ells/ml，准备进行消化。
[0047] (3)三级细胞培养
[0048] 步骤（2)培养完成后的细胞制备成细胞悬液，接种至工作体积120L细胞反应 器中，设置温度为36. 5°C、pH值为7. 20、转速为30rpm、溶氧为50 %。细胞密度培养至 1. 5X106cells/ml准备接种病毒。
[0049] 3、病毒液培养按Μ0Ι0. 001分别接种脊髓灰质炎病毒Sabin株I、II、III型种子， 将培养参数调整为转速：30rpm，温度：32. 5 °C，pH值：7. 40,溶氧：25%。待微载体上细胞病 变超过95%，停止培养，收获病毒液，培养时间为49小时。
[0050] 4、病毒液的超滤浓缩
[0051] 1)澄清将病毒液经连续3级孔径为3-0. 8μm、0. 8-0. 65μm、0. 65-0. 22μm的滤芯 过滤或离心（包括连续流离心）转速为2000-500()rpm，离心时间为0. 5-4个小时，得到病毒 澄清液；
[0052] 2)浓缩病毒澄清液经300万截留分子量的Pall切向流膜过滤系统进行浓缩，浓缩 倍数为1〇〇倍。
[0053] 实施例2Sabin株脊髓灰质炎I型、II型、III病毒液的纯化与效果验证
[0054] 1、蔗糖溶液的低、高浓度分别为25%，55%。密度梯度离心缓冲液为0. 5mol/LPBS 缓冲液，其pH值为：6.5。使用日立CP70MX/ME超速离心机，依次从边孔以lOOrpm栗入100ml 超离心缓冲液，约700ml的实施例1超滤浓缩获得的sIPVI型（或sIPVII型或sIPVIII 型）病毒超滤液，低浓度蔗糖溶液500ml，最后以lOOrpm栗入高浓度蔗糖溶液直至中孔流 出液体，在4°C经30000rpm超滤离心10h。离心完成后，第一管收集500ml，之后用50ml离 心管收集，50ml/管，可以收集25-27管。检测每管的抗原含量和蛋白质含量，根据糖度的检 测结果等体积分别合并仅含有有效抗原成分的部分（糖度为54%的超离液1)，和含有混合 的非有效抗原成分和有效抗原成分的部分（糖度为50% -54%超离液2)对两种超离液的 糖度、抗原含量、蛋白含量、HCP含量，BSA含量和DNA含量进行检测，检测结果见表1、表2、 表3〇
[0055] 2、同时设对照试验：采用传统工艺分子筛层析同时进行病毒纯化，柱子型号为 1让16/100，填料为3印1^仰86(^68。上样量为柱体积的3.5%。群检测器检测波长260,280 和254nm。设置系统流速为15cm/h(0. 5ml/min)。收集第2个UV吸收峰，即分子筛纯化液。 检测抗原含量、蛋白含量、HCP含量、BSA含量和DNA含量，结果见表1、表2、表3。
[0056] 3、离子交换在XK50/30层析柱中，装入SephasoreDEAEFastFlow层析填料，连接 AKTAavantl50层析系统。用0. 15M的磷酸盐缓冲液（pH6. 5)进行平衡，分别对各型的超离 液1、超离液2和分子筛纯化液进行实验，检测紫外吸收波长280/254nm吸收值，收集流穿峰 即为脊灰I、Π和III型病毒纯化液。
[0057] 表1sIPVI型超离液1、超离液2和分子筛纯化液性质
[0058]
[0059] 表2sIPVII型超离液1、超离液2和分子筛纯化液性质
[0060]
[0061] 表3sIPVIII型超离液1、超离液2和分子筛纯化液性质
[0062]
[0063] 通过表1-表3研究结果显示，超离液1 (含实心病毒）的有效抗原成分含量不低 于超离液2 (含空心病毒和少量实心病毒）纯化液，远高于分子筛纯化液；而主要杂质DNA、BSA、HCP含量方面显著低于超离液2和分子筛纯化液。
[0064] 实施例3Sabin株脊髓灰质炎I型、II型、III纯化后的病毒液制备成疫苗的各项 指标评价
[0065] 1、杂质含量
[0066] 将实施例2获得的Sabin株脊髓灰质炎I型、II型、III型的超离液1和超离液 2,以及对照试验中使用传统工艺获得的分子筛纯化液，再进行离子交换、超滤浓缩和灭活 等纯化步骤，获得单价病毒原液。将获得的各型别的单价原液根据成品中抗原含量进行稀 释和等比例混合，最终成品的抗原含量为I型36DU，II型48DU，III型36DU。然后根据成 品定义的抗原量分别配比获得了成品1 (仅含有有效抗原成份）、成品2 (含有有效抗原成 份和非有效抗原成份）和成品3 (按传统工艺制备）。三个成品的杂质含量结果见表4。根 据统计分析，I型、II型和III型的成品1和成品2的杂质（牛血清白蛋白残留、Vero细胞 蛋白质残留、蛋白质含量、DNA残留）均有显著差异并小于成品2的杂质含量（P值均小于 0. 05) ;1型、II型和III型的成品1和成品3的相应杂质含量均有显著差异并小于成品3 的杂质含量（P值均小于〇. 05)。结果见表4。
[0067]表4 6批疫苗成品主要杂质残留量结果*
[0068]
[0070] *计算P值时如果数值为小于（〈）值，按照该值进行计算。如果数值为范围值，按 照范围上下限的平均值进行计算。
[0071] 2、免疫原性
[0072] 根据成品1、成品2和成品3检测的抗原含量，分别配制免疫原性样品，将上述样 品进行3倍系列稀释，共4个稀释度；同时将国际标准品稀释至I、II、III型的抗原含量至 iroU、45DU、4?U，并在此基础上进行3倍系列稀释，共4个稀释度样品，每个稀释度样品分 别进行单次两后肢肌肉免疫大鼠，〇. 5ml/只，10只（雌雄各半）每稀释度，免疫后21天采 血，分离血清，分别检测血清中抗I、II、III型的中和抗体滴度，计算血清阳转率。成品1、成 品2和成品3的血清阳转率和中和抗体几何平均值GMT水平见表5。根据统计分析，I型、 II型和III型的成品1和成品2的中和抗体GMT值均无显著差异（P值均大于0. 05) ;1型、 II型和III型的成品1和成品3的中和抗体GMT值均无显著差异（P值均大于0. 05)。三 种成品的免疫原性结果见表5。
