专利名称：一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的效力检验方法
技术领域：
本发明涉及一种兽用灭活疫苗的效力检验方法，尤其涉及一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力的检验方法，属兽用生物制品检验技术领域。
背景技术：
鸭出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DH)是新近流行的、急性、高度接触性的一种新型鸭传染病，其病原为鸭出血性卵巢炎病毒(Duck Hemorrhagic OvaritisVirus, DHOV),在病毒分类上属于黄病毒科的成员，感染不同日龄鸭，引起性成熟鸭卵巢出血、睾丸萎缩、产蛋量、受精率和孵化率下降，鸭死淘率增加。在病毒分类地位的研究中，通过对分离病毒株的F4代鸭胚传代病毒的基因组序 列与已知的病毒进行序列同源性分析和进化分析，发现该病毒与黄病毒科黄病毒属的坦布苏病毒的遗传距离最近。在诊断方面，曹贞贞、万春和、苏敬良、滕巧泱等人报道可以采用临床症状、大体及组织病理变化、PCR扩增和病毒分离等方法确诊该病。关于该病的防控，北京市农林科学院和瑞普(保定)生物药业有限公司、齐鲁动物保健品有限公司、福建省农业科学院畜牧兽医研究所和重庆市农科院畜牧兽医研究所报道了利用该病暴发期间所分离的毒株制备疫苗的方法。林健、刘月焕等报道了利用产蛋鸭成功建立了鸭出血性卵巢炎的人工感染模型，为疫苗的评价奠定了实验基础。尚未见有客观、可行、操作性强和科学的疫苗效力评价方法的详细报道。
发明内容
本发明目的之一是提供一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价鸭的日龄范围和性别。本发明目的之二是提供鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价用疫苗免疫次数、采用时间、采集的组织样本、攻毒途径和检验用胚。本发明目的之三是提供一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价方法。本发明所用病毒毒株命名为鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏号为CCTCCV201122 ;所述鸭出血性卵巢炎病毒是ssRNA病毒，有囊膜，能够凝集鸽红细胞；病毒颗粒大体呈球状，直径40 60nm ;所述病毒对外界环境的抵抗力较强，在4°C中存放几周，在-20°C中存放几个月，其感染力均不受影响；所述病毒对乙醚、氯仿敏感；大多数去污剂能将它迅速灭活；在371条件下，用0. I %福尔马林熏蒸6h便可把它灭活。该病毒可在9 13日龄鸭胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，9 10日龄鸡胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，6日龄鸡胚卵黄囊，7 8日龄鸭胚卵黄囊中培养，也可在鸭胚成纤维细胞和BHK21细胞上培养。本发明所用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的制备方法已于2011年申报发明专利，申请号为 201110255115. I。本发明提供一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验方法，该方法使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫鸭，共免疫2次，首免后2周进行二免，二免后3 5周用鸭出血性卵巢炎病毒对免疫鸭进行攻毒；攻毒后采集鸭血清，将分离的血清接种SPF鸡胚或鸭胚，计算24-168h内死亡且鸭出血性卵巢炎病毒阳性的胚数，对照组鸭病毒分离阳性率为80%以上且免疫组鸭的病毒分离阴性率为70%以上判为疫苗效力检验合格。进一步地，本发明方法根据易感性实验结果，确定鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验用鸭的日龄为120 560日龄。优选地，效力检验用鸭的性别为雌性。其中，2次免疫鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的剂量为0. 5ml/只 2ml/只。其中，攻毒用鸭出血性卵巢炎病毒为DHOV-HB株(保藏编号为CCTCC V201122，已在申请号为201110255115. I的中国专利中公开)，攻毒剂量为3X IO4ELD500 其中，接种鸡胚或鸭胚是经卵黄囊接种6 8日龄SPF鸡胚或鸭胚。其中，鸡胚或鸭胚的接种量为0. 2ml/胚。其中，攻毒后4-5日，采集鸭血清。其中，所述的鸭为肉用鸭、蛋用鸭或SPF鸭。进一步地，本发明提供了一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验方法，该方法使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫120 560日龄雌鸭，首免后2周进行二免，两次的免疫剂量均为0. 