Sirt1在角膜神经损伤修复中的应用
【专利摘要】本发明提供Sirt1在角膜神经损伤修复中的应用，本发明发现Sirt1不仅能促进角膜神经损伤修复，还能促进角膜上皮的损伤修复，同时也能促进三叉神经节细胞轴突生长。可用于三叉神经节细胞培养、持续性角膜上皮缺损的修复、糖尿病角膜神经损害的修复、神经性角膜炎的修复。而且，沉默信号调控因子1和miR?182?5p激动剂联合使用对于角膜神经损伤修复的效果更好。
【专利说明】
Si rt1在角膜神经损伤修复中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于眼科疾病治疗技术领域，具体涉及沉默信号调控因子I(Sirtl)在角膜 神经损伤修复中的应用。
【背景技术】
[0002] 角膜是一种无血管的透明组织，其营养物质主要来自泪液、房水、及神经纤维。角 膜含有丰富的神经纤维，是人体内神经最密集的组织之一，对于冷、热、痛、触压等都有敏锐 的感觉。角膜神经由三叉神经眼支发出，在维持角膜组织，尤其是角膜上皮功能和解剖完整 性等方面起重要作用。角膜神经损伤后会引起角膜知觉减退，导致神经营养性角膜上皮病 变，主要表现包括反复的上皮糜烂、上皮再生迟缓、持续性上皮缺损、溃疡以及持续性炎症 反应等。
[0003] 角膜神经属于外周神经，具有再生能力。然而，通常角膜的神经再生是不完全的。 角膜神经的再生方式有两种:一种是由伤口周围未受损的神经和伤口内再生的实质层神经 出芽再生，另一种是由伤口周围粗的神经干相继发出细的和中等粗的神经纤维，这是一种 实质层和上皮下神经的真正再生。有学者发现角膜神经再生分为两个时期，首先创伤区内 的所有神经在短期内发生变性，同时可见来自伤口周围完整上皮下丛的粗大而且密集的神 经轴索，垂直于伤口边缘走行;其次是伤口极向轴索的变性与第二代轴索的出现，这些轴索 来自伤口边缘或近伤口边缘的再生的上皮下轴索。
[0004] 随着角膜屈光术、角膜移植手术以及白内障等眼部手术的广泛开展，术后所表现 出的角膜神经损伤问题也日益呈现，由于角膜神经损伤导致的持续的上皮缺损及反复的上 皮剥脱，大大增加了患者眼部感染的风险，已经成为一种潜在的致盲性病变。由于角膜神经 的损害，导致角膜的营养与代谢发生障碍，是引起角膜病变反复发作，难以治疗的根本原 因。
[0005] 目前角膜神经损伤修复的治疗主要依靠药物，如神经生长因子(NGF)点眼液。另 外，针对角膜神经损伤引起的持续性角膜上皮缺损，还有很多对症治疗，如泪液替代物，角 膜接触镜，眼睑缝合术，生长因子、自体血清的应用等。近年来又出现了羊膜移植术与角膜 缘干细胞移植术等手术方式，促进持续性角膜上皮缺损的愈合，但是这些治疗方法对于角 膜神经的损伤修复作用不大，未能从根本上解决角膜神经再生的问题。因此，寻找新的促进 角膜神经再生的因子与途径，对临床上治疗角膜损伤修复具有积极的潜在治疗意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供沉默信号调控因子I(Sirtl)在角膜神经损伤修复中的应用， 及沉默信号调控因子1在角膜神经再生、持续性角膜上皮缺乏、糖尿病角膜病变的治疗、神 经性角膜炎的治疗中的应用。
[0007] 本发明一个方面是提供沉默信号调控因子I(Sirtl)在制备角膜神经损伤修复制 品中的应用；
[0008] 本发明同时还提供沉默信号调控因子1和miR-182-5p激动剂联合使用来制备角膜 神经损伤修复制品中的应用；
[0009] 作为实施例优选，制品中沉默信号调控因子1的浓度优选为20-50ngAil;miR-182-5p激动剂优选浓度为0 · 1-0 · 5nmol/ml，
[0010] 角膜神经损伤修复中对三叉神经眼支的修复占主要作用，因此体外培养三叉神经 节细胞，并观察沉默信号调控因子1对三叉神经节细胞轴突生长的影响至关重要。
[0011] 因此，本发明另一个方面是提供沉默信号调控因子1在制备培养三叉神经节细胞 培养制品中的应用，
[0012] 上述的应用，其中沉默信号调控因子1和miR-182-5p激动剂联合使用；
[0013]本发明再一个方面提供一种培养三叉神经节细胞的方法，是在培养三叉神经节细 胞的培养基中添加Sirtl;
[0014] 作为实施例的优选，Sirtl的添加浓度为20-100ng/ml，
[0015] 更进一步的，培养基中还添加有miR-182-5p激动剂；
[0016] 作为实施例的优选，miR-182-5p激动剂的添加浓度为0.1-0.5nmol/ml;
[0017] 本发明发现Sirtl不仅能促进角膜神经损伤修复，还能促进角膜上皮的损伤修复， 同时也能促进三叉神经节细胞轴突生长。可用于三叉神经节细胞培养、持续性角膜上皮缺 损的修复、糖尿病角膜神经损害的修复、神经性角膜炎的修复。
【附图说明】
