一种用于治疗糖尿病神经损伤的植物单体复方制剂的制作方法

本发明涉及一种药物组合物，特别是一种用于治疗糖尿病神经损伤的植物单体复方制剂。

背景技术：

糖尿病发病率日益攀升，已成为一个公共卫生问题，其严重的并发症之一是糖尿病中枢神经病变，即糖尿病脑病，可导致患者认知和行为障碍，严重影响患者的正常生活。目前临床用于降糖的化学药物，主要效应是降低血糖，而对糖尿病重要脏器损伤等并发症往往没有防治作用。糖尿病引起的神经损伤(又称糖尿病脑病)尚无特效、能终止或逆转糖尿病脑功能障碍进展的药物。糖尿病本身导致的脑功能损害和老年性脑损害交织在一起，多种因素导致糖尿病中枢神经病变，因此，研发防治糖尿病及中枢神经病变药物已成为糖尿病药物领域的重大课题。糖尿病神经损伤的主要治疗方法是在控制血糖的基础上，辅以改善脑细胞功能的药物。改善血液流变状态，控制血糖、降低血脂、改善血管壁通透性、营养神经、清除自由基和减轻炎症等，是糖尿病脑病的预防治疗手段。控制血糖是预防糖尿病脑病发生的重要措施，神经系统对血糖异常敏感，糖尿病早期症状即可出现肢体发麻，是患者就诊早期主诉之一，这是高血糖引起神经损伤的表现，因此，降低血糖和神经保护是防治糖尿病神经损伤和脑功能障碍的关键。然而，现有的糖尿病药物重点关注降糖作用，忽略了对神经系统的保护。中药皂苷类、黄酮类、生物碱类、酚酸类等药物均具有神经保护作用，部分同时具有降糖作用。如大豆异黄酮、小檗碱、苦参碱和人参皂苷rg1等均可增加胰岛素的分泌并增加胰岛素敏感度而降低血糖。因此，这些有效成分组成的单体复方制剂在效应上可发挥多靶点神经保护机制，对应糖尿病神经损伤多因素、多环节、多途径等特点，而干预其中某一环节或途径单一的治疗经临床证实疗效甚微。中医学整体观念的特点及中药学复方特征，使得中药在治疗神经损伤性疾病上具有多靶点的优势，可从多方面干预神经细胞损伤病理过程，具有很强的可行性。单体复方制剂又可避免中药大复方成分复杂不清的缺点，因此单体复方成分清楚、含量配伍清晰、靶点明确，从而减少毒副作用的发生。异黄酮类植物雌激素(如大豆异黄酮、芒柄花素)、生物碱(如苦参碱、川穹嗪和小檗碱)和皂苷(如人参皂苷rg1、桃叶珊瑚苷)均具有一定的降糖与神经保护作用，因此，本发明筛选了三类药物的有效成分，采用最佳剂量配伍，阐明三者协同作用的药效物质基础与配伍比例，其中大豆异黄酮+苦参碱+桃叶珊瑚苷三个单体组合，具有最佳的降糖及神经保护作用。本发明发掘一种安全有效且成分明确的新型单体复方糖尿病神经保护药物。

国内外研究现状：糖尿病是一种以血糖升高为特征的代谢紊乱综合征，发病率逐年攀升。其重要并发症糖尿病神经损伤(糖尿病脑病)是引起致残的主要元凶。糖尿病神经损伤的主要治疗方法是在控制血糖的基础上，辅以改善脑细胞功能的药物。改善血液流变状态，控制血糖、降低血脂、改善血管壁通透性、营养神经、清除自由基及管理血压，是糖尿病脑病的预防治疗手段。控制血糖是目前预防糖尿病脑病发生的唯一方法，尚未有药物能有效治疗已经出现的糖尿病脑功能障碍。目前临床具有神经保护和改善脑功能的药物，确定较为疗效的化学药物包括乙酰胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐、二氢麦角碱、吡拉西坦、石杉碱甲、回拉西坦等改善学习记忆的药物，以及依那普利、尼莫地平等改善脑血管药物，但均无降糖作用。部分蛋白或多肽类等药物，受血脑屏障的限制，目前仅处于动物实验研究阶段，尚未用于临床。

