一种灭活疫苗灭活程度的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种灭活疫苗灭活程度的检测方法，属于生物制品检测技术领域。
【背景技术】
[0002]灭活疫苗是目前制备工艺成熟、使用广泛、安全有效的疫苗，它以病原为基本物质，与灭活剂充分作用后加入佐剂制成，一方面因病原抗原表位的存在可以刺激机体产生抗体达到清除病原的目的，另一方面因病原的核酸与蛋白完全失活保证了使用与环境的安全，所以被广泛应用于多种疾病的预防。在病原确定的情况下，灭活疫苗制备的关键步骤是灭活，只有完全灭活的安全疫苗才能进行应用，所以需要对病原灭活的程度进行检验。现行灭活程度的检验一般通过接种对本毒敏感的细胞、禽胚或实验动物，根据病变或死亡状况进行判定，需花费多达5-6天的时间，耗时长且中间过程要求严格。传统的方法在科技创新和生产效率提升的背景下已不合时宜，因此研发一种全新高效的检测灭活疫苗灭活程度的方法具有重要意义。
【发明内容】
[0003]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种灭活疫苗灭活程度的检测方法，该方法是在全面深入分析疫苗灭活过程和机理的基础上，创新性的提出利用有害因素、遵循变害为利的原则，利用蛋白的空间表位在灭活过程和免疫检测中的特性，集成灭活原理、空间表位特征与筛选方法、免疫学检测方法而建立的，本发明提供的检测方法耗时短且安全性、检测精度及灵敏度高。
[0004]本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为:
本发明提供了一种灭活疫苗灭活程度的检测方法，该方法是以灭活中间产品所含空间表位的灭活作为疫苗灭活完全的标志。
[0005]进一步的，中间产品经甲醛灭活后，以灭活中间产品所含空间表位为目的蛋白，将此目的蛋白作为夹心ELISA法的检测对象，检测结果为阳性表明灭活不完全，阴性则表明灭活完全。
[0006]进一步的,所述病原蛋白空间表位的确定方法有肽扫描、氨基酸突变、X-ray、质谱、噬菌体展示，其他病原蛋白空间表位方法均可以应用于本发明的技术方案中。
[0007]所述夹心ELISA法包括以下步骤:
(1)将特异性抗体包被固相载体ELISA板，孵育后洗涤除去未结合的抗体和杂质，加入待检样品抗原，孵育一定时间，使抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物；
(2)洗涤除去其他未结合物质，随后加入酶标的特异性抗体，孵育使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物，洗涤除去未结合酶标抗体；
(3)最后加入显色底物进行显色，通过分光光度计测定0D450的值，结合阴阳性对照，最终确定待检样品的灭活程度。
[0008]本发明是对分子生物学领域蛋白质分析和制备、免疫学领域抗原分析和诊断的联合应用。甲醛灭活病毒时首先作用于核酸，与腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶等含有胺基的碱基结合而使病毒核酸变性。当甲醛浓度较高且作用时间足够长时，可与病毒蛋白质的胺基结合，形成羟甲基衍生物或二羟甲基衍生物，而后再与酰胺发生交联反应，致使病毒蛋白质变性，并阻止病毒核酸的逸出。所以，甲醛必须作用足够长的时间，才能保证病毒的核酸和蛋白发生变性。据此可知，蛋白变性发生在核酸变性之后，可以作为灭活完全的判定标准。
[0009]蛋白由氨基酸组成，其中能够激活免疫系统的氨基酸称为抗原表位(抗原决定簇)，它是抗原分子中能与相应淋巴细胞表面的受体结合的特殊化学基团，是引起免疫应答的物质基础。根据免疫应答过程中受体细胞的不同分为B细胞表位和T细胞表位两大类，其中B细胞表位是疫苗能够刺激机体产生抗体的有效部位，依据形态又可分为线性表位和构象表位。线性表位由连续的氨基酸序列组成，构象表位则是不连续的氨基酸序列，它存在于抗原分子三维结构表面，是B细胞主要的表位。
[0010]空间表位因其构象和存在的位置，能够比线性表位更好地被免疫系统识别，产生特异性抗体。但灭活剂使氨基酸发生交联而变性，空间表位随之被破坏，形成线性表位的状态或者失去蛋白活性，而线性表位因本身长度较短的线性状态则基本不受影响，所以空间表位存在与否与蛋白是否变性是一致的，能够作为灭活完全的判定标准。虽然灭活剂的作用对于疫苗来说是具有破坏性作用的，但我们可以以变害为利为原则，将灭活过程中有害部分抽提出来，利用空间表位的被破坏建立新的检验灭活疫苗灭活是否完全的方法。最后利用ELISA方法进行检测，灵敏度和准确度要远远高于肉眼观察细胞、禽胚和实验动物发生的病变，可与PCR方法相当，也避免了因病毒不同生长特性而导致CPE或病变延迟出现的问题。
[0011]本发明创新性的抽提出有害因素，遵循创新方法变害为利的原则，集成疫苗生产、分子生物学、免疫学等领域的成熟技术，建立全新高效的检验灭活疫苗灭活程度的方法。本发明的优点及有益效果为:
1.提高了检测精度和准确度，变定性检测为定量检测。
[0012]2.缩短了检测时间，整个检测过程最多只需24小时。同时需要的目的蛋白和抗体能够实现大量制备，一次制备可供多次使用。
[0013]3.提高了检测的准确性，利用免疫学技术纠正肉眼不易观察的病变。
【具体实施方式】
[0014]为了更好地理解本发明的实质，下面通过具体实施例和临床试验数据对本发明的技术方案进行进一步的阐述。
[0015]本发明中所用的生物、化学试剂均为常规市售，实施例中所使用的试验方法，如未特别指出，则为按照分子克隆实验室手册中所述的条件或者按照制造厂商提供的条件进行。
[0016]实施例1 Lasota株灭活疫苗灭活程度的检测
在生产中以鸡胚接种尿囊腔的方式进行病毒的扩增，随后收集尿囊液以甲醛为灭活剂进行灭活。利用肽扫描技术发现，新城疫HN蛋白是病毒的主要抗原蛋白，163-569残基包含的7个抗原表位均为空间表位，在免疫识别中起重要作用。所以以HN蛋白或某个空间表位为目的蛋白，昆虫细胞一杆状病毒表达系统为表达媒介进行蛋白的表达，获得具有天然构象的NDV HN蛋白或包含163-569位氨基酸范围内空间表位的蛋白。将蛋白纯化后免疫小鼠三次，每次间隔2周，最后一次免疫I周后采取全血，分离收集血清制备多克隆抗体。或者在获