Il-6在角膜上皮损伤修复中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于眼科疾病治疗技术领域，具体涉及IL-6在角膜上皮损伤修复中的应用。
【背景技术】
[0002]角膜的透明及功能的完整取决于角膜各层组织的结构和代谢的正常，而位于最外层的角膜上皮组织无疑对此起着相当重要的作用。
[0003]各种物理损伤、化学损伤、机械损伤、病原微生物、内分泌及免疫性因素均可导致角膜上皮损伤。角膜上皮是防御外界致病因子侵犯的物理屏障，其完整性的维持依赖于上皮细胞的细胞间，细胞与基底膜之间的紧密连接和锚定连接以及上皮细胞不断自我更新。角膜上皮层受损可影响细胞间的连接，引起细胞膜的通透性和选择性发生变化，从而影响其屏障功能，导致角膜易受外界致病因子的侵害引起炎症导致角膜混浊，甚至引起失明。角膜损伤后的再上皮化是损伤修复的一个最基本的过程，上皮化可以迅速重建上皮屏障，这对于保持角膜的结构完整及正常功能非常重要。角膜上皮细胞的不断更新依赖于基底细胞的不断增生、分化、移行与表层细胞的不断脱落之间的动态平衡。
[0004]角膜上皮损伤后的愈合是一个非常复杂的过程，有许多细胞参与，各种细胞又分泌多种细胞因子，这些细胞之间、因子之间、细胞和因子之间存在着错综复杂的关系，涉及到细胞运动、粘附、增殖和分化等各个方面，构成一个复杂的网络调控体系。
[0005]持续性角膜上皮缺损由于正常完整的上皮屏障作用被破坏，可以导致病原微生物易穿过前弹力层，侵入角膜实质层内，引起角膜炎症，角膜基质混浊，胶原融解形成角膜溃疡，角膜穿孔，甚至眼球丧失，后果严重。持续性角膜上皮缺损传统治疗方法包括:泪液替代物，角膜接触镜，眼睑缝合术，以及去除对上皮有毒害作用的防腐剂及药物。较新的治疗方法包括:羊膜移植术，纤维连接蛋白、生长因子、自体血清的应用、角膜缘干细胞移植术等。这些治疗方法的目的都是为了再去除病因的基础上促进角膜缘干细胞的增殖和活化，其中角膜缘干细胞移植的临床应用，为我们最终有效的治疗眼表疾病，恢复患者视功能，提供了一个新的治疗途径，因此如何促进自体的及移植的异体的角膜缘干细胞的功能的恢复和活化，是恢复角膜上皮细胞的屏障功能、促进创伤愈合的关键。但目前对于角膜缘干细胞生物学功能及其活化机制还不十分清楚。因此全面了解角膜缘干细胞增殖及活化的调节因素，对临床上治疗角膜上皮细胞屏障功能障碍及促进创伤愈合来讲具有积极的潜在治疗意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供白细胞介素-6(IL_6)在角膜上皮损伤修复中的应用，即白细胞介素_6在眼表角膜上皮干细胞的培养、持续性角膜上皮缺损、糖尿病角膜病变的治疗、神经性角膜炎的治疗、角膜缘干细胞缺乏症治疗中的应用。
[0007]本发明首先提供一种白细胞介素-6(IL_6)在制备角膜上皮损伤修复制品中的应用；
[0008]本发明同时还提供白细胞介素-6和miR-106a_5p抑制剂联合使用来制备角膜上皮损伤修复制品中的应用；
[0009]所述的制品优选为注射液；其中白细胞介素_6的浓度优选为20-100ng/ μ 1，
[0010]miR-106a-5p抑制剂在注射液中的优选为(λ 04-0.lnmol/ μ 1，
[0011]本发明还提供白细胞介素-6另一种的用途，是用于角膜上皮干细胞的培养；
[0012]其一种方法，是在培养角膜上皮干细胞的培养基中添加白细胞介素-6 ;其添加浓度为 20_100ng/ml，
[0013]作为优选，培养基中还添加有miR-106a-5p抑制剂；其添加浓度为0.1-0.5nmol/ml ；
[0014]本发明发现IL-6不仅能促进角膜缘干细胞增殖和克隆形成能力，还能促进正常小鼠的角膜上皮的损伤修复，使细胞拥有了更强的角膜缘干细胞增殖和克隆形成能力。可用于眼表角膜上皮干细胞的培养、持续性角膜上皮缺损的治疗、糖尿病角膜病变的治疗、神经性角膜炎的治疗、角膜缘干细胞缺乏症的治疗。
【附图说明】
[0015]图1:1L-6对TKE2细胞克隆形成能力的影响。在TKE2的培养基中添加不同浓度的IL-6对细胞克隆形成能力的影响，培养液中添加20ng/ml IL-6能有效促进TKE2细胞克隆的形成能力。
[0016]图2:1L-6对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响，结膜下注射50ng IL-6能有效促进角膜上皮的损伤修复。
[0017]图3:IL-6对miR-106a-5p表达水平的影响。
[0018]图4:IL-6及miR-106a-5p激动剂或抑制剂联合使用对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响。
【具体实施方式】
[0019]本发明在小鼠角膜上皮干细胞系TKE2的培养基KSFM中添加一定剂量的IL-6 (例如20ng/ μ 1)不仅能促进角膜缘干细胞增殖和克隆形成能力，还能促进正常小鼠的角膜上皮的损伤修复；从而促成了本发明。
[0020]白细胞介素_6是一种多效能细胞因子，其结合可溶性IL-6受体(solybleinterle μ kin-6receptor, sIL_6R)形成 IL-6/SIL-6R 复合物。
[0021 ] miR-106a位于人类染色体Xq26.2，是由miR-106a_363生成的重要成熟体miRNA。miR-106a属于miR-17家族，是由6个序列相似，结构相仿，种子区序列相同(AAAG μ GC μ )，物种间高度保守的成熟体miRNA组成。其成员包括:miR-17_5p，miR-20a ；miR_106b，miR-93，miR_106a，miR_20b。
[0022]实施例1:1L_6促进TKE2细胞克隆形成能力