糖尿病脑病导致认知能力损伤是神经系统并发症的最重要表现，但发病机制复杂，尚未阐明确切的病理机制。研究表明，成年个体(包括人在内的灵长类和啮齿类)脑内存在神经发生，即神经干细胞增殖、迁移和分化，继而在海马区形成各种成熟细胞。新生的神经元执行中枢神经系统的高级功能，糖尿病脑病患者则表现为神经发生的消失。神经系统能量代谢依赖于葡萄糖代谢，因此糖尿病早期症状常以神经末梢代谢异常出现，患者以肢体发麻来就诊，这是高血糖引起神经损伤的初期表现。因此，降低血糖和神经保护是防治糖尿病脑功能障碍的关键。然而，现有的糖尿病药物重点关注降糖作用，其中，氧化损伤是糖尿病神经损伤的重要原因之一。另外，大脑血管的改变、神经营养因子缺乏、钙离子稳态改变、中枢突触可塑性改变以及非酶性糖基化等均是糖尿病脑病可能发病的原因。中医学整体观念的特点及中药学复方特征，使得中药在治疗神经损伤性疾病上具有多靶点的优势，可从多方面干预神经细胞损伤病理过程，具有很强的可行性。

用于防治糖尿病的植物主要有效成分较多，本发明从异黄酮类、生物碱类、皂苷类植物成分入手，利用多靶点协同作用，实现中医多靶点网络治疗的新策略。

1.异黄酮类

研究表明植物异黄酮类成分能够治疗糖尿病及其并发症，主要影响β细胞功能，作用比较缓慢而持久。中医早有葛根、苦骨等中药能治疗糖尿病的记载，它们的主要有效成分为异黄酮类化合物。异黄酮类化合物属植物雌激素，广泛存在于豆科植物中，为开发防治糖尿病的新天然健康食品和药物的安全性提供了可靠保证。大豆异黄酮具有雌激素和抗雌激素样作用。在内源性雌激素水平较低时，能与雌激素受体相结合而表现出雌激素样作用；当体内雌激素水平较高时，则竞争性结合雌激素受体，显示出抗雌激素活性。大豆异黄酮可以明显地降低大鼠的高血糖，其所含的成分染料木素为主要的降血糖成分之一。大豆异黄酮具有多种生物学活性，如降血糖、抗骨质疏松、雌激素作用、改善糖耐量等作用。研究表明，大豆异黄酮的降糖作用可能与抑制β细胞凋亡、干扰小肠对糖的吸收使餐后血糖峰值后移与降低、胰岛素样作用促进外周组织利用血糖有关；此外，还有研究发现大豆异黄酮及苷元通过抑制α‐葡萄糖苷酶而发挥降糖作用。芒柄花素是一种简单的异黄酮类化合物，为针状结晶，广泛分布于豆科植物如黄芪、甘草、红花翘摇等中，有抗菌和类似雌性激素的作用，可能是由于它的结构与己烯雌酚相似的缘故。

异黄酮类植物雌激素在中枢神经系统中具有广泛的作用，如拮抗β‐淀粉样蛋白(beta‐amyloid，aβ)的毒性、增强胆碱能神经细胞的功能、减少aβ的产生、抗氧化应激、增加脑缺血时局部脑血流量，减轻脑缺血时的损伤等。植物雌激素同雌激素一样，在中枢神经系统中有重要的作用。两者都能延缓神经细胞的凋亡，起到神经保护作用。如植物雌激素能增加去卵巢大鼠基底前脑胆碱能神经元的表达；能增加海马神经元中no合酶的表达，改善去卵巢大鼠的学习记忆能力，提示对中枢神经系统退行性病变具有保护作用。植物雌激素大豆异黄酮配伍叶酸后可以在一定程度上抑制神经胶质细胞损伤和增强细胞的活力。中药处理组缺血侧脑皮质雌激素受体表达高于对照组，说明含植物雌激素的中药有明显的脑保护作用，并可能是通过激活erβ发挥作用。此外，植物雌激素可有效预防早老性痴呆、防治帕金森病。

2.生物碱类

苦参碱、川穹嗪和小檗碱有显著的降糖作用。黄连用于治疗消渴症已有数千年的历史，黄连的主要活性成分为小檗碱，此外尚含丰富的黄连碱、巴马汀和小檗碱等其他生物碱。黄连生物碱具有相同的母核结构，可能表现出相似的药理性质。以hepg2细胞、自发型糖尿病大鼠kk‐ay为模型，发现黄连中生物碱(小檗碱)促进细胞吸收葡萄糖、清除自由基、降低血糖，改善糖尿病“三多一少”临床症状、改善胰岛素抵抗及调节脂代谢紊乱等作用。苦参碱对大鼠脑缺血‐再灌注损伤具有神经细胞保护作用。