5 2ml/只；二免后3 5周用DHOV-HB株攻毒,攻毒途径为口服、肌注或静脉注射，攻毒剂量为3 X IO4ELD50,攻毒后4-5日，采集鸭血清，经卵黄囊途径接种6 8日龄SPF鸡胚或鸭胚，0. 2ml/胚，37°C孵化，计算24 168h内胚死亡且检测为鸭出血性卵巢炎病毒感染阳性的胚数判为病毒分离阳性，对照组鸭病毒分离阳性率为80%以上且免疫组鸭的病毒分离阴性率为70%以上判为疫苗效力检验合格。采血时间、攻毒途径和采集样本鸭出血性卵巢炎灭活疫苗首次免疫后2周进行二次免疫，二次免疫后3 5周经口服、肌肉或静脉途径攻毒,攻毒后4-5日，采血,分离血清，用于病毒分离对照组鸭病毒分离阳性率为80%以上且免疫组鸭的病毒分离阴性率为70%以上判为疫苗效力检验合格。本发明首次提出了用于鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验使用鸭的日龄和性别，疫苗效力检验时疫苗的免疫次数、攻毒途径、取材时间、采集的组织样本、检验用胚，提出了免疫保护-病毒分离的疫苗效力检验方法、判定标准及疫苗质量合格的标准。解决了鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价方法和判定标准的空白。本发明确定的方法客观、全面、操作性强，可用于鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的实验室和临床效力评价。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的生物、化学试剂均为常规市售，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的北京鸭购自鸭出血性卵巢炎抗体阴性鸭场(北京金星鸭业中心南口种鸭场)，麻鸭购自鸭出血性卵巢炎抗体阴性鸭场(北京延庆县四海镇珍珠泉下花楼村)，SPF鸭由购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心的SPF鸭蛋孵化，SPF鸡隔离器中饲养至试验所需日龄。实施例I鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验用鸭的日龄
将42、50、100、120、200、300、400、560 和 600 日龄的北京鸭分为 9 组，每组 10 只，
每组均为同一日龄的北京鸭(购自北京金星鸭业中心南口种鸭场，鸭出血性卵巢炎抗体为阴性)。试验鸭经口服途径攻毒相同剂量的DHOV-HB株病毒，约含3X IO4ELD5tl/只，攻毒后5天经翅静脉采集鸭血，无菌分离血清。血清经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚，5枚/鸭，
0.2ml/胚，置37°C继续孵化至168h。24h以内死亡鸡胚弃去，计算24 168h内死亡且DHOV的RT-PCR检测阳性鸡胚数。每份血清5枚鸡胚中有I枚及以上鸡胚死亡且DHOV的RT-PCR检测阳性者记为该鸭病毒分离阳性。根据易感性实验结果，确定鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验用鸭的日龄为120 560日龄。易感鸭或鸭胚的检验标准(一)易感鸭5只来自未经鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫或有鸭出血性卵巢炎流行史鸭群的鸭，每只鸭口服I. 0毫升无菌0. 5%水解乳蛋白Hank’ s液100倍稀释的检验用毒株。攻毒后5日，米血,分尚血清进行病毒分尚。病毒分尚率应至少4/5阳性。 (二)易感胚 10枚来自未经鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫或有鸭出血性卵巢炎疫病流行史种鸭群所产的种蛋，37°C孵化至10日龄。经尿囊腔接种0.5%无菌水解乳蛋白Hank’ s液(LH) 500倍稀释的任何代次的种毒，每胚0. 1ml，置36 37°C条件下继续孵化。鸭胚应于接种后24 96小时至少9/10死亡。死亡鸭胚眼观病变为全身出血。实施例2鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价用鸭的性别将80只120日龄雌雄各半的北京鸭经口服途径攻毒相同剂量的DHOV-HB株病毒，约含3X IO4ELD5tl/只。攻毒后I 8天经翅静脉采集鸭血，10只/天，无菌分离血清。血清经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚，每只鸭的血清接种5枚鸡胚，0. 2ml/胚，置37°C继续孵化至168h。24h以内死亡鸡胚弃去,计算24 168h内死亡且DHOV阳性鸡胚数。每份血清5枚鸡胚中有I枚及以上鸡胚死亡且DHOV阳性者记为该鸭病毒分离阳性。雌性北京鸭病毒分离阳性率明显高于雄性北京鸭。