甲肝疫苗接种效果快速评价试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型属于生物检测领域，具体涉及一种甲肝疫苗接种效果快速评价试剂盒。所述试剂盒包括盒体、装有样品稀释液的容器和检测试纸，所述检测试纸是由底板（1）和相互紧密搭接粘贴在底板上的样品垫（6）、抗原垫（5）、标记物结合垫（4）、包被膜（3）和吸收垫（2）组成，根据WHO推荐的甲肝抗体最低保护滴度水平，将试剂盒的最低检测线设定为20mIU/ml，用于检测血清/血浆/全血中的抗甲型肝炎病毒IgG抗体。本实用新型所述的试剂盒成本低廉，制备工艺简单，检测血清抗体的结果与ELISA试剂盒的结果无显著差异适，可以用于甲肝疫苗接种后免疫效果的快速评价。
【专利说明】甲肝疫苗接种效果快速评价试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物检测领域，具体涉及一种甲肝疫苗接种效果快速评价试剂盒。
【背景技术】
[0002]甲型病毒性肝炎是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒，HAV)引起的急性肝脏炎症，主要表现为食欲减退、恶心呕吐、乏力、肝大及肝功异常，病初常有发热，临床经过常呈自限性，绝大多数患者在数周内可恢复正常。在许多发展中国家，80%以上的青少年急性病毒性肝炎为甲型肝炎病毒感染，在发达国家，甲型肝炎也是较为常见的急性病毒性肝炎。
[0003]HAV属于微小核糖核酸病毒科嗜肝病毒属,人是HAV的唯一宿主,主要通过粪口途径在人与人之间传播，尤其是密切接触者间的传播更为明显，年幼的儿童及青少年具有较高的感染率而且通常为无症状感染者，因此是潜在的感染源。
[0004]预防甲肝流行的有效措施主要是接种甲肝疫苗。我国的扩大国家免疫规划已将甲肝疫苗列入常规免疫程序，每年大约有数千万儿童接受免疫接种。这提示我们，有必要对甲肝疫苗的群体免疫效果进行评价。评价疫苗免疫效果最可靠的方法就是检测接种者体内血清中的特异抗体的含量。当前市场上检测风疹抗体的商品化试剂盒多采用酶联免疫法和化学发光法，这些方法虽然灵敏度高、结果准确、化学发光试剂还可以对抗体进行定量，但在实际操作上存在诸多不便，如步骤复杂、耗时较长，还需使用特定的仪器设备；试剂盒需4°C保存；对样品要求静脉采血等，不易在基层普及运用。
[0005]免疫胶体金快速诊断技术是建立在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术和免疫胶体金标记技术基础上，以胶体金为标记物，利用特异的抗原抗体反应放大反应信号，通过直接观察就可以判定结果的新技术。该技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，在临床医学检测、动物医学检测、激素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速检测等诸多诊断领域迅速发展。目前，胶体金标记的快速检测抗体的检测试纸都是由样品垫、标记物结合垫、包被膜(其上划有检测线、质控线)和吸收垫组成，根据检测原理的不同大体分为两种:一种是将抗原标金，在标记物结合垫上包被胶体金标记的抗原，在包被膜上用待测抗体的抗体划膜得到检测T线；另一种是将抗原划膜，在标记物结合垫上包被胶体金标记的待测抗体的抗体，在包被膜上用抗原划膜得到检测T线。现有研究表明:因为抗体蛋白性质较为稳定，所以对抗体蛋白的胶体金标记较为稳定，因此上述第一种方法所述的抗原的胶体金标记则存在颇多问题，因为抗原多为病毒类，性质多样，有的大小甚至比胶体金颗粒还大，且稳定性较差，因此很难直接将抗原标记在胶体金颗粒上；即使勉强能将抗原标记上，也需要抗原达到极高的纯度，而对抗原病毒的纯化是一项难度较大、成本较高的工程；也有人寻找抗原的重组抗原来代替这些天然抗原，但是很多抗原很难寻到能替代的重组抗原，而且即使有，成本也是极高的，由此说明，上述第一种方法的局限性比较高。