3.皂苷类

如人参皂苷rg1对7周大stz诱导糖尿病大鼠齿状回细胞增殖有作用。给糖尿病大鼠不同剂量的提取物(10，50，100和200mg/kg)，不同的持续时间(5和10天)，并建立正常对照。人参根在正常条件下对细胞增殖并没有显著效果，但是在糖尿病状态下对新细胞形成具有显著效果。然而，人参根仅在剂量为50mg/kg时观察到对细胞增殖有效果。此外，5天和10天的治疗对于细胞增殖的数量没有显著性差异。他们把所观察到的神经保护作用归因于提取物的主要药理成分皂苷。以前的研究报告指出，一些皂苷增加乙酰胆碱的释放，同时提高大鼠海马胆碱摄取位点的数量以及前脑基底胆碱乙酰转移酶的表达。人参皂苷有可能是通过上调胆碱能系统发挥其增强记忆的效果。此外，人参根抑制nos在糖尿病大鼠海马的过度表达，提出人参根能辅助治疗糖尿病中枢神经系统并发症。

桃叶珊瑚苷是普遍存在于植物中的环烯醚萜苷，通过调节bcl-2和bax基因的表达，桃叶珊瑚苷(5mg/kg，i.p.)可以改善糖尿病大鼠锥体细胞超微结构的不利变化以及神经凋亡细胞和生存细胞的比例。此外，报道称桃叶珊瑚苷(0，1，5或10mg/kg)可能是通过促进内源性抗氧化酶活性表现出一定的神经保护特性[6]。桃叶珊瑚苷也有效降低血糖浓度和增加体重、改善糖尿病大鼠的学习记忆能力。

基于国内外研究现状和申请人前期研究，分别从三类物质中筛选大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷组成单体复方，并采用离体与整体动物结合，确定三位单体复方的比例，开发了具有降糖与神经保护双重功效植物单体复方制剂，该复方具有疗效好、毒副作用低等优点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于治疗糖尿病神经损伤的植物单体复方制剂，本发明基于大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷三个单体组合物的降糖效应以及神经保护作用，确立具有防止糖尿病神经系统损伤的单体复方组成及配伍比例。

本发明的目的是这样实现的：一种用于治疗糖尿病神经损伤的植物单体复方制剂，其特征在于：其药物活性成分由大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷混合而成；

所述的大豆异黄酮结构式为：

所述的苦参碱的结构式为：

所述的桃叶珊瑚苷的结构式为：

本发明的目的还可以这样实现：药物活性成分大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷的质量比为6:1:1。

药物活性成分大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷按照人体重量推算用药量配比范围为：大豆异黄酮6‐30mg/kg，苦参碱5‐25mg/kg、桃叶珊瑚苷5‐25mg/kg。

所述的制剂为口服制剂或注射剂。

所述的口服制剂为片剂或胶囊。

所述的注射剂为静脉滴注制剂。

本发明的目的还在于提供一种用于治疗糖尿病神经损伤的植物单体复方制剂的制备方法，其特征在于：药物活性成分大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷由市场购买或原料药材提取获得，然后按照质量比为6:1:1的比例混合，依常规加辅料制备成片剂或胶囊或注射剂；用法用量：片剂、胶囊，规格为440mg/片(粒)，成人每次1片(粒)，每日3次；注射剂：静脉滴注，每日总量控制在1200mg-2000mg之间。

本发明用于治疗糖尿病神经损伤的植物单体复方制剂可在制备缺血性脑病、脑出血后康复、脑血栓后康复和缓解心肌缺血、脑缺血药物中应用。

本发明公开了大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷三个单体组合物和配伍方法在制备治疗糖尿病及糖尿病神经损伤药物中的用途，本发明中大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷组合物按比例配伍能显著降糖及发挥神经保护作用。运用原代培养神经元高糖模型、链脲佐菌素诱导ii型糖尿病大鼠模型和morris水迷宫和糖耐量等实验，发现大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷三个单体组合物可显著降低高糖引起的培养神经元损伤，降低链脲佐菌素糖尿病模型大鼠血糖、改善糖耐量和学习记忆能力；降低脑组织氧化损伤和神经元凋亡。表明大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷三个单体组合物，可发挥中药单体组方的多效性与协同性，即符合中医理论，又体现了中药多部位、多靶点的作用机制，效果明显、安全。本发明具有治疗糖尿病神经损伤疗效高、用量小、应用方便等特点。本发明发掘一种安全有效且成分明确的新型单体复方糖尿病神经保护药物。

