含双因子的外周神经损伤修复胶原材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种修复外周神经损伤的胶原材料的制备方法。该方法可包括如下步骤：将带有胶原结合区的睫状神经营养因子(CBD-CNTF)和带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子(CBD-bFGF)与有序胶原材料共同孵育，得到所述修复外周神经损伤的胶原材料。本发明首次将两种因子CBD-CNTF和CBD-bFGF同时交联到有序胶原支架材料上，通过建立动物外周神经—面神经长横断损伤模型，评价含双因子的外周神经损伤修复胶原材料在长横断面神经损伤修复中发挥的作用。结果证实，含双因子的外周神经损伤修复胶原材料，和单因子CBD-CNTF或CBD-bFGF功能胶原支架材料相比可以更好地促进面神经的再生和功能的恢复，该功能材料在未来临床外周神经损伤修复的应用具有更为重要的现实指导意义。
【专利说明】含双因子的外周神经损伤修复胶原材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医用材料领域，涉及一种修复外周神经损伤的胶原材料，特别涉及一种含双因子的外周神经损伤修复胶原材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]外周神经损伤是临床常见的疾病之一，目前临床上应用的直接断端缝合技术或自体神经移植方法，由于具有其应用的局限性，不能充分解决临床困难。随着组织工程的发展，采用组织工程方法促进神经再生以修复周围神经损伤成为研究热点。
[0003]胶原支架材料能够为轴突的生长搭桥，起到引导轴突生长的作用。胶原蛋白是一种在组织工程中广泛应用的生物材料，它 免疫原性低，生物相容性好，可降解性能好。本发明的发明人所在实验室前期工作中制备的有序胶原材料(LOCS)是一种很好的神经生长引导材料，能引导神经细胞轴突沿有序胶原材料细丝的方向生长，这样，就能引导神经元形成正确的突触连接，有助于神经功能的恢复[Ma F，Xiao Z, Chen B, Hou X，Dai J, Xu R.Linearordered collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growthfactor facilitate recovery of sciatic nerve injury in rats.Tissue engineering PartA.2014 ；20:1253-62.Cao J，Xiao Z，Jin Wj Chen B，Meng D，Ding Wj et al.1nduction of ratfacial nerve regeneration by functional collagen scaffolds.Biomaterials.2013 ；34:1302-10.]
[0004]同时，有序胶原材料能结合神经营养因子，可以作为神经营养因子的载体。目前，尚未有关于结合双因子的外周神经损伤修复胶原支架材料在外周神经损伤修复中发挥作用的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种修复外周神经损伤的胶原材料及其制备方法。
[0006]本发明所提供的修复外周神经损伤的胶原材料的制备方法，具体可包括如下步骤:将带有胶原结合区的睫状神经营养因子和带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子与有序胶原材料共同孵育，得到所述修复外周神经损伤的胶原材料。
[0007]在所述方法中，所述带有胶原结合区的睫状神经营养因子(CBD-CNTF)、所述带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子(CBD-bFGF)和所述有序胶原材料的配比可为300-500 μ g =300-500 μ g:70_130mg。在本发明的一个实施例中，所述带有胶原结合区的睫状神经营养因子(CBD-CNTF)、所述带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子(CBD-bFGF)和所述有序胶原材料的配比具体为400 μ g:400 μ g:100mg。