[0023]应用TKE2 细胞的培养液(Keratinocyte-SFM 加 ΒΡΕ (50 μ g/mL)和 rEGF (5ng/mL):GIBCO, 10724-011)常规培养TKE2细胞，将1000个细胞接种至30mm培养皿中，向皿中添加IL-6 (20ng/ml)，然后于5% C02和37摄氏度的条件下培养，每3天更换新培养基，同时添加上述浓度的IL-6因子，培养9天后固定细胞后使用结晶紫染色。IL-6处理后的细胞克隆生长情况见图1。如图1所示，培养液中添加20-50ng/ml的IL-6能有效促进TKE2细胞克隆的形成能力。
[0024]实施例2:外源性添加IL-6对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响
[0025]将12只C57BL/6小鼠(6_8周龄)随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射5 μ 1PBS,实验组小鼠右眼结膜下注射50ng IL-6 (溶解于5 μ 1 PBS)，于建模后24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，代表性裂隙灯观察照片见图2。如图2所示，结膜下注射50ng IL-6能有效促进角膜上皮的损伤修复。
[0026]实施例3:IL-6抑制miR-106a_5p表达水平的影响
[0027]应用TKE2 细胞的培养液(Keratinocyte-SFM 加 ΒΡΕ (50 μ g/mL)和 rEGF (5ng/mL):GIBCO, 10724-011)常规培养TKE2细胞，将105个细胞接种至60mm培养皿中，然后于5 %C02和37摄氏度的条件下培养24h，向皿中添加IL-6(20ng/ml)，分别于5% C02和37摄氏度的条件下孵育培养Omin、15min及30min后，提取各组样品的RNA并反转录为cDNA，应用实时定量PCR方法检测各组中miR-106a-5p的表达水平。如图3所示，IL-6作用15min及30min，均能明显抑制miR-106a_5p的表达水平。
[0028]实施例4:IL-6及miR-106a_5p激动剂或抑制剂联合使用对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响
[0029]将24只C57BL/6小鼠(6_8周龄)随机分为四组:PBS对照组、IL-6组、IL-6联合miR-106a-5p激动剂组、IL-6联合miR-106a_5p抑制剂组。使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时PBS对照组小鼠右眼结膜下注射5 μ 1 PBS, IL-6组小鼠右眼结膜下注射50ng IL-6 (溶解于5 μ 1 PBS)，IL-6联合miR-106a_5p激动剂组小鼠右眼结膜下注射50ng IL-6及0.3nmol miR-106a_5p激动剂(溶解于5 μ 1 PBS)，IL-6联合miR-106a_5p激动剂组小鼠右眼结膜下注射50ng IL-6及0.3nmol miR-106a_5p抑制剂(溶解于5 μ 1 PBS)，于建模后24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，代表性裂隙灯观察照片见图4。如图4所示，建模后48h，结膜下注射50ng IL-6能有效促进角膜上皮的损伤修复；IL_6联合miR-106a_5p抑制剂组与IL-6组相比，其促进角膜上皮损伤修复的作用更加明显。
【主权项】
1.一种白细胞介素-6的应用，其特征在于，所述的应用是白细胞介素-6在制备角膜上皮损伤修复制品中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的白细胞介素_6和miR-106a-5p抑制剂联合使用来制备角膜上皮损伤修复制品。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的制品为注射液。4.一种注射液注射液，其特征在于，所述的注射液中包含有白细胞介素_6和/或miR-106a-5p 抑制剂。5.如权利要求4所述的注射液，其特征在于，所述的白细胞介素_6的浓度为20_100ng/μ 1。6.如权利要求4或5所述的注射液，其特征在于，所述的miR-106a-5p抑制剂的浓度为0.04-0.lnmol/μ 1。7.一种白细胞介素_6的应用，其特征在于，所述的应用是在角膜上皮干细胞培养中的应用。8.一种培养角膜上皮干细胞的方法，其特征在于，所述的方法是在培养角膜上皮干细胞的培养基中添加白细胞介素_6。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的白细胞介素-6添加浓度为20_100ng/ml。10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的培养基中还添加有miR-106a-5p 抑制剂。
【专利摘要】本发明的目的是提供白细胞介素-6在角膜上皮损伤修复中的应用，即白细胞介素-6在眼表角膜上皮干细胞的培养、持续性角膜上皮缺损、糖尿病角膜病变的治疗、神经性角膜炎的治疗、角膜缘干细胞缺乏症治疗中的应用。本发明发现IL-6不仅能促进角膜缘干细胞增殖和克隆形成能力，还能促进正常小鼠的角膜上皮的损伤修复，使细胞拥有了更强的角膜缘干细胞增殖和克隆形成能力。可用于眼表角膜上皮干细胞的培养、持续性角膜上皮缺损的治疗、糖尿病角膜病变的治疗、神经性角膜炎的治疗、角膜缘干细胞缺乏症的治疗。
【IPC分类】C12N5/074, A61K45/06, A61K38/20, A61K9/08, A61P27/02
【公开号】CN105396125
【申请号】CN201510848796
【发明人】陈鹏, 周庆军, 刘卫卫, 翟华蕾, 王君怡, 张阳阳
【申请人】山东省眼科研究所
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月26日