附图说明

图1.三类单体物质对高糖引起神经元损伤作用的影响

(a)pi(红色，代表凋亡与死亡细胞核)与hoechst(蓝色，代表所有细胞核)双染显示神经元凋亡数量。标尺＝100μm。(b)三类单体物质对高糖引起神经元凋亡的抑制作用。大豆异黄酮(soybeanisoflavone,soybean)，芒柄花素(formononetin,form)，苦参碱(matrine)，川穹嗪(ligustrazine,ligust)，小檗碱(berberine)，人参皂苷rb1(ginsenosiderg1,ginsenrg1)，桃叶珊瑚苷(aucubin)。n＝6培养皿/组，平均值±标准误，**p<0.01与control比较；#p<0.05,##p<0.01与高糖模型比较。

图2.三类单体物质复方对糖耐量的影响

三类单体以及复方对糖耐量的影响，rgz作为阳性对照药物。大豆异黄酮(soybeanisoflavone,soybean)，苦参碱(matrine)，桃叶珊瑚苷(aucubin)。n＝8平均值±标准误，*p<0.01与control组比较；#p<0.05与t2dm模型组比较。

图3.单体配伍对学习记忆以及运动功能的影响

(a)大鼠在morris水迷宫训练寻找平台潜伏期。(b)各组大鼠在平台象限停留时间。(c)各组动物在滚棒上停留时间(总时间为3min)。n＝8，平均值±标准误，**p<0.05，与control比较；#p<0.05，##p<0.01与t2dm模型组比较。

图4.单体及配伍对前额叶皮层突触可塑性的影响

(a)前额叶皮层med64阵列记录脑区示意图。(b)med64阵列脑片记录图。(c-e)各单体与单体组合对突触可塑性的影响。(f)统计学结果。n＝8脑片/8小鼠，平均值±标准误，**p<0.05，与control比较；#p<0.05与t2dm模型组比较。

图5.单体及配伍对前额叶皮层神经营养因子表达的影响

(a)单体及配伍对nt-3水平的影响。(b)单体及配伍对cntf水平的影响。(c)单体及配伍对bdnf水平的影响。(d)单体及配伍对gdnf水平的影响。(e)单体及配伍对ngf水平的影响。n＝8，平均值±标准误，**p<0.05，与control比较；#p<0.05，##p<0.05与t2dm模型组比较。

具体实施方式

(一)实验方法与材料

1.动物：成年大鼠

孕14～15天c57bl/6大鼠，清洁级，健康成年雄性c57bl/6大鼠，均由第四军医大学实验动物中心提供。在第四军医大学药理学教研室动物房饲养，温度23±2℃，湿度50％±10％，12h昼夜周期，动物自由进食、饮水。实验前大鼠需适应环境一周，所有行为学实验安排在白天进行(上午9:00-12:00和下午14:00-18:00)。与动物相关的所有实验均由第四军医大学伦理委员会审核通过。

2.原代神经元培养

大鼠大脑皮层神经元的培养，孕13～15天c57bl/6大鼠脱颈椎处死，无菌条件下取出胚胎，放入装有预冷d-hank’s平衡盐液的平皿中，在显微镜下剥离硬脑膜并取出大脑，剔除血管膜，分离并取出大脑皮层，加入终浓度为0.25％胰蛋白酶消化液消化10分钟，随后用弯头滴管吸出皮层组织，转移到装有预冷的dmem培养液的离心管内，漂洗三次，终止消化，最后轻轻吹打细胞数次制备单细胞混悬液，200目筛网过滤并计数。调整细胞密度分别按1×10⁶/孔种入6孔板内，5×10⁴/孔种入96孔板内，2×10⁵/孔种入预先铺有玻片24孔板内，所有的培养板预先包被有终浓度为50μg/ml的多聚-d-赖氨酸(pll)。孵箱中培养24h后全量换为neurobasal培养液(neurobasal+2％b27+1％双抗)。以后每隔两天半量换液一次，换液前应将培养液在37℃环境中充分复温，减少冷刺激。培养到7-10天细胞用于实验。无菌条件下，移去培养基，用无mg²⁺的细胞外液洗两遍，先用药物处理神经培养成熟的神经元给予(30mm)高糖刺激24h，再给予药物处理。

3.pi与hoechst双染实验

原代培养皮层神经元生长7-10天时，细胞随机分为对照组，高糖组，药物各处理组加入药物1h后，加入葡萄糖(50mm)。37℃继续培养细胞，24h后进行propidiumiodide(pi,sigma)和hoechst33258(sigma)双染。pi(1μg/ml)与hoechst33258(10μg/ml)孵育15分钟，然后用4％多聚甲醛固定10分钟。然后于荧光显微镜(olympusbx61,japan)下观察计数。hoechst与pi燃料激发波长分别为340nm与620nm，每皿选择三个视野进行计数。