[0008]在所述方法中，所述孵育可为25_37°C (如25°C )孵育0.5-1小时(如I小时)。
[0009]在所述方法中，所述孵育时的液体环境具体为1XPBS。
[0010]所述IXPBS的pH为7.4，溶剂为水，溶质及其浓度如下:磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠1.42g/L，氯化钠8g/L，氯化钾0.2g/L。[0011]在本发明中，所述孵育具体为:将IOOmg的所述有序胶原材料(如直径为50 μ m的有序胶原纤维)浸泡在0.5mL含400 yg所述带有胶原结合区的睫状神经营养因子(CBD-CNTF)和400 μ g所述带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子(CBD_bFGF)的所述IXPBS中，25°C孵育I小时。
[0012]在本发明中，所述带有胶原结合区的睫状神经营养因子(CBD-CNTF)的氨基酸序列为如下(a)或(b);所述带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子(CBD-bFGF)的氨基酸序列为如下(c)或(d):
[0013](a)序列表中序列I的第22-243位；
[0014](b)序列表中序列I ;
[0015](c)序列表中序列2的第22-197位；
[0016](d)序列表中序列2。
[0017]其中，(b)相对(a)在氨基端连接有6个His标签；(d)相对(c)在氨基端连接有6个His标签。
[0018]在本发明中，所述有序胶原材料(LOCS)的制备方法，具体可包括如下步骤:
[0019]I)将牛筋膜用体积百分浓度为1-1.5% (如1% )的磷酸三丁酯溶液处理24-72小时(如48小时)；
[0020]2)用含有 0.5-1.5mol/L (如 lmol/L) NaCl 的 25-100mmol/L (如 50mmol/L)、pH 为
7.6-8.5 (如pH为8.0)的Tris-HCl缓冲液处理24-72小时(如48小时)；
[0021]3)用 1.25Χ105-3.75 X IO5U (如(2.5 X IO5U))胰蛋白酶/IOOmL 缓冲液处理 48-96小时(如72小时)，得到所述有序胶原材料；所述缓冲液为25-lOOmmol/L(如50mmol/L)Tri s-HCl，pH 为 7-8(如 pH 为 8)；
[0022]上述处理的温度均为2_8°C (如4°C )。
[0023]进一步，在步骤3)用胰蛋白酶处理后，还可包括用0.5-1.5mol/L强碱溶液(如IMNaOH水溶液)处理5-10分钟(如5分钟)步骤。
[0024]步骤I)中所述磷酸三丁酯溶液的溶剂为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，如25-100mmol/L (如 50mmol/L)、pH 为 7.6-8.5 (如 pH 为 8.0)的 Tris-HCl 缓冲液。
[0025]步骤I)中，所述牛筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂肪。
[0026]利用上述方法制备得到的修复外周神经损伤的胶原材料也属于本发明的保护范围。
[0027]本发明的另一个目的是提供一种修复外周神经损伤的胶原支架及其制备方法。
[0028]本发明所提供的修复外周神经损伤的胶原支架的制备方法，具体可包括如下步骤:
[0029](I)根据待修复外周神经损伤部位的半径，采用胶原膜制备相同半径的胶原管；
[0030](2)向步骤(1)制备得到的胶原管中填充所述修复外周神经损伤的胶原材料，即获得了所述修复外周神经损伤的胶原支架。
[0031]在所述方法中，步骤(1)具体可为:根据待修复外周神经损伤部位的半径，找到相同半径的模具(材质可为玻璃或塑料)，将胶原膜用水(如三蒸水)浸泡I~2min (如2min)(使胶原膜软透)，将浸泡过的胶原膜绕所述模具缠绕5/4圈，绕好后用液态胶原涂裹一圈，风干，10~30°C (如25°C )放置12小时使之交联，去除所述模具，获得所述胶原管。
