用于检测萨宾口服脊髓灰质炎病毒疫苗病毒的基因组中的核苷酸置换的试验的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于特异性地并且同时检测所有三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗（萨宾）病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中的突变的多重SNP试验方法和引物。重要地，本发明的引物和试验消除了对昂贵、费时和复杂程序，如完整的基因组测序的需求。这种新的试验能够在非常短的时间内测试几种样品。因此，该试验是非常简单、快速且有成本效益的。还提供了包含该新引物的试剂盒。
【专利说明】用于检测萨宾口服脊髓灰质炎病毒疫苗病毒的基因组中的
核苷酸置换的试验
发明领域:
[0001]本发明广义地属于生物【技术领域】，并且具体涉及用于检测活减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗(萨宾)病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变的新引物，以及含有上述引物的试剂盒。
[0002]发明背景:
[0003]Albert B Sabin博士研发了用于免疫对抗瘫痪型脊髓灰质炎的活减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗。他通过细致的实验室工作，从产生所有三种血清型的野生型脊髓灰质炎病毒的疾病中非常小心地分离出突变的病毒株。将这些减毒(非神经毒性)脊髓灰质炎病毒株用于产生活减毒口服脊髓灰质炎疫苗，该疫苗在全世界已经使用了 50多年。萨宾还研发了用于在猴子中评价脊髓灰质炎病毒的神经毒性(NVT)的测试。NVT已经成为用于证明口服脊髓灰质炎病毒疫苗减毒的标准质量控制测试。最近已经研发了转基因小鼠中的神经毒性测试，作为猴子NVT的替代方案。
[0004]NVT可检验脊髓灰质炎病毒的生物学性状(减毒与毒性)。尽管NVT可以将毒性的严重程度分级，但其不能确定病毒的基因组性状。
[0005]在20世纪80年代，描述了区分野生和萨宾OPV株的抗原和分子标记。将全基因组测序、克隆和重组DNA技术用于了解萨宾减毒的及其亲本野生的脊髓灰质炎病毒之间的基因组差异。这些研究导致与萨宾疫苗脊髓灰质炎病毒的减毒性状相关的特定突变的检测。
[0006]以下表1中给出了最有可能的减毒位点:
[0007]研发了分子测试，即，通过PCR和限制酶切割(MAPREC)的突变分析，以定量萨宾疫苗株中单个位点(5’未翻译区内的主要减毒位点)上的突变及其与NVT结果的关联。WHO已经推荐该测试用于测试脊髓灰质炎病毒疫苗的质量。最近，已经研发了通过实时PCR的突变检测。也已经研发了能够检测整个脊髓灰质炎病毒基因组中的突变的微矩阵芯片。
[0008]美国专利5585477和5691134涉及用于检测临床样品中的脊髓灰质炎病毒的特异性引物，并且由此将其与非脊髓灰质炎肠病毒(NPEV)区分开来，但没有描述基于其遗传性状(即，特异性地基于减毒位点)来区分脊髓灰质炎病毒的特异性试验方法。
[0009]完整的基因组测序和全基因组微矩阵能够确定所有已知脊髓灰质炎减毒位点的精确核苷酸(A、T、G或C)，但仍然不存在快速且方便的试验来作为上述在单个试验中同时检测脊髓灰质炎病毒I (六个位点)、2 (三个位点)和3 (2个位点)的所有已知减毒位点的突变的昂贵且复杂技术的替换方案。
[0010]发明目的:
[0011]本申请的目的在于提供用于同时检测这三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎疫苗(萨宾)病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变的多重PCR试验。
[0012]本发明的另一个重要目的是提供用于同时检测这三种血清型的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定减毒位点的突变的新引物。[0013]本发明的再一个目的是提供用于多重PCR试验中的包含上述引物的试剂盒，所述试验用于同时检测这三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎疫苗(萨宾)病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变。
[0014]发明陈述
[0015]根据本发明，提供了用于同时检测这三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎疫苗(萨宾)病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变或SNP的试验和引物。
[0016]发明概述:
[0017]本发明涉及用于同时检测这三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎疫苗(萨宾)病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变的试验和新引物。本发明还提供了包含用于检测上述病毒的基因组中的所有特定位点上的突变的引物的试剂盒。
[0018]参考表/流程图/实施例等的本发明的简述:
[0019]图1&1A描绘了对于萨宾脊髓灰质炎病毒I和对照靶向的特定位置的核苷酸的突变-SNaP射击试验(shot assay)的结果。
[0020]图2&2A描绘了对于萨宾脊髓灰质炎病毒2和对照靶向的特定位置的核苷酸的突变-SNaP射击试验的结果。
[0021]图3&3A描绘了对于萨宾脊髓灰质炎病毒3和对照靶向的特定位置的核苷酸的突变-SNaP射击试验的结果。
[0022]图4描绘了 2%琼脂糖凝胶上的第一步多重PCR结果。
[0023]表1提供了脊髓灰质炎病毒的基因组中最有可能的减毒位点。
[0024]表2提供了用于制备目标特异性区域的DNA扩增子的引物。
[0025]参考附图/实施例的本发明的详述
[0026]参考表、附图等以及特定的实施方案描述了本发明；该描述不是想要以限制意义来解释。在参考本发明的描述时，本发明的各种供替换的实施方案将是本领域技术人员显而易见的。因此预期这些供替换的实施方案可形成本发明的一部分。
[0027]本发明提供了一种试验方法；一套特异性的新引物和包含这些特异性引物的试剂盒，用于在单个试验中同时检测所有三种亚型的脊髓灰质炎病毒的所有已知减毒位点的核苷酸，所述三种亚型即脊髓灰质炎病毒I (六个位点)，2 (三个位点)和3 (2个位点)。