4.链脲佐菌(stz)诱导ii型糖尿病大鼠模型

sd(spraque-dawley)雄性大鼠，10周龄左右，体重252±23g，适应喂养1周后，随机分为：正常对照组和糖尿病待造模组。适应性喂养1周后，模型组大鼠喂以高糖、高脂饲料(其中含10.0％猪油、20.0％蔗糖、2.5％胆固醇、1.0％胆酸盐、66.5％常规饲料)4周，诱导发生胰岛素抵抗。第5周，各实验组大鼠禁食不禁水12h后，(stz)腹腔注射30mg/kg，正常对照组腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。注射1周后，各组大鼠禁食不禁水12h后断尾取血，测空腹血糖(fastingbloodglucose，fbg)。空腹血糖(fbg)＞15mmol/l视为造模成功。治疗组每日给予单体复方制剂灌胃给药4周(每日2次，于am9:00和pm5:00各灌胃1次)，阳性对照选择罗格列酮(3mg/kg，rgz)灌胃1次/天，阴性对照组和模型组给予等体积的生理盐水每日2次，连续4周，实验组同时给予高糖高脂饲料喂养。考察单体及单体复方的降糖作用。

5.血糖测定与糖耐量实验

空腹血糖采用自动血糖仪和稳豪型血糖试纸检测，以mmol/l表示。糖耐量实验：模型干预组给予个单体与复方治疗4周，模型对照组给予与体质量相应体积的蒸馏水，阳性对照药物为罗格列酮(3mg/kgrgz)。糖耐量实验当天，各组动物禁食3-5小时，测定给葡萄糖前(即0时)血糖值，15-20分钟后各组经口给予葡萄糖2.0g/kg体重，测定给葡萄糖后各组0.5，2.0小时的血糖值。

6.morris水迷宫

神经功能评分后，部分动物(每组10只)继续给药7天，然后停止给药，恢复3周，于术后1个月采用morris水迷宫法评估动物的空间和学习记忆能力。本实验所用水迷宫是一个圆形电镀的水缸，池内水深45cm，池壁涂成黑色。整个实验过程房内光线、温度、池内温度都保持恒定不变。将水池划分为四个象限，假设目标象限为第一象限，在目标象限距离池壁35cm处放置一个白色的站台，直径为8cm，距离水面下约为2cm。在实验过程中，站台的位置不变。不同颜色及形状的标记物贴在池壁内。摄像机安装在迷宫的上方。大鼠的运动轨迹可以被实时同步记录。实验中的视屏分析和处理采用的是上海吉量软件科技有限公司研制开发的系统。该系统可以提供动物的上台潜伏期、穿台次数、游泳路程、游泳速度和靶象限活动时间百分比等多个指标。具体实验步骤如下，大体分为两步：

(1)空间学习训练：实验前，先将大鼠放置在站台上，让其适应20s。然后选择一个除目标象限之外的象限，沿池壁将大鼠慢慢放入池水中，每一次入水点的位置与平台的距离要基本一致。大鼠登台5s即算登台成功，停止记录。每次记录时间设为60s。如果1min后，大鼠还没有登上站台，同样停止记录，然后引导其登台并让其停留20s。实验后，要将动物擦拭干净后放入鼠笼。重复上述步骤，每只大鼠每次实验的间隔至少30min，以保证大鼠有充足的时间恢复体力，减少游泳带来的应激。通过软件记录下大鼠游泳总路程、速度、上台潜伏期等指标，用来评价其空间学习能力。同样实验，连续重复测试5天。

(2)空间记忆实验：间隔两天，在第8天和第9天，撤去站台，任意象限将大鼠沿池壁慢慢放入池水中，记录90s大鼠的游泳轨迹，同样将大鼠擦干放回笼中。通过记录轨迹曲线，来测量大鼠在目标象限的活动时间百分比和穿台次数，来评估大鼠的空间记忆能力。

7.rotarod滚轮实验

morris水迷宫法评估动物的空间和学习记忆能力神经功能评分后，采用rotarod滚轮装置，分别于脑缺血后第40天进行转棒实验训练。大鼠按8转/min转速训练3次，每次5min，两次训练之间间隔20min作为疲劳恢复时间。术后第43天，所有大鼠均按转速16转/min进行测试，记录大鼠在转棒仪上连续行走的时间。

8.单体复方对大脑突触可塑性的调节

选择与学习记忆相关的关键脑区前扣带回(acc)作为可塑性观察的区域。

(1).acc脑片的制备:将stz模型大鼠用乙醚麻醉后，断头取脑，迅速置于预先用95％o2和5％co2混合气冰浴饱和0.5h的人工脑脊液(acsf)中。用刀片修整大脑尾端至平齐，粘于振动切片机的标本托上，在饱和过的acsf中横向切取300μm厚的acc脑片。最后再置于室温acsf中95％o2和5％co2混合气饱和孵育1h。