[0032]步骤(1)中，在去除所述模具后还包括将所述胶原管冻干、辐照的步骤。
[0033]在所述方法中，步骤(2)中所述填充为将所述胶原管填充至占一半空间。
[0034]利用所述方法制备得到的修复外周神经损伤的胶原支架也属于本发明的保护范围。
[0035]另外，以上所述的修复外周神经损伤的胶原材料，或所述的修复外周神经损伤的胶原支架在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围:
[0036](al)制备促进外周神经再生的材料；
[0037](a2)制备促进外周神经横断部位电生理恢复的材料；
[0038](a3)制备促进外周神经受损部位SlOO蛋白和/或神经丝蛋白表达的材料；
[0039](a4)制备促进外周神经受损部位髓鞘直径和髓鞘壁厚度增加的材料。
[0040]在本发明中，所述外周神经具体为面神经；所述外周神经损伤具体为面神经长横断损伤。更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述面神经长横断损伤是指将小型猪(如13月龄)的面神经游离切断3.5cm。
[0041]本发明首次将两种 因子CBD-CNTF和CBD-bFGF同时交联到有序胶原支架材料上，通过建立动物外周神经一面神经长横断损伤模型，评价含双因子的外周神经损伤修复胶原材料在长横断面神经损伤修复中发挥的作用。结果证实，本发明所提供的含双因子的外周神经损伤修复胶原材料，可以促进外周神经再生、促进外周神经横断部位电生理恢复、促进外周神经受损部位SlOO蛋白和神经丝蛋白NF的表达、促进外周神经受损部位髓鞘直径和髓鞘壁厚度的增加。可见，该功能材料在未来临床外周神经损伤修复的应用具有更为重要的现实指导意义。本发明为未来双因子功能性胶原支架应用于临床提供了良好的技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为外周神经损伤修复胶原支架材料的形态。其中，A为胶原导管交联前胶原膜的形态和C分别为交联后神经管的短径和长径；D为胶原导管中填充的有序胶原材料的形态。
[0043]图2为小型猪的面神经横断损伤模型的建立和功能神经导管桥接损伤面神经断端示意图。其中，A为小型猪的面神经横断损伤模型的建立；B为功能神经导管桥接损伤面神经断端示意图。
[0044]图3为大体形态学观察各治疗组面神经再生的情况。
[0045]图4为电生理检查各治疗组复合肌肉动作电位比值的情况。其中，A为损伤近端复合肌肉动作电位比值；B为损伤远端复合肌肉动作电位比。**表示与LOCS组相比P〈0.01。
[0046]图5为免疫组化检测施旺细胞特异性标志物SlOO蛋白的表达情况。其中,A为免疫组化照片为SlOO蛋白定量表达情况柱形图表示与LOCS组相比P〈0.01)。PNS表示神经损伤的近端；DNS表示神经损伤的远端。
[0047]图6为免疫组化检测神经丝蛋白(NF)的表达情况。其中,A为免疫组化照片；B为NF蛋白表达情况柱形图(林表示与LOCS组相比P〈0.01)。PNS表示神经损伤的近端；DNS表示神经损伤的远端。[0048]图7为透射电镜观察髓鞘直径大小及髓鞘壁厚度。其中，A为透射电镜照片；B为髓鞘直径大小及髓鞘壁厚度情况柱形图(**表示与LOCS组相比P〈0.01)。PNS表示神经损伤的近端；DNS表示神经损伤的远端；RS表示神经损伤中间再生部位。
[0049]图8为有序胶原材料(LOCS)的形态图。其中A、B分别表示片状和纤维状的LOCS ；C为LOCS的扫描电镜照片。
【具体实施方式】
[0050]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 [0051]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052]材料说明:
[0053]一、有序胶原材料，由本实验室制备，方法如参考专利ZL200510098731.5，具体步骤如下:
[0054](一 )取材与处理
[0055]1、预处理筋膜
[0056]取新鲜带有白色筋膜的成年牛肌肉，用冷的去离子水冲洗3遍；用镊子和手术刀分离出筋膜，尽量去除内层粘附的肌肉组织，和外层的脂肪等组织。
[0057]2、材料制备
[0058]将步骤I获得的预处理筋膜按如下步骤处理:
[0059]I)置于I % (体积百分比)TnBP(磷酸三丁酯)溶液(50mM Tris-HCl缓冲液，ρΗ8.0)中处理48小时；
[0060]2) 50mM Tris-HCl 缓冲液(ρΗ8.0，含有 IM NaCl)中处理 48 小时；
[0061]3) Ig (2.5 X IO5U)胰蛋白酶/100ml (50mM Tris-HCl 缓冲液，pH8.0)中处理 72 小时；其中，胰蛋白酶为Amresco公司产品，其产品目录号为9002-07-7。
[0062]4) IM NaOH中处理5分钟，充分清洗至中性。
[0063]冻干，即得本发明的有序胶原材料(Linearordered collagen scaffolds, LOCS)。
[0064]( 二)材料的形态
[0065]所得的有序胶原材料LOCS为白色片状形态，还可以将其制备为有序的管状或者胶原纤维。LOCS的形态图如图8所示，图8中A、B分别表示片状和纤维状的L0CS，图8中C为LOCS的扫描电镜照片。从图中可以看出，LOCS保持了天然胶原纤维的结构，其电镜照片显示了它具有有序的表面结构，其粗糙的表面结构也有利于细胞的粘附。
[0066]二、带有胶原结合区的睫状神经营养因子(CBD-CNTF)带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子(CBD-bFGF)，由本实验室制备并纯化获得，具体方法如下:
[0067]1、构建带有CBD-CNTF或CBD-bFGF的表达载体
[0068](I)人工合成编码CBD-CNTF蛋白(序列I的第22_243位)的基因序列(序列3的第64-735位)，并在两端分别加上酶切位点NdeI和XhoI的识别序列，得到序列表中序列3的第58-741位，将其所示DNA片段记为DNA片段I。
[0069](2)人工合成编码CBD-bFGF蛋白(序列2的第22-197位)的基因序列(序列4的第64-594)，并在两端分别加上酶切位点NdeI和XhoI的识别序列，得到序列表中序列4的第58-600位，将其所示DNA片段记为DNA片段2。[0070](3)用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切DNA片段1，回收酶切片段与经过同样双酶切的pET28a载体(购自Novagen公司，货号:69864-3)的骨架大片段相连，得到重组质粒。将经测序表明将pET28a载体的酶切位点NdeI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列3的第64-735位所示DNA片段的重组质粒命名为pET_CBD_CNTF。在重组表达载体pET-CBD-CNTF中，CBD-CNTF基因的上游连接有6个His标签。带有6个His标签的6His-CBD-CNTF融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1，其对应的编码基因的序列为序列表中序列3的第1-735位。
[0071](4)用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切DNA片段2，回收酶切片段与经过同样双酶切的pET28a载体(购自Novagen公司，货号:69864-3)的骨架大片段相连，得到重组质粒。将经测序表明将pET28a载体的酶切位点NdeI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列4的第64-594位所示DNA片段的重组质粒命名为pET_CBD_bFGF。在重组表达载体pET-CBD-bFGF中，CBD-bFGF基因的上游连接有6个His标签。带有6个His标签的6His-CBD-bFGF融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2，其对应的编码基因的序列为序列表中序列4的第1-594位。
[0072]2、CBD-CNTF 和 CBD-bFGF 的表达及纯化