[0018] 图I = Sirtl对三叉神经节细胞轴突生长的促进作用图。在三叉神经节细胞的培养 基中添加不同浓度的Sirtl，20ng/ml Sirtl能有效促进三叉神经节细胞轴突生长。
[0019] 图2: Sirtl与miR-182-5p激动剂联合使用促进小鼠三叉神经节细胞轴突生长的 图。在三叉神经节细胞的培养基中添加 20ng/ml Sirtl，同时在培养液中添加 0. 1或 0.5nmol/ml的miR-182-5p激动剂后，三叉神经节细胞轴突长度显著增加，且轴突的分支显 著增加。
[0020] 图3:外源性添加Sirtl对正常小鼠角膜角膜神经损伤修复的影响图。结膜下注射 50ng Sirtl能有效促进角膜神经的再生。
[0021] 图4:Sirtl对miR-182-5p表达水平的影响图。
[0022]图5: Sirtl及miR-182-5p激动剂或抑制剂联合使用对正常小鼠角膜上皮损伤修复 的图。结膜下注射50ng Sirtl能有效促进角膜上皮的损伤修复;Sirtl联合miR-182-5p激动 剂组与Sirtl组相比，其促进角膜上皮损伤修复的作用更加明显。而Sirtl联合miR-182-5p 抑制剂组与Sirtl组相比，其促进角膜上皮损伤修复的作用显著减弱。
【具体实施方式】
[0023]本发明在小鼠三叉神经节细胞的培养基中添加一定剂量的Sirtl (例如20ng/ml)， 不仅能促进三叉神经节细胞生长，而且显著促进三叉神经节细胞轴突的生长;从而促成了 本发明。
[0024]沉默信号调控因子1是存在于哺乳动物的酵母染色质沉默子Sir2同源体，是一种 依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶。
[0025] miR-182定位于人7号染色体(7q32.2)，与miR-96、miR-183形成了一个基因簇，其 序列为:5' -uuuggcaaugguagaacucacacu-3'。1]1丨1?-182-5口激动剂是运用化学方法合成，并采 用化学修饰的miRNA激动剂，稳定性更高，适合进行长期的miRNA功能研究，通过模拟miRNA 调节靶mRNA的表达而发挥作用。miR-182-5p激动剂在动物体内具有更高的稳定性和miRNA 促进效果。且能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。在动物实验中可以用全身或局 部注射、吸入、喂药等方法进行给药，作用效果持续时间可长达6周。
[0026] 下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述 [0027]实施例1 = Sirtl促进小鼠三叉神经节细胞轴突生长
[0028] 应用三叉神经节细胞的培养液（Neurobasal?培养基，Invitrogen/Gibco，货号 21103-049)，加B27(10X)(Invitrogen/Gibco,货号 17504-044)。常规培养三叉神经节细胞， 将1000个细胞接种至30mm培养皿中，然后于5 % CO2和37 °C的条件下培养，每3天更换新培养 基，同时添加Sirt 1因子，培养9天后固定细胞，使用神经元特异性标志物Tubulin III染色， 观察三叉神经节细胞轴突生长情况。如图1所示，培养液中添加20-50ng/ml的Sirtl后，三叉 神经节细胞轴突长度显著增加，且轴突的分支显著增加，说明Sirtl能有效促进三叉神经节 细胞轴突生长。
[0029]实施例2: Sirtl与miR-182-5p激动剂联合使用促进小鼠三叉神经节细胞轴突生长
[0030] 应用三叉神经节细胞的培养液(NeurobasaK培养基，Invitrogen/Gibco，货号 21103-049)，加B27(10X)(Invitrogen/Gibco,货号 17504-044)。常规培养三叉神经节细胞， 将1000个细胞接种至30mm培养皿中，向皿中添加Sirtl(20ng/ml)，然后于5%⑶ 2和37°C的 条件下培养，每3天更换新培养基，添加浓度为0.1或0.5nmol/ml的miR-182-5p激动剂，培养 9天后固定细胞，使用神经元特异性标志物Tubulin III染色，观察三叉神经节细胞轴突生 长情况。如图2所示，培养液中添加0.1或0.5nmo Ι/ml的miR-182-5p激动剂后，三叉神经节细 胞轴突长度显著增加，且轴突的分支显著增加，说明Sirtl与miR-182-5p激动剂联合使用能 有效促进三叉神经节细胞轴突生长。
[0031] 实施例3:外源性添加Sirtl对正常小鼠角膜角膜神经损伤修复的影响
