加保护剂制备得到。
[0027] 本发明的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、III型的抗原含 量分别为 7-25DU、25-68DU、25-68DU。
[0028] 优选地，本发明的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、III型 的抗原含量分别为12-18DU、36-54DU、36-54DU。
[0029] 更优选地，本发明的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、III 型的抗原含量分别为15DU、4?U、45DU。
[0030] 本发明提供了上述纯化病毒液的方法在生物制品制备中的应用。
[0031] 进一步地，本发明提供了上述纯化病毒液的方法在制备脊髓灰质炎病毒灭活疫苗 中的应用。
[0032] 具体地，上述应用是指将脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、 III型抗原分别按照本发明纯化病毒液的方法进行纯化，分别灭活后进行混合，添加保护剂 制备得到以减毒株Sabin株为原料的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗。
[0033] 本发明提供的纯化脊髓灰质炎病毒的方法，其密度介质为蔗糖溶液，蔗糖分为高 浓度蔗糖溶液和低浓度蔗糖溶液。高浓度蔗糖溶液为55 %~60 %，低浓度蔗糖溶液为： 25%~45%。根据蔗糖密度可以有效的分离具有免疫原性的实心病毒颗粒（沉降系数约 150S)和免疫原性较差或无免疫原性的空心病毒颗粒（沉降系数约80S)，从而达到选择性 收集目标区域的目的。本发明提供的密度梯度离心的方法，不但可以有效分离脊髓灰质炎 实心病毒颗粒与空心病毒颗粒。而且有效地去除了杂质蛋白，大大提高了离心产物中实心 病毒颗粒的含量，提高sIPV疫苗的纯度，疫苗的安全性和有效性。
[0034] 由上述技术方案，本发明至少具有以下优点及有益效果：
[0035]( -）通过本发明提供的方法可较简便有效地分离脊髓灰质炎I、II和III型病毒 的实心病毒颗粒与空心病毒颗粒，病毒纯度较高，有效滴度高，杂蛋白质去除比较彻底。
[0036](二）利用本发明提供的方法纯化的脊髓灰质炎病毒颗粒具有较强的免疫原性。
[0037](三）利用本发明提供的方法分离的脊髓灰质炎病毒抗原回收率高且疫苗的安全 性较高。
[0038](四）利用本发明提供的方法分离脊髓灰质炎病毒的生产成本比较低，适用于大 规模生产，可利用减毒株Sabin株生产脊髓灰质炎灭活疫苗。极大降低企业生产脊髓灰质 炎灭活疫苗的生产成本，克服了使用野毒株salk株作为生产原料，对生物安全等级要求严 格且数量有限、价格较高的问题，为采用减毒株Sabin株生产脊髓灰质炎灭活疫苗提供了 一种新的方法。
【具体实施方式】
[0039] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0040] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段； 实施例中所用的试剂为市售商品。
[0041] 实施例1细胞工作种子的制备与病毒液的制备
[0042] 1、高密度细胞工作种子制备
[0043] 使用199培养液稀释Vero细胞种子，稀释比例为60:1，接种到175cm2细胞方瓶中 培养，培养温度为36. 0°C±1°C。待细胞铺满细胞瓶，按1:4~1:6继续传代4代。最后一 代传至5个40层细胞工厂，进行胰酶消化，离心去上清。使用含10%DMS0的冻存液进行重 悬，混合后细胞浓度为2. 5X107cellS/ml。将细胞种子在程序降温仪进行梯度降温，保持每 分钟下降1°C。温度降至-196Γ后移至液氮中保存，工作细胞种子的有效期为10年。
[0044] 2、脊髓灰质炎I、II、III型原液的制备
[0045] (1) 一级细胞培养称取微载体，用0· 01MPBS溶胀过夜，用适量的PBS漂洗2次，置 于高压蒸汽灭菌柜121°C灭菌。将细胞种子从液氮中取出，在39±1°C的水浴中迅速摇动融 化，计数后，加入生长液中，进行一级细胞培养，培养体积约为5L。调整各培养参数，温度为 36. 5°C、pH值为7. 20、溶氧为50%、转速为30rpm。细胞培养至平台期时2. 5X106cells/ ml，进行消化传代。
[0046] (2)二级细胞培养将步骤（1)培养完成的细胞经消化制备成细胞悬液，接种至20L 细胞反应器，调整各培养参数，温度为36. 5 °C、pH值为7. 20、溶氧为50 %、转速为30rpm，开 始培养。细胞培养至平台期时5X106c