[0028]该试验的其他优点在于可以利用相同原理进一步扩展至包括另外的位点。该试验基于多重逆转录PCR，以将脊髓灰质炎病毒基因组RNA转变成cDNA和DNA扩增子。然后将PCR产物用于多重SNP试验。使用Genetic Analyzer解析SNP试验产物，以鉴定脊髓灰质炎病毒基因组中的减毒位点的核苷酸(图1至3)。该试验适用于大量样品，并且用于测试疫苗以及现场分离物。该试验方法可以转变成定量试验。
[0029]试骀的详细内容:
[0030]1.从各种 来源获得脊髓灰质炎病毒样品(已知血清型，例如，脊髓灰质炎病毒1、2或3)。(从粪便样品分离1、2和3型脊髓灰质炎病毒，从NIBSc.PK获得口服脊髓灰质炎病毒疫苗(萨宾)株)。
[0031]2.使用反义PCR引物合成cDNA，并且在单个多重逆转录和PCR反应中产生DNA扩增子。
[0032]3.纯化PCR产物(DNA扩增子)。
[0033]4.使用本发明的“新引物”进行多重单核苷酸多态性检测试验[目前用于I型脊髓灰质炎病毒的试验包括6个引物对，2型包括3个引物对，3型包括2个引物对多重体]。
[0034]5.通过Genetic Analyzer上的电泳解析SNP,检索数据，并且使用Gene Mapper软件分析这些数据。
[0035]本发明的新颖性和创造性在新的引物设计、用于同时检测所有减毒位点的突变的多重试验的便利性和特异性以及包含这些特异性引物的试剂盒中是固有的。为了更好地理解本发明，如下提供进一步的详细内容:
[0036]表1:脊髓灰质炎病毒的基因组中最有可能的减毒位点
[0037]
脊髓灰质炎病毒(萨宾)减毒位点减毒等位基因&基因组位置_
脊髓灰质炎病毒 I6480-G、935-T、2438-A、2795-A、2879-T、
___6203-C_
脊髓灰质炎病毒 2__3__481-A, 2908-A、2909-T_
脊髓灰质炎病毒32_ 472-Τ、2034-T_
[0038]1.引物的设计:用于检测特`异性突变的新PCR引物
[0039]a.引物比待研究的减毒位点短一个核苷酸
[0040]b.已经设计了可变长度的5’端尾，并且结合在引物中。
[0041]c.尾片段不与引物靶向的基因组序列反应(互补)。
[0042]d.设计递增长度的引物(碱基对),使得在Genetic Analyzer中解析时，以递升次序首先表示第一个减毒位点，而最后一个位点在最后。
[0043]2,试骀方法
[0044]a.该试验能够鉴定靶向的所有核苷酸位置的等位基因，即，可以检测脊髓灰质炎病毒1、2和3中的所有减毒位点的核苷酸。
[0045]b.如果应当包括新位点，可以在一个多重试验中结合其他引物。
[0046]c.对于三种脊髓灰质炎病毒血清型，设计不同的引物组。
[0047]d.一个试验中可以研究所有减毒位点。
[0048]表2:用于制备目标特异性区域的DNA扩增子的引物
[0049]
【权利要求】
1.用于同时检测三种血清型的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变或SNP的试验，其包括以下步骤: a.从各种来源获得脊髓灰质炎病毒样品， b.通过使用反义PCR引物合成cDNA，产生步骤a的脊髓灰质炎病毒的DNA扩增子， c.纯化步骤b的DNA扩增子， d.使用SEQID 1-1I的PCR引物，进行多重单核苷酸多态性检测试验， e.通过电泳解析SNP, f.检索数据，并使用GeneMapper软件分析这些数据。
2.如权利要求1中所要求的用于同时检测三种血清型的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变或SNP的试验，其中所述病毒选自1-型脊髓灰质炎病毒(萨宾病毒)、2-型脊髓灰质炎病毒和3-型脊髓灰质炎病毒。
3.如权利要求1中所要求的用于同时检测三种血清型的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点突变的或SNP的试验，其中所述引物序列IDl至6检测1-型脊髓灰质炎病毒(萨宾病毒)中的SNP，引物序列ID7至9检测2-型脊髓灰质炎病毒中的SNP，引物序列IDlO至II用于检测3-型脊髓灰质炎病毒中的SWP。
4.如权利要求1中所要求的用于同时检测三种血清型的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变或SNP的试验，其中所述引物检测三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗(萨宾)病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒中的SNP。
5.如权利要求1中所要求的用于同时检测三种血清型的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变或SNP的试验，其中所述引物在其长度上具有变化。
6.如权利要求5中所要求的用于同时检测三种血清型的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变或SNP的试验，其中引物中的变化是比待研究的减毒位点短一个核苷酸。
7.如之前所述权利要求任一项中要求的试验，其中所述引物已经设计成结合可变长度的5’端尾。
8.如之前所述权利要求任一项中要求的试验，其中以递增的长度设计引物，使得当在Genetic Analyzer中解析时，以递升次序首先表示第一个减毒位点，而最后一个位点在最后。
9.如权利要求1中所要求的试验，其中如果要包括新的位点，则可以将附加引物并入一个多重试验中。
10.用于检测所有三种血清型的活减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗(萨宾)病毒、疫苗样和疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒的基因组中的特定位点的突变或SNP的试剂盒，其中该试剂盒包含所述序列ID I至II的引物。
【文档编号】C12Q1/70GK103717756SQ201280023280
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年3月7日 优先权日:2012年3月7日
【发明者】J·M·达什潘德, S·S·南迪, D·K·沙玛 申请人:印度医学研究理事会