(2)平面微电极矩阵记录

将孵育后的脑片置于包含64个记录电极的med64探针(8×8微阵列)上，acsf以2ml/min的速度灌流。待平衡1h后，对其中一个位于acc第v层的通道给予电刺激，记录其余63个通道的场兴奋性突触后电位(fieldexcitatorypostsynapticpotentials,fepsps)。用0.017hz刺激30min后，基线开始稳定。保持刺激强度不变，采用tbs(thetaburststimulation)模式诱导ltp：总共由5个脉冲串(bursts)组成，每个脉冲串包含4个100hz的脉冲(pulses)，脉冲串之间间隔200ms。最后用记录2h后的fepsp斜率来衡量增强的幅度。每张脑片需选取6‐8个通道用med64mobius软件进行分析。考察最佳单体配伍复方对突触可塑性的影响。

9.对神经营养因子的影响

elisa检测皮层神经营养因子家族神经营养因子‐3(neurotrophin‐3，nt‐3)、睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor，cntf)、脑衍生神经营养因子(brain‐derivedneurotrophicfactor，bdnf)、胶质源性神经营养因子(glialcell‐derivedneurotrophicfactor，gdnf)和神经生长因子(nervegrowthfactor，ngf)浓度变化。stz大鼠及治疗组，收集皮层组织匀浆液，置于‐20℃保存，避免反复冻融；用1ml蒸馏水将标准品配成20ng/ml的溶液，之后倍比稀释设8个标准管，浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.2和0pg/ml；酶标板每孔各加入标准品或待测样品100μl(组织匀浆液需用标本稀释液适当稀释)，充分混匀后置于37℃反应2h；用洗涤液将酶标板充分洗涤4‐6次，在滤纸上印干；每孔中加入第一抗体工作液100μl，充分混匀后置于37℃反应1h；洗板同前；每孔加酶标抗体工作液100μl，充分混匀后置于37℃反应0.5h；洗板同前；每孔加入底物工作液100μl，置于37℃暗处反应15min；每孔加入100μl终止液混匀，用酶标仪在450nm处测吸光值；绘制标准曲线计算出样品中nt‐3、cntf、bdnf、gdnf和ngf浓度。观察最佳药物单体及单体组合对神经营养因子的调节作用。

10.氧化损伤指标测定

具体实验步骤请参照试剂盒说明书。前额叶脑组织组织匀浆，12000rpm离心20min，上清液按照试剂盒，通过分光光度仪用化学比色法测定丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽(gsh)水平。

11.整体动物毒性

对最佳配伍复方进行急性毒性研究，取禁食12h后大鼠，按体重随机分为几个剂量给药组和水对照组，每组6只。药物组按25ml/kg大鼠体重灌胃给药1次，对照组灌胃等体积的生理盐水，进行ld50值的测定，如测不到毒性，则按最大耐受量给药。

(二)结果

1.三类同时具有降糖与神经保护有效配伍的确定

利用神经元高糖培养模型，筛选异黄酮类单体大豆异黄酮、芒柄花素；生物碱类单体苦参碱、川穹嗪和小檗碱；皂苷类单体人参皂苷rg1、桃叶珊瑚苷。评价单体保护作用与最佳剂量。

(1)三类具有神经保护作用单体成分确定

利用高糖神经元培养模型，pi与hoechst双染技术评价神经元凋亡率。首先评价代表性异黄酮类化合物大豆异黄酮和芒柄花素的神经保护作用。培养基中高糖(葡萄糖浓度30mm)处理后神经元凋亡率显著增加至26.5％，而正常培养基对照组神经元凋亡率为5.2％。经药物处理后神经元凋亡率显著降低，具体为：三个浓度大豆异黄酮(1,5,25μm)使神经元凋亡率降至20.5％，18.1％和10.5％；三个浓度芒柄花素(1,5,25μm)使神经元凋亡率降至22.5％，19.4％和16.8％。可见异黄酮类化合物大豆异黄酮和芒柄花素单体成分对抗高糖引起的神经损伤以25μm大豆异黄酮作用更强。