[0073]利用原核表达系统表达CBD-CNTF和CBD-bFGF。将步骤I构建的重组表达载体pET-CBD-CNTF和pET_CBD_bFGF分别转入大肠杆菌BL21感受态细胞。转至LB培养基中进行扩大培养，待菌液0D600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为lmM，37°C诱导6_8h。8000rpm4°C离心收集菌体，超声破碎菌体，12000rpm4°C离心分离上清和包涵体。镍柱纯化，对纯化好的CBD-CNTF和CBD-bFGF进行蛋白复性。
[0074]实施例1 、修复外周神经损伤的胶原支架的制备
[0075]一、含双因子的外周神经损伤功能修复胶原支架的制备
[0076]1、胶原管的制备
[0077]根据所要修复神经损伤部位的半径，找到相同半径的模具，模具选择为玻璃或塑料，将胶原膜剪成适宜的尺寸，用三蒸水浸泡2min，以使胶原膜软透，将胶原膜绕模具缠绕5/4圈，绕好后用液态胶原涂裹一圈，过夜风干(图1中A)。室温(25°C过夜(12小时)交联，交联之后将胶原管从模具上取下来，冻干，辐照后备用(图1中B和C)。
[0078]2、含有双因子的修复外周神经损伤的胶原材料的制备
[0079]将IOOmg用牛筋膜制备的有序胶原材料(L0CS，直径为50 μ m的有序胶原纤维，图1中D)浸泡在0.5mL含400 μ g纯化的CBD-CNTF和400 μ g纯化的CBD-bFGF的I X PBS中，25°C孵育I小时，使其全部被LOCS吸收，得到含有双因子的修复外周神经损伤的胶原材料。
[0080]3、组装
[0081]将步骤2获得的含有双因子的修复外周神经损伤的胶原材料，填充在步骤I获得的胶原管中，填充约占一半空间(因为神经的再生也需要空间)，即获得了含有CBD-CNTF和CBD-bFGF双因子的外周神经损伤功能修复胶原支架。
[0082]二、含单因子的外周神经损伤功能修复胶原支架的制备
[0083]1、胶原管的制备
[0084]同步骤一。
[0085]2、含有单因子的修复外周神经损伤的胶原材料的制备[0086]将100mg用牛筋膜制备的有序胶原材料(L0CS，直径为50 μ m的有序胶原纤维)浸泡在 0.5mL 含 400 μ g 纯化的 CBD-CNTF 或 400 μ g 纯化的 CBD-bFGF 的 I X PBS (I X PBS 的pH为7.4，溶剂为水，溶质及其浓度如下:磷酸二氢钾0.27g/L，磷酸氢二钠1.42g/L，氯化钠8g/L，氯化钾0.2g/L。)中，25°C孵育I小时，使其全部被LOCS吸收，得到含有单因子的修复外周神经损伤的胶原材料。
[0087]3、组装
[0088]将步骤2获得的两种含有单因子的修复外周神经损伤的胶原材料，分别填充在步骤I获得的胶原管中，填充约占一半空间(因为神经的再生也需要空间)，即获得了含有CBD-CNTF或CBD-bFGF单因子的外周神经损伤功能修复胶原支架。
[0089]三、不含因子的外周神经损伤功能修复胶原支架的制备
[0090]1、胶原管的制备
[0091]同步骤一。
[0092]2、组装
[0093]将牛筋膜制备的有序胶原材料(L0CS，直径为50 μ m的有序胶原纤维)填充在步骤I获得的胶原管中，填充约占一半空间(因为神经的再生也需要空间)，即获得了不含因子的外周神经损伤功能修复胶原支架。
[0094]实施例2、应用外周神经损伤功能修复胶原支架治疗小型猪的长距离横断面神经损伤
[0095]一、制备小型猪长距离(3.5cm)的面神经横断损伤模型，将外周神经损伤功能修复胶原支架材料桥接在神经损伤两端
[0096]首先，制备小型猪面神经横断损伤的模型。选择8只13月龄的小型猪(中国农业大学)，体重在40~45公斤左右，肌肉麻醉后，将猪的两侧面神经均游离切断3.5cm，制作小型猪的长距离面神经损伤模型(图2中A)。
[0097]然后，将其中6只小型猪通过缝合的方式将实施例1制备好的四种胶原支架桥接在神经损伤的近端和远端(图2中B)，每种胶原支架各设置三组重复。
[0098]另外的2只小型猪为本实验设置的阳性对照一自体神经移植治疗组(autograft)。自体神经移植治疗是目前在外周神经治疗中首选治疗方法，可有效提高周围神经损伤修复水平[Rivlin M, Sheikh E, Isaac R, Beredjiklian PK.The role of nerveallografts and conduits for nerve injuries.Hand clinics.2010 ；26:435-46, vii1.]。本研究中的自体神经移植组是通过手术方式游离小型猪的单侧面神经，将面神经切断3.5cm反转后行原位神经缝合术。