上述的第二种方法使用待测抗体的抗体进行金标记，这种方法可以避免抗原金标记的问题，但在包被膜上使用抗原划膜得到检测T线，需要抗原具有较高的浓度和纯度，这也增加了产品生产的成本和难度；另外将抗原划到膜上，由于抗原稳定性较差，抗原划膜后很难长时间保存，因此试纸条的有效期极短。这些都是限制抗体快速检测类试剂盒快速发展的原因。
【发明内容】
[0006]本实用新型针对现有技术的不足，目的在于提供一种甲肝疫苗接种效果快速评价试剂盒，用该试剂盒对接种者体内血清中的甲肝病毒IgG抗体进行胶体金法快速检测，可以实现对甲肝疫苗接种效果的快速评价。
[0007]本实用新型所采用的技术方案为:
[0008]甲肝疫苗接种效果快速评价试剂盒，包括盒体、装有样品稀释液的容器和检测试纸，所述装有样品稀释液的容器和检测试纸位于盒体内，其特征在于，所述检测试纸是由底板和相互紧密搭接粘贴在底板上的样品垫、抗原垫、标记物结合垫、包被膜和吸收垫组成，所述抗原垫上包被有甲肝抗原，所述标记物结合垫上包被有胶体金标记的鼠抗甲肝单克隆抗体，所述包被膜上固定有检测T线和质控C线，所述检测T线上包被有鼠抗人IgG抗体，所述质控C线上包被有羊抗鼠IgG抗体；所述检测试纸的最低检测线为20mIU/ml。
[0009]按上述方案，所述抗原垫为玻璃纤维、无纺布或聚酯膜。
[0010]按上述方案，所述底板为PVC底板，所述PVC底板的一面为双面胶。
[0011]按上述方案，所述包被膜为硝酸纤维素膜。
[0012]按上述方案，所述标记物结合垫和样品垫为玻璃纤维，所述吸收垫为吸水纸。
[0013]按上述方案，所述样品稀释液为含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和叠氮钠的混合水溶液。
[0014]按上述方案，所述抗原垫的制备方法为:使用抗原保护液将甲肝抗原进行稀释后均匀铺在玻璃纤维、无纺布或聚酯膜上，置于37°C，相对湿度低于40%的环境中，干燥4小时，制成抗原垫；所述抗原保护液的配方为:Na2HP045.72g，NaH2PO40.624g，柠檬酸三钠8.5g，蔗糖10g，叠氮钠lg，水定容至1L;所述甲肝抗原为粗抗原，其中抗原的含量为40wt %?50wt % ο
[0015]本实用新型中，所述试剂盒中检测试纸的检测原理为:在样品垫加入血清或血浆或全血样品，再加入2?3滴样品稀释液，若样品中含有甲肝病毒IgG抗体，其将和抗原垫中的甲肝抗原形成甲肝抗原-甲肝病毒IgG抗体复合物，该复合物向前移动，复合物中的甲肝抗原再与标记物结合垫中的胶体金标记的鼠抗甲肝单克隆抗体结合，形成甲肝病毒IgG抗体-甲肝抗原-胶体金标记的鼠抗甲肝单克隆抗体免疫复合物，该复合物由于层析作用沿纸条向前移动，至检测T线，复合物中的甲肝病毒IgG抗体与检测T线上包被的鼠抗人IgG抗体反应形成鼠抗人IgG抗体-甲肝病毒IgG抗体-甲肝抗原-胶体金标记的鼠抗甲肝单克隆抗体免疫复合物，该复合物可聚集在检测区，当聚集的复合物达到一定的数量时，则形成一条肉眼可见的条带(T线)，判断结果为阳性；若样品中不含有或含很少量的甲肝病毒IgG抗体，则不能形成免疫复合物，即不能形成肉眼可见的条带，判断结果为阴性；C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性检测样品均会产生条带。