对攻毒后每日雌雄鸭血清接种鸡胚后出现的病毒感染鸡胚的阳性率进行双样本的成对t检验，P值小于0. 05，性别在易感性方面有显著差异。实施例3鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价的免疫保护-病毒分离法(I)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号2012001，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫140日龄北京鸭10只，均为雌性，作为疫苗免疫组。疫苗免疫组的免疫剂量和方法为首免疫苗剂量为Iml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同剂量和相同途径二免,二免后4周攻毒,攻毒毒株为DHOV-HB株，口服途径攻毒，每只鸭攻毒剂量约为3 X IO4ELD5tlt5同时设未感染DHOV和未免疫鸭出血性卵巢炎灭活疫苗易感的北京鸭(10只，雌性)为对照组进行攻毒。攻毒后第5天，采集鸭血清，每只鸭血清经卵黄囊途径接种5枚6日龄SPF鸡胚，0. 2ml/胚，37°C孵化，连续观察至168小时。24小时内死亡鸡胚弃去,24 168小时内鸡胚中I枚及以上鸡胚死亡并RT-PCR阳性计算为该鸭出血性卵巢炎病毒分离阳性。免疫组鸭的攻毒保护率为90%，未免疫组鸭的发病率为80%，说明本批次疫苗效力检验合格。实施例4鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价的免疫保护-病毒分离法(2)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号2012002，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫120日龄北京鸭10只，均为雌性，作为疫苗免疫组。疫苗免疫组的免疫剂量和方法为首免疫苗剂量为0.5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同剂量和相同途径二免,二免后3周攻毒,攻毒毒株为DHOV-HB株,肌肉注射途径攻毒，每只鸭攻毒剂量约为3 X IO4ELD5tlt5同时设未感染DHOV的和未免疫鸭出血性卵巢炎灭活疫苗易感北京鸭(10只，雌性)为对照组进行攻毒。攻毒后第5天，采集鸭血清，每只鸭血清经卵黄囊途径接种5枚6日龄SPF鸡胚，0. 2ml/胚，37°C孵化，连续观察至168小时。24小时内死亡鸡胚弃去，24 168小时内鸡胚中I枚及以上鸡胚死亡并RT-PCR阳性计算为该鸭出血性卵巢炎病毒分离阳性。免疫组鸭的攻毒保护率为70%，未免疫组鸭的发病率为90%，说明本批次疫苗效力检验合格。实施例5鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价的免疫保护-病毒分离法(3)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号2012003，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫560日龄北京鸭10只，均为雌性，作为疫苗免疫组。疫苗免疫组的免疫剂量和方法为首免疫苗剂量为2ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同剂量和相同途径二免,二免后5周攻毒,攻毒毒株为DHOV-HB株，口服途径攻 毒，每只鸭攻毒剂量约为3 X IO4ELD5tlt5同时设未感染DHOV和未免疫鸭出血性卵巢炎灭活疫苗易感的北京鸭(10只，雌性)为对照组进行攻毒。攻毒后第5天，采集鸭血清，每只鸭血清经卵黄囊途径接种5枚7日龄SPF鸭胚，0. 2ml/胚，37°C孵化，连续观察至168小时。24小时内死亡鸭胚弃去，24 168小时内鸭胚中I枚及以上鸭胚死亡并RT-PCR阳性计算为该鸭出血性卵巢炎病毒分离阳性。免疫组鸭的攻毒保护率为80%，未免疫组鸭的发病率为100%，说明本批次疫苗效力检验合格。实施例6鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价的免疫保护-病毒分离法(4)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号2012004，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫300日龄北京鸭10只，均为雌性，作为疫苗免疫组。疫苗免疫组的免疫剂量和方法为首免疫苗剂量为Iml/只，胸部肌肉注射。首免后2周，按照相同剂量和相同途径二免，二免后4周攻毒,攻毒毒株为DHOV-HB株,静脉注射途径攻毒，每只鸭攻毒剂量约为3X IO4ELD5tlt5同时设未感染DHOV和未免疫鸭出血性卵巢炎灭活疫苗易感的北京鸭(10只，雌性)为对照组进行攻毒。攻毒后第5天，采集鸭血清，每只鸭血清经卵黄囊途径接种5枚8日龄SPF鸡胚，0. 2ml/胚，37°C孵化，连续观察至168小时。