[0099]二、术后六个月后经形态学大体观察、电生理、免疫组化等多项检测，评价外周神经损伤功能修复胶原支架促进小型猪面神经损伤恢复情况
[0100]1、大体学观察
[0101]结果如图3所示，各组均可见再生神经。双因子结合功能材料组(CNTF+bFGF)神经的粗细和瘢痕情况接近于自体神经移植治疗组(autograft)，其效果优于单因子治疗组，而单因子治疗组的神经修复情况优于单纯材料(LOCS)组。
[0102]2、电生理检查
[0103]术后六个月，对各组的小型猪进行了复合肌肉动作电位(compound muscle actionpotential, CMAP)的测试。实验时所采用的仪器是成都仪器厂生产的RM6240USB2.0Z型肌电诱发电位仪描仪。将小型猪按之前的方法麻醉，切开皮肤重新暴露出面神经，用塑料手套垫在面神经下，使神经与周围的组织隔开以减少干扰。调整好仪器的各种参数，将双刺激电极一端放在面神经上，另一端放在颊肌上。在面神经侧刺激，记录肌肉上的复合肌肉动作电位(compound muscle action potential, CMAP)值。
[0104]结果如图4所示，无论是损伤远端动作电位还是损伤近端动作电位，双因子治疗组(CNTF+bFGF)的复合肌肉动作电位峰值均明显高于(P〈0.05)单因子治疗组，而单因子治疗组的动作复合肌肉动作电位峰值显著高于(P〈0.05)单纯材料(LOCS)组。
[0105]3、免疫组化检测施旺细胞特异性标志物S100蛋白和神经丝蛋白(NF)的表达
[0106]根据现有报道，可知S100蛋白和NF蛋白本身有促进轴突生长的作用，其表达水平可以反映神经再生情况[Walker KL, Yoo HK, Undamatla J, Szaro BG.Loss of neurofilamentsalters axonal growth dynamics.The Journal of neuroscience: the official journal ofthe Society for Neuroscience.2001 ;21:9655-66.Lin ff, Szaro BG.Neurofilaments helpmaintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laeviscultured embryonic spinal cord neurons.The Journal of neuroscience: the officialjournal of the Society for Neuroscience.1995 ； 15:8331-44.Schlosshauer B,MullerE, Schroder B, Planck H, Muller HW.Rat Schwann cells in bioresorbable nerve guides topromote and accelerate axonal regeneration.Brain research.2003 ；963:321-6.MarshakDR.SlOObeta as a neurotrophic factor.Progress in brain research.1990 ；86:169-81.]。
[0107]术后6个月，将小型猪处死，迅速将损伤修复部位的神经取出，于10%福尔马林固定液(购自北京化学试剂公司，配制方法:取10毫升福尔马林溶液加90毫升水，即成10%福尔马林溶液。)中固定48小时。石蜡包埋后做切片，进行神经丝蛋白(NF)和SlOO蛋白的免疫组织化学染色。使用多聚赖氨酸处理过的玻片粘片，将切片在烤片机上于56°C烘烤3小时。进行免疫组织化学染色时需要经历下述步骤:依次为二甲苯I，15分钟；二甲苯II，15分钟；二甲苯/乙醇(体积比1:1)，5分钟；100%乙醇，5分钟；95%乙醇，5分钟；80%乙醇，5分钟；70%乙醇，5分钟；50%乙醇，5分钟；自来水，5分钟；蒸馏水，5分钟。PBS浸泡3次，每次5分钟。