[0016]同时，依据世界卫生组织(WHO)推荐的血清中甲肝病毒的最低保护抗体滴度水平为20mIU/ml，即当接种者体内甲肝病毒抗体的浓度彡20mIU/ml，说明甲肝疫苗接种成功，当接种者体内甲肝病毒抗体的浓度<20mIU/ml，说明甲肝疫苗接种不成功。本实用新型中，将试剂盒的灵敏度设置为20mIU/ml，甲肝病毒IgG抗体的检测结果为阳性即表明甲肝疫苗免疫成功，甲肝病毒IgG抗体的检测结果为阴性即表明甲肝疫苗免疫不成功。因此，本实用新型所述的试剂盒可以实现快速评价甲肝疫苗的接种效果。
[0017]本实用新型试剂盒的使用方法:甲肝将检测试纸平放，在样品垫加入5μ I血样，再加入2?3滴样品稀释液，用肉眼直接观察在20分钟内检测T线和质控C线的显色情况:质控C线不显色，说明本试验失败；质控C线显色，检测T线不显色说明甲肝疫苗接种不成功；质控C线和检测T线均显色说明甲肝疫苗接种成功。
[0018]本实用新型的有益效果:
[0019](I)与现有技术相比，本实用新型所述的检测试纸增加了抗原垫的结构，通过在抗原垫上加入抗原保护液并包被甲肝抗原，在标记物结合垫上包被鼠抗甲肝单克隆抗体，解决了甲肝病毒抗原由于稳定性差而不容易被金标记的问题；另一方面，本实用新型采用鼠抗人IgG抗体划膜得到检测T线，因为抗体相比较为稳定，因此试纸条的有效期极长。
[0020](2)本实用新型所述甲肝抗原为粗抗原，不需对粗抗原进一步纯化就能达到反应效果，这是因为在试纸条反应层析过程中，已经通过双抗体夹心法对粗抗原进行了筛选和纯化，保证了试剂反应的特异性，因此检测试纸的制备成本低，利于推广；实验结果表明，利用本实用新型所述的检测试纸检测抗体，检测的结果与ELISA检测结果一致。
[0021](3)与现有技术相比，本实用新型所述的试剂盒具有快速、简便、灵敏、特异的特点，摆脱了试剂对设备、仪器、人员及储存盒运输环境的特殊要求，将试剂盒的灵敏度设置为20mIU/ml，可以实现对甲肝疫苗接种效果的快速评估。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本实用新型的试剂盒整体结构示意图，其中A-盒体，B-装有样品稀释液的容器，C-检测试纸，D-说明书。
[0023]图2为本实用新型的试剂盒中检测试纸的结构示意图，其中，1-底板，2-吸收垫，3-包被膜，4-标记物结合垫，5-抗原垫，6-样品垫，7-质控C线，8-检测T线。
【具体实施方式】
[0024]为了更好地理解本实用新型，下面结合实施例进一步阐明本实用新型的内容，但本实用新型的内容不仅仅局限于下面的实例。
[0025]如图1所示，甲肝疫苗接种效果快速评价试剂盒，其特征在于，包括盒体A、装有样品稀释液的容器B和检测试纸C，所述装有样品稀释液的容器B和检测试纸C位于盒体A内，所述检测试纸是由底板I和相互搭接粘贴在底板上的样品垫6、抗原垫5、标记物结合垫4、包被膜3和吸收垫2组成，所述抗原垫上包被有甲肝抗原，所述标记物结合垫上包被有胶体金标记的鼠抗甲肝单克隆抗体，所述包被膜上固定有检测T线8和质控C线7，所述检测T线上包被有鼠抗人IgG抗体，所述质控C线上包被有羊抗鼠IgG抗体；所述检测试纸的最低检测线为20mIU/ml。
[0026]盒体A内放置有说明书D。
[0027]所述样品稀释液为含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和叠氮钠的混合水溶液。以下实施例中，样本稀释液的组分为磷酸氢二钠5.72g，磷酸二氢钠0.624g，氯化钠Sg，叠氮钠0.5g，超纯水定容至1L。
[0028]所述底板为PVC底板，所述PVC底板的一面为双面胶。
[0029]所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述抗原垫为玻璃纤维、无纺布或聚酯膜。
[0030]所述标记物结合垫和样品垫为玻璃纤维，所述吸收垫为吸水纸。
[0031]所述抗原垫通过使用抗原保护液将甲肝抗原进行稀释后均匀铺在玻璃纤维、无纺布或聚酯膜上获得，所述抗原为粗抗原，其中抗原的含量为40wt%? 50wt%。