大豆异黄酮：黄色或浅黄色粉末，溶于乙醇和dmso；结构式如下：

(2)生物碱类单体成分确定

生物碱类单体苦参碱、川穹嗪和小檗碱评价结果如下所述。三个浓度苦参碱(1,5,25μm)使神经元凋亡率降至19.8％，15.2％和12.4％；三个浓度川穹嗪(1,5,25μm)使神经元凋亡率降至20.5％，18.3％和16.3％；三个浓度小檗碱(1,5,25μm)使神经元凋亡率降至22.3％，18.1％和16.4％。可见生物碱类单体苦参碱、川穹嗪和小檗碱单体成分对抗高糖引起的神经损伤在同等浓度时以苦参碱作用更强。

苦参碱：白色粉末，溶于水，苯，氯仿，乙醚和二氧化碳，难溶于石油醚。结构式如下：

(3)皂苷类单体成分确定

皂苷类人参皂苷rb1和桃叶珊瑚苷评价结果如下所述。三个浓度人参皂苷rb1(1,5,25μm)使神经元凋亡率降至23.1％，20.2％和17.6％；三个浓度桃叶珊瑚苷(1,5,25μm)使神经元凋亡率降至18.2％，12.4％和11.2％。可见皂苷类人参皂苷rb1和桃叶珊瑚苷单体成分对抗高糖引起的神经损伤在同等浓度时以桃叶珊瑚苷作用更强。

桃叶珊瑚苷：白色针状结晶(乙醇)。溶于水、乙醇及甲醇,几乎不溶于氯仿、乙醚及石油醚。结构式如下：

(4)三类单体物质配伍协同作用考察

上述研究发现，三类物质共7中单体均设定3个浓度，发现异黄酮类大豆异黄酮、生物碱类苦参碱、皂苷类桃叶珊瑚苷神经保护作用更为显著。本实验进一步利用析因设计，考察大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷三个单体组合的神经保护作用。分别选择大豆异黄酮(25μm)、苦参碱(5μm)和桃叶珊瑚苷(5μm)进行研究。发现大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷组合后可明显发挥协同作用，使神经元凋亡率显著将至6.4％，明显优于各单体成分。

2.单体复方组合的动物药效学考察

三类物质中分别选取神经保护作用最好大豆异黄酮(分子量222.24)，苦参碱(分子量248.37)和桃叶珊瑚苷(分子量346.33)组成单体复方，考察组方的整体动物作用。依据分子量与细胞学实验中最佳有效浓度组合，确定三类单体给药剂量为大豆异黄酮：30mg/kg，苦参碱：5mg/kg和桃叶珊瑚苷：5mg/kg，三个单体及组合物均为灌胃口服给药，每日上下午am9:00和pm5:00各灌胃1次。阳性对照选择罗格列酮(3mg/kg，rgz)，灌胃给药每日1次，阴性对照给予等体积生理盐水，每日灌胃每日上下午各1次。

(1)对stz诱导ii型糖尿病大鼠体重的影响

首先制作ii型糖尿病(t2dm)模型大鼠。stz腹腔注射1周后，各组大鼠禁食不禁水12h后断尾取血，测空腹血糖(fastingbloodglucose，fbg)>15mmol/l视为造模成功。连续给药治疗4周后，模型对照组大鼠体质量减轻，状态萎靡，活动减少；而干预组大鼠体质量有不同程度增加，其中单体组合治疗3‐4周后体重显著增加，阳性对照rgz组体重也显著增加(表1)。

表1.各组大鼠体重变化情况(均数±sem)

n＝8,**p<0.01与control组比较；^#p<0.05,^##p<0.01与t2dm模型组比较。

(2)对stz诱导ii型糖尿病大鼠血糖及糖耐量的影响

连续给药治疗4周后，模型对照组大鼠血糖无明显变化，单体及单体组合治疗组大鼠血糖均显著降低，单体组合治疗组降糖作用与阳性对照rgz组作用相当(表2)。

表2.各时间点sd大鼠空腹血糖(fbg)的变化情况(均数±sem)

n＝8,**p<0.01与control组比较；^#p<0.05,^##p<0.01与t2dm模型组比较。

在4周治疗结束时大鼠口服糖耐量实验(ogtt)。模型组大鼠的ogtt中各时间点的血糖值均显著高于正常组，表明大鼠糖耐量异常。单体及单体组合治疗组大鼠血糖各时间点均显著降低，单体组合治疗组各点降糖作用与阳性对照rgz组作用相当(图2)。

(3)单体复方组合改善糖尿病模型大鼠学习记忆与运动功能的影响

连续给药治疗4周后，t2dm模型大鼠采用morris水迷宫法评估动物的空间和学习记忆能力。实验结果表明，t2dm模型大鼠现空间学习与记忆能力明显降低，大豆异黄酮(30mg/kg)，苦参碱(5mg/kg)和桃叶珊瑚苷(5mg/kg)，以及三个单体组合均不同程度减轻t2dm大鼠学习与记忆损伤(图3a,3b)，并恢复其运动协调能力(图3c)，其中以三者配伍疗效最佳，阳性对照选择罗格列酮对学习记忆与运动能力的无显著改善作用。