[0032] 将12只C57BL/6小鼠（6-8周龄）随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮 刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射5μ1 PBS，实 验组小鼠右眼结膜下注射50ng Sirtl(溶解于5μ1 PBS溶液中），于建模后21天使用神经元 特异性标志物Tubulin III染色观察各组小鼠的角膜神经再生情况，代表性照片见图3。如 图3所示，结膜下注射50ng Sirtl能有效促进角膜神经的再生。
[0033] 实施例4:3丨竹1抑制11^1?-182-5?表达水平的影响
[0034] 应用三叉神经节细胞的培养液（.Heurobasa丨⑧.培养基，Invitrogen/Gibco,货号 21103-049)，加B27(10X)(Invitrogen/Gibco,货号 17504-044)。常规培养三叉神经节细胞， 将IO5个细胞接种至60mm培养皿中，然后于5 %⑶2和37 °C的条件下培养24h，向皿中添加 Sirtl(20ng/ml)，分别于5%C02和37°C的条件下孵育培养0min、15min及30min后，提取各组 样品的RNA并反转录为cDNA，应用实时定量PCR方法检测各组中miR-182-5p的表达水平。如 图4所示，Sirtl作用15min及30min，均能明显抑制miR-182_5p的表达水平。
[0035]实施例5: Sirtl及miR-182-5p激动剂或抑制剂联合使用对正常小鼠角膜上皮损伤 修复的影响
[0036] 将24只C57BL/6小鼠（6-8周龄）随机分为四组：PBS对照组、Sirtl组、Sirtl联合 miR-182-5p激动剂组、Sirtl联合miR-182-5p抑制剂组。使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠 右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时PBS对照组小鼠右眼结膜下注射5μ1 PBS，Sirtl组小 鼠右眼结膜下注射50ng Sirtl(溶解于5μ1 PBS)，Sirtl联合miR-182-5p激动剂组小鼠右眼 结膜下注射50ng Sirtl及0.3nmol miR-182_5p激动剂（溶解于5μ1 PBS)，Sirtl联合miR-182-5p激动剂组小鼠右眼结膜下注射50ng Sirtl及0.3nmol miR-182-5p抑制剂(溶解于5μ I PBS)，于建模后24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上 皮损伤修复的情况，代表性裂隙灯观察照片见图5。如图5所示，建模后48h，结膜下注射50ng Sirtl能有效促进角膜上皮的损伤修复;Sirtl联合miR-182-5p激动剂组与Sirtl组相比，其 促进角膜上皮损伤修复的作用更加明显。而Sirtl联合miR-182-5p抑制剂组与Sirtl组相 比，其促进角膜上皮损伤修复的作用显著减弱。
【主权项】
1. 沉默信号调控因子1在制备角膜神经损伤修复与再生制品中的应用。2. 沉默信号调控因子1和miR-182-5p激动剂在制备角膜神经损伤修复与再生制品中的 应用。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的制品中沉默信号调控因子1的浓度为 2〇-100ng/yl〇4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的制品中miR-182-5p激动剂浓度为 0.04-0.lnmol/μL〇5. 沉默信号调控因子1在三叉神经节细胞培养中的应用。6. 沉默信号调控因子1和miR-182-5p激动剂联合使用在三叉神经节细胞培养中的应 用。7. -种培养三叉神经节细胞的方法，其特征在于，所述的方法是在培养三叉神经节细 胞的培养基中添加 Sirtl。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法是在培养三叉神经节细胞的培养 基中还添加有miR-182-5p激动剂。9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的Sirtl添加浓度为20-100ng/ml。10. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的miR-182-5p激动剂添加浓度为0.1- 0.5nmol/ml〇
【文档编号】A61K45/06GK105963683SQ201610505085
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】王晔, 牟晓峰, 张蓉, 慕莹
【申请人】青岛市中心医院