24小时内死亡鸡胚弃去，24 168小时内鸡胚中I枚及以上鸡胚死亡并RT-PCR阳性计算为该鸭出血性卵巢炎病毒分离阳性。免疫组鸭的攻毒保护率为70%，未免疫组鸭的发病率为90%，说明本批次疫苗效力检验合格。实施例7鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价的免疫保护-病毒分离法(5)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号2012005，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫400日龄北京鸭10只，均为雌性，作为疫苗免疫组。疫苗免疫组的免疫剂量和方法为首免疫苗剂量为I. 5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同剂量和相同途径二免,二免后3周攻毒,攻毒毒株为DHOV-HB株，口服途径攻毒，每只鸭攻毒剂量约为3 X IO4ELD5tlt5同时设未感染DHOV和未免疫鸭出血性卵巢炎灭活疫苗易感的北京鸭(10只，雌性)为对照组进行攻毒。攻毒后5天，采集鸭血清，每只鸭血清经卵黄囊途径接种5枚8日龄SPF鸡胚，0. 2ml/胚，37°C孵化，连续观察至168小时。24小时内死亡鸡胚弃去,24 168小时内鸡胚中I枚及以上鸡胚死亡并RT-PCR阳性计算为该鸭出血性卵巢炎病毒分离阳性。免疫组鸭的攻毒保护率为90%，未免疫组鸭的发病率为90%，说明本批次疫苗效力检验合格。实施例8鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价的免疫保护-病毒分离法(6)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号2012006，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫200日龄北京鸭10只，均为雌性，作为疫苗免疫组。疫苗免疫组的免疫剂量和方法为首免疫苗剂量为0.5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同剂量和相同途径二免,二免后5周攻毒,攻毒毒株为DHOV-HB株,肌肉注射途径攻毒，每只鸭攻毒剂量约为3 X IO4ELD5tlt5同时设未感染DHOV和未免疫鸭出血性卵巢炎灭活疫苗易感的北京鸭(10只，雌性)为对照组进行攻毒。攻毒后5天，采集鸭血清，每只鸭血清经卵黄囊途径接种5枚7日龄SPF鸡胚，0. 2ml/胚，37°C孵化，连续观察至168小时。24小时内死亡鸡胚弃去，24 168小时内鸡胚中I枚及以上鸡胚死亡并RT-PCR阳性计算为该鸭出血性卵巢炎病毒分离阳性。免疫组鸭的攻毒保护率为80%，未免疫组鸭的发病率为90%，说明本批次疫苗效力检验合格。实施例9鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价的免疫保护-病毒分离法(7) 使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号2012001，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫160日龄麻鸭10只，均为雌性，作为疫苗免疫组。疫苗免疫组的免疫剂量和方法为首免疫苗剂量为0.5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周，按照相同剂量和相同途径二免,二免后5周攻毒,攻毒毒株为DHOV-HB株，口服途径攻毒，每只鸭攻毒剂量约为3 X IO4ELD5tlt5同时设未感染DHOV和未免疫鸭出血性卵巢炎灭活疫苗易感的麻鸭(10只，雌性)为对照组进行攻毒。攻毒后4天，采集鸭血清，每只鸭血清经卵黄囊途径接种5枚6日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，37°C孵化，连续观察至168小时。24小时内死亡鸡胚弃去,24 168小时内鸡胚中I枚及以上鸡胚死亡并RT-PCR阳性计算为该鸭出血性卵巢炎病毒分离阳性。免疫组鸭的攻毒保护率为70%，未免疫组鸭的发病率为80%，说明本批次疫苗效力检验合格。实施例10鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价的免疫保护-病毒分离法(8)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号2012001，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫120日龄SPF鸭10只，均为雌性，作为疫苗免疫组。疫苗免疫组的免疫剂量和方法为首免疫苗剂量为0.5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同剂量和相同途径二免,二免后5周攻毒,攻毒毒株为DHOV-HB株，口服途径攻毒，每只鸭攻毒剂量约为3 X IO4ELD500同时设未感染DHOV的SPF鸭(10只，雌性)为对照组进行攻毒。