一种猪用三联灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪用三联灭活疫苗的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌是当今危害养猪业的重要 细菌性病原，常与猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒或猪流感病毒发生 混合感染，严重危害养猪业的发展。
[0003] 副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPs)是猪Glasser' s病的病原体，隶属 于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，是猪上呼吸道的一种共栖菌，侵入机体会引起以纤维素性多发 性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征的全身性疾病。HPs只感染猪，具很强的宿主特异性， 成年猪不表现明显症状，多发于各年龄段的仔猪和架子猪，在断奶前后和保育舍阶段发病， 通常见于5~8周龄，发病率达40%，死亡率可达50%。HPs血清型众多，目前已鉴定了 15 个血清型，但不能分型的副猪嗜血杆菌仍有很多，占分离株的15. 2%~41 %。HPs产生耐药 性较快，耐药后敏感性不易恢复，近年，副猪嗜血杆菌病普遍发生，多种抗菌药物的使用导 致耐药性极为普遍，因此，制定合理免疫防疫制度，开发安全有效的疫苗尤为重要。
[0004] 猪链球菌（Streptococcus suis, S. suis)是猪的重要病原菌之一，临床上常引起 急性型败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及淋巴结脓肿，可侵害各年龄段猪，病猪及带菌猪 是主要传染源，本病发生无季节性，多成地方流行性。链球菌抗原构造复杂，有核蛋白抗原 (P抗原），无群特异性，及群特异抗原（C抗原）和型特异抗原。根据荚膜多糖抗原（CPS)可 将链球菌分为35个血清型，即1型~34型和1/2型（同时含有1型和2型抗原的菌株）， 根据C抗原不同，可将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G等20个血清群。近年，猪链球菌病在我 国流行呈上升趋势，并与多种细菌性疾病呈混合感染，导致严重的后果。
[0005] 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)是猪传染 性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropnmonia，PCP)的病原菌，PCP是主要以肺出血、坏 死和纤维素性渗出为主要病变的高度接触性传染病。该病可感染各年龄段猪只，并引起急 性和慢性感染，发病率和死亡率20 %以上，急性型死亡率可高达80 % -100 %。APP血清型较 多，目前分离鉴定出了 15种血清型，根据APP生长是否需要NAD因子，可分为两个生物型， 依赖外援NAD因子生长的是生物I型，不依赖NAD因子生长的是生物II型。溶血毒素是APP 分泌到菌体细胞外的一个主要的毒力因子，被称为溶血毒素和细胞毒素，归入RTX(Itepeats in the structural toxin)毒素家族，因此 APP 的 RTX 毒素称为 Apx(Actinobacillur pleuropneumoniae-RTX-toxin)毒素，包括 Apx I、Apx II、Apx III、Apx IV。所有血清型 均能分泌Apx IV，只在体内表达，体外检测不到，大多数血清型只产生Apx I、Apx II、Apx III的两种，少数血清型只产生一种。目前，对该病的预防主要以致病血清型的全菌体灭活苗 为主，虽然PCP弱毒疫苗及ghost疫苗较灭活疫苗的免疫保护效果有一定程度的提高，但是 弱毒疫苗免疫原性较低，存在毒力返强的可能性，ghost疫苗存在菌体裂解不彻底等缺点。 如果开发亚单位疫苗则需要摸索适宜的抗原，进一步涉及菌种血清型的选择、抗原的提取 等诸多环节，还要考虑免疫效果和不良反应等技术问题。
[0006] 现有技术中，市场上的疫苗只有预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜 肺炎的单苗或二联苗，而这三种病通常呈混合感染或继发感染，使用单苗或二联苗需要多 次免疫，对猪应激较大，成本高。在开发联苗的技术实践中，首先应当确保抗原对各单一致 病菌的免疫作用，那么菌种血清型的选择尤为重要，同时，应当保证联苗整体对三种致病菌 均具有有效的免疫效果，且不会发生不良反应，此外，由于同时涉及不同类别的抗原，那么 抗原的提取、灭活以及疫苗的制备等方面均需要突出的创造性劳动才可能实现。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪用三联灭活疫苗的制备方法， 以解决现有技术中缺乏一种同时免疫副猪嗜血杆菌、猪链球菌以及猪传染性胸膜肺炎放线 杆菌的疫苗制备方法的技术问题。
[0008] 本发明解决的另一技术问题是通过对抗原的创新性选择，以提升疫苗对上述三种 致病菌的免疫效果。
[0009] 本发明解决的再一技术问题是通过对抗原的创新性选择，以避免疫苗发生不良反 应。
[0010] 本发明解决的又一技术问题是通过对工艺的创新设计，以提升上述方法的制备效 率。
[0011] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0012] -种猪用三联灭活疫苗的制备方法，该方法是以副猪嗜血杆菌4型菌体、副猪嗜 血杆菌5型菌体、猪链球菌2型菌体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx I、猪传染 性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx II、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素 Apx III为抗 原，经灭活后制备的。
[0013] 优选的，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx I是由猪传染性胸膜肺炎 放线杆菌3型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx II是由猪传染性胸膜肺炎 放线杆菌7型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素 Apx III是由猪传染性胸膜肺炎 放线杆菌10型提取得到的。
[0014] 进一步优选的，该方法包括以下步骤：
[0015] 1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7 型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；
[0016] 2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭 活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至200-400ug/mL，由此分别得到Apx I抗原溶液、Apx II抗原溶液和Apx III抗原溶液；
[0017] 3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培养 液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至IO 7~10 12CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血 杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；
[0018] 4)取步骤2)所述Apx I抗原溶液、Apx II抗原溶液、Apx III抗原溶液，取步骤3) 所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六 者以（1~2) : (1~2) : (1~2) : (1~2) : (1~2) : (1~2) (v/v)的比例均匀混合得到混 合抗原溶液；
[0019] 5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。
[0020] 优选的，步骤1)所述的培养液是通过以下方法得到的：取菌种接种于TSA/NAD平 板培养基中，35~38°C培养18~24小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，35~ 38°C培养12~16小时，为一级种子；取所述一级种子以0. 5~2% (v/v)的比例接种至 TSA/NAD培养基中，35~38°C培养12~16小时，得到二级种子；再取所述二级种子进行培 养，即得到所述培养液。
[0021] 优选的，步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的超滤管浓缩，而后加入饱和硫 酸铵取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩，而后再进行灭活，在此基础上 进一步优选的，加入饱和硫酸铵后溶液中硫酸铵浓度为55~60% (w/w)。
[0022] 优选的，步骤2)或步骤3)所述灭活是通过以下方法实现的：按溶液体积的 0. 25~0. 35%加入甲醛溶液，35~38°C灭活24~48小时，期间每隔2~3小时搅拌一次， 每次搅拌持续3~5分钟；更优的，灭活36小时。
[0023] 优选的，步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实现的。
[0024] 优选的，步骤3)所述浓缩是以0.45μπι孔径的滤膜实现的。
[0025] 优选的，步骤5)取頂S 1313VG疫苗佐剂与水以（2. 5~3. 5) : 7体积比混合，加入 维生素 Ε，调整佐剂浓度至9~Ilmg/mL，再过滤除菌，得到稀释液，利用所述稀释液用于抗 原稀释。
[0026] 在以上技术方案中，所述"经灭活后制备"中的"制备"是指利用所述抗原以疫苗技 术领域的公知制备方