[0032]实施例1甲肝疫苗接种效果快速评价试剂盒
[0033]主要材料
[0034]抗原:甲肝病毒抗原，购自武汉赛欣生物技术有限公司，用于制备抗原垫。鼠抗人IgG抗体，购自厦门波生生物技术有限公司，用于硝酸纤维素膜T线的包被。
[0035]鼠抗甲肝单克隆抗体，购自武汉赛欣生物技术有限公司，用于标记胶体金。
[0036]羊抗鼠IgG抗体，购自杭州隆基生物技术有限公司，用于硝酸纤维素膜质控C线的包被。
[0037]氯金酸:sigma公司产品。
[0038]硝酸纤维素膜:miIIipore公司产品。
[0039]牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白:sigma公司产品。
[0040]其余化学试剂均为分析纯试剂。
[0041]临床血清由公司在武汉市血液中心获得，其中甲肝病毒IgG抗体阳性225份，IgG抗体阴性样本75份。
[0042]甲肝病毒IgG抗体检测试剂盒(ELISA法):购自潍坊三维生物工程集团有限公司。国内已注册的商用产品。
[0043]2、标记物结合垫的制备
[0044]氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后，取10ml胶体金溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，调节PH至8.0，然后按每10ml胶体金溶液0.5mg抗体加入鼠抗甲肝病毒单克隆抗体0.5mg，继续搅拌30min，再加入终浓度为1%的BSA进行封闭，继续搅拌30min。标记结束后，以10000r/min对标记液进行离心,弃上清,然后将沉淀用复溶溶液进行复溶至原体积。所述复溶溶液的配方为:Trisl.965g，Casein-Na2.5g，柠檬酸三钠2.5g，吐温-20 0.50ml，蔗糖10.0g，叠氮钠1.0g，用超纯水定容至1L。将复溶好的金标记溶液按每ml溶液铺18cm2的比例均匀铺在玻璃纤维上，置于37°C，相对湿度低于20%的环境中，干燥12?18小时，制成标记物结合垫。
[0045]3、抗原垫的制备
[0046]将获得的甲肝病毒抗原使用抗原保护液稀释到8倍得到抗原液，将稀释好的抗原液按每ml溶液铺18cm2的比例均匀铺在玻璃纤维上，置于37°C，相对湿度低于40%的环境中，干燥4小时，制成抗原垫。所述抗原保护液的配方为:Na2HP045.72g，NaH2PO40.624g，柠檬酸三钠8.5g,鹿糖1g,叠氮钠lg，纯化水定容至1L。
[0047]4、包被膜的制备
[0048]使用0.02M，pH为7.2的磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgG抗体(T线溶液)稀释成1.5mg/ml，羊抗鼠IgG(C线溶液)稀释至1.0mg/ml。然后使用划膜仪将T线与C线溶液按1.5ul/cm的出液量均匀地包被于NC膜上，NC膜已事先黏贴于塑料底板上，包被完成后，将NC膜置于37°C，相对湿度低于40%的环境中，干燥3?4小时，制成包被膜。
[0049]5、甲肝病毒IgG抗体检测试纸的组装
[0050]在干燥环境下(温度20?25°C，相对湿度低于30% )，将包被膜置于洁净环境中，在NC膜的T线端，标记物结合垫(结合垫已事先切裁成6mm宽)紧密压接NC膜2mm，抗原垫(抗原垫已事先切裁成1mm宽)紧密压接标记物结合垫另一侧2mm，样品垫紧密压接抗原垫另一侧4?5mm,最后用切条机将贴好的底板切成4_宽的试纸条。
[0051]6、甲肝病毒IgG抗体检测试纸的使用方法