[0073] 表5成品1、成品2及成品3免疫原性结果
[0074]
[0075] 3、稳定性
[0076] 将成品1、成品2和成品3储存在2_8°C环境下，按时间点取样检测抗原含量、外 观、pH值、渗透压摩尔浓度、细菌内毒素、甲醛含量、BSA含量、HCP含量、DNA含量、蛋白质含 量等。记录数据至18个月，结果见表6-表12。将成品1(仅含实心病毒）、成品2和成品 3在2-8°C环境下储存18个月，成品1的稳定性与成品2、成品3相当均未见明显下降；同 时，主要杂质含量成品1远低于成品2、成品3。稳定性结果见表6-表12。
[0077] 表6 2~8°C成品1的D-抗原含量检测结果（标示量的百分比）
[0078]
[0079] *标示量的百分比值是较0月值的百分比值。
[0080] 表7 2~8°C成品2的D-抗原含量检测结果（标示量的百分比）
[0081]
[0082] *标示量的百分比值是较0月值的百分比值。
[0083] 表8 2~8°C成品3的D-抗原含量检测结果（标示量的百分比）
[0084]
[0085]
[0086] *标示量的百分比值是较0月值的百分比值。
[0087] 表9 2~8°C蛋白质含量检测结果
[0088]
[0089] 表10 2~8°CDNA含量检测结果
[0090]
[0091] 表11 2~8UhiSA名、重恆测铦呆
[0092]
[0093] 表12 2~8°CHCP含量检测结果
[0094]
[0095]
[0096] 将成品1 (仅含实心病毒）、成品2和成品3在2_8°C环境下储存18个月，成品1 的稳定性与成品2、成品3相当均未见明显下降；同时，主要杂质含量方法，成品1远低于成 品2、成品3〇
[0097] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种纯化病毒液的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 待纯化的病毒超滤浓缩液进行蔗糖密度梯度离心； (2) 监测糖度，收集合并处于相同位置的离心液。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)的蔗糖密度梯度离心方法为： 依次从离心机边孔以50~lOOrpm依次栗入超离缓冲液，病毒超滤浓缩液，低浓度蔗 糖溶液，最后以50~150rpm栗入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体；离心转速为28000~ 35000rpm，离心时间为：6~20小时，离心温度为2~8°C。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，超离缓冲液与病毒超滤浓缩液的体积比 为1 :5~1 :10 ;病毒超滤浓缩液与低浓度蔗糖溶液的体积比为1 :1~2 :1 ;高浓度蔗糖加 入标准为只要离心机中空流出液体即可停止加入高浓度蔗糖。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述低浓度蔗糖质量百分比为25%~ 45%，高浓度蔗糖质量百分比为55%~60%。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，超离缓冲液选自0. 1~0. 5M的PB、PBS和 PBST中的一种。6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，步骤⑵的收集合并处于相同位置 的离心液是收集并合并处于相同位置的离心液，其中含实心病毒的离心液位于糖度54%的 糖度位置，含空心病毒和少量实心病毒的离心液位于50% -54%的糖度位置。7. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的病毒为脊髓灰质炎病毒。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎病毒 减毒株Sabin株I型、II型、III型。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当脊髓灰质炎病毒为Sabin株脊髓灰质炎 病毒I、II时，超离缓冲液的pH值为：6. 0~7. 0 ;当脊髓灰质炎病毒为Sabin株脊髓灰质炎 病毒III型时，超离心缓冲液的pH值为：6. 5~7. 5。10. 权利要求1-9任一所述方法在制备脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种纯化脊髓灰质炎病毒液的方法，属于生物制品制备技术领域。本发明的纯化脊髓灰质炎病毒液的方法是将脊髓灰质炎病毒液经过超滤浓缩、密度梯度离心或者连续流密度梯度离心、超滤脱蔗糖、除菌过滤得到的纯化的脊髓灰质炎病毒液。本发明方法不但可以有效分离脊髓灰质炎病毒液中的实心病毒颗粒与空心病毒颗粒，而且有效地去除了杂质蛋白，大大提高了离心产物中实心病毒颗粒的含量，有利于提高sIPV疫苗的纯度、安全性和有效性。
【IPC分类】A61K39/13, B01D21/26
【公开号】CN105396128
【申请号】CN201510765993
【发明人】惠增弟, 李育蓉, 吕哲, 王琳, 张星星, 高强, 尹卫东
【申请人】北京科兴中维生物技术有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月11日