将抗原修复液(配制方法:柠檬酸三钠3克，柠檬酸0.4克，加蒸馏水至1L，调pH = 6.0，所有试剂均购自北京化学试剂公司)煮沸，组织片放入煮沸的抗原修复液中并维持10分钟，让组织片缓慢冷却至室温。用PBS洗涤3次，每次3分钟。用免疫组化笔在组织周围画圈，样本周围用吸水纸吸干。滴加3% H2O2去离子水，放入湿盒内37°C下孵育10分钟，以阻断内源过氧化物酶。PBS漂洗3次，每次5分钟。每片组织滴加正常山羊血清(欣博盛公司产品，其产品目录号为ENS004.120)封闭液封闭，放入湿盒内37°C下孵育15分钟。吸去封闭血清,不要洗漆。加小鼠来源的一抗ant1-Neurofilement (Abeam公司产品，其产品目录号为ab8135，稀释体积比1:1000)或ant1-S100 (Sigma公司产品，其产品目录号为S2644)，稀释体积比1:2000)，4 °C孵育过夜后，PBS漂洗3次，每次5分钟。加生物素化二抗(欣博盛公司产品，其产品目录号为ENS004.120)，放入湿盒内37°C孵育15分钟后，PBS漂洗3次，每次5分钟。加三抗(欣博盛公司产品，其产品目录号为ENS004.120)，放入湿盒内37°C孵育15分钟后，每个样品加适量新鲜配置的DAB溶液(欣博盛公司产品，其产品目录号为ENS004.120)，室温反应10分钟，弃掉反应液，自来水终止。50%乙醇中放置5分钟；70%乙醇中放置5分钟；80%乙醇中放置5分钟；95%乙醇中放置5分钟；95%乙醇中放置5分钟；100%乙醇中放置5分钟；100%乙醇中放置5分钟；乙醇/ 二甲苯(体积比1:1)中放置5分钟；二甲苯I中放置10分钟；二甲苯II中放置5分钟；中性树胶封片，显微镜观察，照相。每个组织随机选取3个不同视野,通过Image-Pro Plus软件对SlOO和NF阳性细胞进行定量，定量柱状图通过GraphPad Prism5软件绘制。
[0108]结果如图5和图6所示，由图可见，断段神经两端双因子治疗组(CNTF+bFGF)的SlOO蛋白和NF蛋白表达都显著高于(P〈0.05)单因子治疗组，而单因子治疗组的SlOO蛋白和NF蛋白表达显著高于(P〈0.01)单纯材料(LOCS)组。
[0109]4、透射电镜观察髓鞘直径大小及髓鞘壁厚度
[0110]术后6个月，将小型猪处死，新生面神经被取出用于做透射电镜观察。具体操作如下:(1)将神经置于2.5%戊二醛溶液(体积分数，溶剂为水)中固定2小时；(2)用0.1M磷酸漂洗液(配制方法:NaC180g, Na2HPO4.12H2032.3g，NaH2PO4.2Η204.5g，溶于 IL 水中，pH7.0。所有化学试剂均购自北京化学试剂公司)漂洗三次，每次15分钟；(3)在I %锇酸固定液(配制方法:Ig锇酸溶于100mL水中。锇酸购自sigma公司，产品目录号419494)中固定2小时；(4)用0.1M磷酸漂洗液(配方同上)漂洗三次，每次15分钟；(5)在4°C冰箱内将组织在不同浓度的酒精中进行梯度脱水:放置50%酒精中15-20分钟；在70%酒精中放置15-20分钟；90%酒精中 放置15-20分钟；(6)90%酒精+90%丙酮(体积比1:1)中放置15-20分钟；(7)90%丙酮中放置15-20分钟；(8)在100%丙酮中于室温放置15-20分钟，一共放置三次；(9)组织包埋:纯丙酮+包埋液(体积比2:1)室温25°C放置4小时；(10)纯丙酮+包埋液(体积比1:2)室温25°C过夜；(11)纯包埋液，37°C放置3小时；(12)固化:37°C烘箱内过夜；(13)45°C烘箱12小时，60°C烘箱内24小时；(14)用超薄切片机将组织切成50-60nm的切片，使用1%醋酸铀-柠檬酸盐(I %醋酸双氧铀染液配制方法:称醋酸双氧铀0.2g，加双蒸水到10mL，封口膜封口，4°C避光保存。I %柠檬酸铅染液配制方法:称硝酸铅0.265g，柠檬酸钠(含2分子结晶水)0.352g，加双蒸水到10mL，封口膜封口，4°C避光保存。产品名称:柠檬酸铅，货号:GA10701 ;产品名称:醋酸双氧铀，货号:GS02625。)双染色。其中，包埋液(中镜科仪公司产品，产品名称EMbed812环氧树脂包埋套装货号:GE14120)。完成上述步骤之后使用透射电镜观察和拍照。通过比较各治疗组的髓鞘直径大小和髓鞘壁厚度评价各组的治疗效果。每个组织随机选取3个不同视野,通过Image-Pro Plus软件对髓鞘直径大小和髓鞘壁厚度进行定量，定量柱状图通过GraphPad Prism5软件绘制。