[0052]将待检血清或血浆或全血(待检样品)平衡至室温，上述制备好的检测试纸平放于试验台上，在样品垫处加入5ul待检样品，再加入2?3滴样品稀释液，若样品中含有甲肝病毒IgG抗体，样品加入后，甲肝IgG抗体先与抗原垫中甲肝抗原形成抗原-甲肝病毒IgG抗体复合物，复合物向前移动，与标记物结合垫中的金标记的鼠抗甲肝单克隆抗体形成甲肝IgG抗体-甲肝抗原-金标记的鼠抗甲肝单克隆抗体免疫复合物，该复合物由于层析作用沿纸条向前移动，至检测T线与鼠抗人IgG抗体反应形成鼠抗人IgG抗体-人甲肝IgG抗体-甲肝抗原-金标记的鼠抗甲肝单克隆抗体免疫复合物，该复合物可聚集在检测区，当聚集的复合物达到一定的数量时，则形成一条肉眼可见的条带(T线)，判断结果为阳性；若样品中不含有或含很少量的甲肝病毒IgG抗体，则不能形成免疫复合物，则不能形成肉眼可见的条带，判断结果为阴性。C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性检测样品均会产生条带。用肉眼直接观察试纸条在20分钟内的出线情况，并判定检测结果。
[0053]7、根据世界卫生组织规定的甲肝病毒IgG抗体的最低保护滴度为20mIU/ml，当甲肝病毒IgG抗体浓度> 20mIU/ml说明人体对甲肝病毒具有抵抗性，当甲肝病毒IgG抗体浓度< 20mIU/ml说明人体对甲肝病毒还没有产生抵抗性，因此本试纸条将检测甲肝病毒IgG抗体的检测临界值设置为20mIU/ml，T线显线表明甲肝病毒IgG抗体的浓度彡20mIU/ml,甲肝疫苗接种成功^线不显线表明甲肝病毒IgG抗体的浓度<20mIU/ml，甲肝疫苗没有接种成功。
[0054]8、临床样品检测结果对照
[0055]对公司收集的临床血清样本使用本申请所述检测试纸及商用检测ELISA试剂盒同时进行检测，再对检测结果进行对照。
[0056]以ELISA试剂盒为对照，对甲肝病毒IgG抗体进行检测，检测出225份甲肝IgG阳性样本，75份甲肝IgG阴性样本，而本申请试纸条检测出224份甲肝IgG阳性样本，76份甲肝IgG阴性样本，总体符合率为99.33%。临床检测结果表明，本申请检测试纸的的性能和ELISA试剂盒相比无显著差异，说明本实用新型所述的试剂盒适合用于临床检验，具有实用价值。
[0057]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本实用新型创造的保护范围之内。
【权利要求】
1.甲肝疫苗接种效果快速评价试剂盒，包括盒体、装有样品稀释液的容器和检测试纸，所述装有样品稀释液的容器和检测试纸位于盒体内，其特征在于，所述检测试纸是由底板和相互紧密搭接粘贴在底板上的样品垫、抗原垫、标记物结合垫、包被膜和吸收垫组成，所述抗原垫上包被有甲肝抗原，所述标记物结合垫上包被有胶体金标记的鼠抗甲肝单克隆抗体，所述包被膜上固定有检测T线和质控C线，所述检测T线上包被有鼠抗人IgG抗体，所述质控C线上包被有羊抗鼠IgG抗体；所述检测试纸的最低检测线为20mIU/ml。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原垫为玻璃纤维、无纺布或聚酯膜。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底板为PVC底板，所述PVC底板的一面为双面胶。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被膜为硝酸纤维素膜。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物结合垫和样品垫为玻璃纤维，所述吸收垫为吸水纸。
【文档编号】G01N33/577GK204203233SQ201420633783
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】吴边, 张薇, 金玉翠, 倪龙泉, 龚华岳, 王方杰 申请人:武汉生命科技股份有限公司