1.药理作用机制研究

为阐明大豆异黄酮，苦参碱和桃叶珊瑚苷单体复方组合减轻糖尿病模型大鼠神经系统损伤的机制，我们对参与学习记忆功能的前额叶脑区突触传递功能、神经营养因子和氧化损伤指标进行研究。

(1)单体组合药物恢复t2dm模型大鼠皮层突触可塑性

突触可塑性是学习记忆的重要分子机制，利用平面med64阵列记录技术，对前额叶脑区(前扣带回，acc)突触可塑性进行了考察。连续药物干预4周后取脑，进行电生理记录。发现acc脑区突触可塑性在t2dm大鼠显著降低，大豆异黄酮，苦参碱和桃叶珊瑚苷各单体和阳性对照药物rgz治疗组大鼠可部分恢复突触可塑性的诱导，但无统计学差异。大豆异黄酮，苦参碱和桃叶珊瑚苷单体组合治疗组，acc脑区突触可塑性与t2dm组大鼠相比显著增加(图4)。

(2)单体组合药物对皮层神经营养因子表达的影响

神经营养因子是神经系统发育和维持正常生理功能的重要因素。采用elisa检测前额叶皮层神经营养因子nt-3、cntf、bdnf、gdnf和ngf的表达。发现t2dm模型大鼠前额叶皮层bdnf、gdnf和ngf的表达显著降低，nt-3和cntf表达无显著变化。大豆异黄酮(30mg/kg)，苦参碱(5mg/kg)和桃叶珊瑚苷(5mg/kg)，以及三个单体组合均不同程度升高t2dm模型大鼠前额叶皮层bdnf、gdnf和ngf的表达，其中以三个单体配伍疗效果最为显著，阳性对照选择罗格列酮对神经营养因子表达水平的无显著作用(图5)。

(3)单体组合药物减轻t2dm模型大鼠脑组织氧化损伤

t2dm模型大鼠脑组织氧化损伤较为显著，大豆异黄酮(30mg/kg)，苦参碱(5mg/kg)和桃叶珊瑚苷(5mg/kg)，以及三个单体组合均不同程度减轻t2dm大鼠脑组织中氧化损伤产物丙二醛(mda)含量，增加超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽(gsh)水平。其中以三者配伍作用最强大，阳性对照药物rgz作用不显著(表3)。

表3.单体及其组合对t2dm大鼠脑组织抗氧化指标的影响

n＝8，平均值±标准误，**p<0.01与control组比较；^#p<0.05，^##p<0.01

与t2dm组比较。

(三)配伍制剂与给药方法

1.配伍比例与推荐剂量

根据大鼠实验结果，三类单体给药剂量为大豆异黄酮：30mg/kg，苦参碱：5mg/kg和桃叶珊瑚苷：5mg/kg，单体组合共计为40mg/kg，以及大鼠/人(70公斤)体表面积换算，推荐组方临床单次人用量为440mg/70kg(按照6:1:1mg/kg比例计算，其中大豆异黄酮：330mg/70kg，苦参碱：55mg/70kg和桃叶珊瑚苷：55mg/70kg)。

2.制剂类型

(1)口服制剂：可为片剂、胶囊，规格为440mg/片，建议每次1片，每日3次。

(2)注射剂：静脉滴注，每日总量控制在1200mg-2000mg之间。

(四)组合物安全性考察

整体动物毒性：对最佳配伍复方进行急性毒性研究，取禁食12h后大鼠，按体重随机分为几个剂量给药组和水对照组，每组8只。药物组按25ml/kg大鼠体重灌胃给药1次，对照组灌胃等体积的生理盐水。采用bliss法大鼠灌胃检测急性毒性未测得ld50，最大负荷剂量2000mg/kg(为大鼠有效剂量40mg/kg的50倍)，未见任何毒副作用。

(五)结论

本发明利用细胞学和整体动物研究，发现大豆异黄酮、苦参碱和桃叶珊瑚苷配伍组合，具有显著的协同作用，并最大程度抑制ii型糖尿病大鼠神经功能损伤，未见明显毒副作用。与阳性对照药物罗格列酮相比，不仅具有降糖作用，还明显改善神经系统损伤，促进神经系统功能的恢复，具有显著的优势。其作用机制与降低血糖、增加糖耐量，促进脑内神经营养因子表达、抑制神经系统氧化损伤、恢复突触可塑性有关。