攻毒后4天，采集鸭血清，每只鸭血清经卵黄囊途径接种5枚6日龄SPF鸡胚，0. 2ml/胚，37°C孵化，连续观察至168小时。24小时内死亡鸡胚弃去，24 168小时内鸡胚中I枚及以上鸡胚死亡并RT-PCR阳性计算为该鸭出血性卵巢炎病毒分离阳性。免疫组鸭的攻毒保护率为80%，未免疫组鸭的发病率为90%，说明本批次疫苗效力检验合格。本发明实施例3-10均使用RT-PCR的方法检测病毒，该方法的引物依据文献报道的NS5基因设计黄病毒属通用引物(上游5’ -TCA AGG AAC TCC ACA CAT GAG ATG TACT-3';下游:5，-GTG TCC CAT CCT GCT GTG TCA TCA GCA TAC A-3’)，理论扩增片段长度988bp0依据Trizol试剂盒说明书进行鸡胚尿囊液或胚体的RNA提取，同时设阴、阳性质控样品，依据试剂盒说明书进行RT-PCR，PCR产物取10 ill进行1%的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段在IKb左右，且阳性对照在IKb左右，阴性对照IKb左右无条带出现，则可判断待测样 品为鸭出血性卵巢炎病毒阳性。
权利要求
1.一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫鸭，共免疫2次,首免后2周进行二免,二免后3 5周用鸭出血性卵巢炎病毒对免疫鸭进行攻毒；攻毒后采集鸭血清，将分离的血清接种SPF鸡胚或鸭胚，计算24-168h内死亡且鸭出血性卵巢炎病毒阳性的胚数，对照组鸭病毒分离阳性率为80%以上且免疫组鸭的病毒分离阴性率为70%以上判为疫苗效力检验合格。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，效力检验用鸭的日龄为120 560日龄。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，效力检验用鸭的性别为雌性。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述2次免疫的剂量为0.5ml/只 2ml/只。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的攻毒用鸭出血性卵巢炎病毒为DHOV-HB 株，攻毒剂量为 3 X IO4ELD500
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述接种鸡胚或鸭胚是经卵黄囊接种6 8日龄SPF鸡胚或鸭胚。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述鸡胚或鸭胚的接种量为0.2ml/胚。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，攻毒后4-5日，采集鸭血清。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的鸭为肉用鸭、蛋用鸭或SPF鸭。
10.一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫120 560日龄雌鸭，首免后2周进行二免，两次的免疫剂量均为0. 5 2ml/只；二免后3 5周用DHOV-HB株攻毒,攻毒途径为口服、肌注或静脉注射，攻毒剂量为3X IO4ELD5tl，攻毒4-5日后，采集鸭血清，经卵黄囊途径接种6 8日龄SPF鸡胚或鸭胚，0.2ml/胚，37°C孵化，计算24 168h内胚死亡且检测为鸭出血性卵巢炎病毒感染阳性的胚数判为病毒分离阳性，对照组鸭病毒分离阳性率为80%以上且免疫组鸭的病毒分离阴性率为70%以上判为疫苗效力检验合格。
全文摘要
本发明提供了一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的效力检验方法，该方法使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫鸭，共免疫2次，首免后2周进行二免，二免后3～5周用鸭出血性卵巢炎病毒对免疫鸭进行攻毒；攻毒后采集鸭血清，将分离的血清接种SPF鸡胚或鸭胚，计算24-168h内死亡且鸭出血性卵巢炎病毒阳性的胚数，对照组鸭病毒分离阳性率为80%以上且免疫组鸭的病毒分离阴性率为70%以上判为疫苗效力检验合格。本发明提供的鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的效力检验方法具有操作简便、结果准确的优势，可推广应用。
文档编号G01N33/15GK102749427SQ20121020361
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者何平有, 刘月焕, 刘浩, 徐倩倩, 朱秀同, 杨保收, 林健, 梁武, 段会娟, 毛雅园, 潘洁, 赵际成, 郁宏伟, 韩春华 申请人:北京市农林科学院畜牧兽医研究所, 瑞普(保定)生物药业有限公司