[0111]透射电镜结果如图7所示，可见双因子治疗组(CNTF+bFGF)的髓鞘直径大小和髓鞘壁厚度显著高于(P〈0.05)单因子治疗组，而单因子治疗组的髓鞘直径大小和髓鞘壁厚度高于(P〈0.05)单纯材料(LOCS)组。
[0112]综合分析以上结果，表明:与单因子CBD-CNTF或CBD-bFGF功能胶原支架组相比，本发明实施例1制备的含有CBD-CNTF和CBD-bFGF双因子的有序胶原支架材料，可以更好地促进面神经的再生和功能的恢复，治疗效果显著优于单纯材料组(LOCS)，且一些参数上可以达到阳性对照——自体神经移植治疗组的水平。CBD-CNTF和CBD-bFGF双因子在面神经损伤修复中表现出了协同效应。本研究应用动物长段外周神经缺损模型取得的结果为未来双因子功能性胶原支架应用于临床提供了良好的技术支持。
【权利要求】
1.修复外周神经损伤的胶原材料的制备方法，包括如下步骤:将带有胶原结合区的睫状神经营养因子和带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子与有序胶原材料共同孵育，得到所述修复外周神经损伤的胶原材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述带有胶原结合区的睫状神经营养因子、所述带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子和所述有序胶原材料的配比为:300-500 μ g:300-500 μ g:70_130mgo
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述孵育为25-37°C孵育0.5-1小时。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述孵育时的液体环境为IXPBSo
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述带有胶原结合区的睫状神经营养因子的氨基酸序列为如下(a)或(b);所述带有胶原结合区的碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列为如下(C)或(d): (a)序列表中序列I的第22-243位； (b)序列表中序列I; (c)序列表中序列2的第22-197位； (d)序列表中序列2。
6.利用权利要求1-5中任一所述的方法制备得到的修复外周神经损伤的胶原材料。
7.修复外周神经损伤的胶原支架的制备方法，包括如下步骤: (1)根据待修复外周神经损伤部位的半径，采用胶原膜制备相同半径的胶原管； (2)向步骤(1)制备得到的胶原管中填充权利要求6所述的修复外周神经损伤的胶原材料，即获得了所述修复外周神经损伤的胶原支架。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:步骤(1)为:根据待修复外周神经损伤部位的半径，找到相同半径的模具，将胶原膜用水浸泡I~2min，将浸泡过的胶原膜绕所述模具缠绕5/4圈，绕好后用液态胶原涂裹一圈，风干，10~30°C放置12小时使之交联，去除所述模具，获得所述胶原管。
9.利用权利要求7或8所述方法制备得到的修复外周神经损伤的胶原支架。
10.权利要求6所述的修复外周神经损伤的胶原材料，或权利要求9所述的修复外周神经损伤的胶原支架在如下任一中的应用: (al)制备促进外周神经再生的材料； (a2)制备促进外周神经横断部位电生理恢复的材料； (a3)制备促进外周神经受损部位SlOO蛋白和/或神经丝蛋白表达的材料； (a4)制备促进外周神经受损部位髓鞘直径和髓鞘壁厚度增加的材料。
【文档编号】A61L27/36GK104001212SQ201410234129
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】戴建武, 崔熠, 侯祥林, 肖志峰, 陈冰 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所