新型acyw135群脑膜炎球菌结合疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫技术领域，具体的涉及一种多价脑膜炎球菌结合疫苗及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 由脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm)感染所致的流行性脑脊髓膜炎 (流脑），是一种世界范围内发病的急性呼吸道传染病，根据Nm荚膜多糖构成的不同，可将 其分成13个血清群，且所有血清群均可致病，其中尤以六4、(：、￥、1135群所致疾病为主，约 占 Nm疾病的95 %以上，且可引起爆发和流行。
[0003] 疫苗接种是预防流脑疾病既经济又有效的途径。世界各国根据各自流脑疾病菌 群致病特点，开发了不同种类和不同组合的脑膜炎球菌疫苗，其中包括荚膜多糖疫苗：A 群、C群、AC群、ACYW135群及由破伤风类毒素（TT)或白喉类毒素（DT)、白喉无毒变异株 (CRM197)为载体蛋白的多糖-蛋白结合疫苗有：A群、C群、AC群、ACYW135群。B群脑膜炎 球菌疫苗有：古巴Finlay研究所生产的VA-MENG0C-BC疫苗，含B群OMV，C群CPS (荚膜多 糖），AL(OH)3佐剂，及诺华4C Men B(Bexsero)疫苗，含有fHbp I型蛋白，Nad A蛋白和 NHBA蛋白，后又加入新西兰B群OMV疫苗（MeNZB)组成。
[0004]目前，国际、国内研究及已上市的各种组合的脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗，所 用载体蛋白分别有CRM197 (无毒白喉变异株类毒素 ）、TT (破伤风类毒素 ）、DT (白喉类毒 素）。这些蛋白载体虽也能刺激机体产生相应的抗体，但这些抗体与脑膜炎球菌疾病的预防 无关，仅具有载体效应。并且，TT和DT是由各自细菌毒素经甲醛或戊二醛脱毒而来的，在 百白破三联疫苗的应用中为规避出现毒性逆转，需要加入微量甲醛或戊二醛来维持其脱毒 效果的稳定性。但是，在以TT或DT为蛋白载体的结合疫苗中是不加甲醛或戊二醛的，因而 存在着蛋白载体"毒性逆转"的风险。并且，破伤风毒素是高致敏原性物质，难免存在着因 脱毒不彻底而致的破伤风类毒素（TT)，白喉类毒素（DT)为载体蛋白的多糖-蛋白结合疫苗 接种的包括"过敏反应"等的安全隐患。
[0005] 当使用单一载体蛋白的多价多糖结合疫苗接种时，难免会引起接种机体抗原位点 竞争现象，因接种机体的同一种载体特异性T细胞数量是有限的，因此在单一载体的多种 多糖结合物间会产生竞争性抑制，而某些抗原找不到相应结合位点，使得免疫效果下降。这 种现象称为"抗原位点竞争"。文献报导，TT引起的表位抑制现象更明显。
[0006] 另外，由于多价多糖一蛋白结合疫苗仅用一种载体蛋白，由于载体蛋白太单一，造 成每次接种时载体蛋白的接种剂量太大，因而导致接种机体针对载体蛋白大量及多次重复 接种后的免疫耐受，影响其结合到载体蛋白上的多糖的免疫原性，致使免疫应答下降。这种 现象称为"免疫耐受"。已引起国内、外学者的高度关注和重视。
[0007] 因此，有必要开发一种有效预防A、C、Y和W135群脑膜炎球菌感染性疾病的疫苗。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一个目的在于规避由TT或DT为蛋白载体结合疫苗而引起的毒性逆 转、过敏反应等不安全风险，同时克服由单一载体蛋白制备多价多糖结合疫苗所致的抗原 位点竞争、免疫耐受影响免疫效果的缺陷，提供一种有效预防A、C、Y、W135群脑膜炎球菌感 染性疾病的疫苗。本发明的第二个目的在于提供一套以二株不同血清型B群外膜蛋白为载 体的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗规模化生产工艺，实现产业化生产方案。
[0009] 为达到本发明的第一个目的，本发明提供了一种ACYW135群脑膜炎球菌结合疫 苗，具体的，所述疫苗为4价结合疫苗，含有A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖分别与 B群血清型4型和15型外膜囊蛋白中的一种外膜囊蛋白偶联获得的多糖-蛋白偶联物。
[0010] 可选的，在所述疫苗中，A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖中的两种荚膜多 糖分别与B群血清型4型外膜囊蛋白共价偶联形成以B群血清型4型外膜囊蛋白为载体的 两种多糖-蛋白偶联物，另外两种荚膜多糖分别与B群血清型15型外膜囊蛋白偶联形成以 B群血清型15型外膜囊蛋白为载体的另外两种多糖-蛋白偶联物。
[0011] 例如，在本发明的一种实施方式中，A和C群脑膜炎球菌的荚膜多糖分别与B群血 清型4型外膜囊蛋白共价偶联形成以B群血清型4型外膜囊蛋白为载体的两种多糖-蛋白 偶联物，另外两种荚膜多糖，即Y和W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖分别与B群血清型15型 外膜囊蛋白偶联形成以B群血清型15型外膜囊蛋白为载体的两种多糖-蛋白偶联物。以 上共获得四种多糖-蛋白偶联物，将这四种多糖-蛋白偶联物混合后获得本发明所述的4 价结合疫苗。
[0012] 在本发明中，所述B群脑膜炎球菌包括按照不同分型方法划分的不同亚型、基因 型、克隆群和来自于不同地区的优势致病菌株。
[0013] 在本发明中，所述疫苗的生产菌株来源于CMCC，但不限于其他来源的同一血清群 和不同血清型菌株。
[0014] 可选的，A群脑膜炎球菌的荚膜多糖来自菌株CMCC29201 ;
[0015] C群脑膜炎球菌的荚膜多糖来自菌株CMCC29205 ;
[0016] Y群脑膜炎球菌的荚膜多糖来自菌株CMCC29028 ;
[0017] W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖来自菌株CMCC29037 ;
[0018] B群血清型4型脑膜炎球菌的外膜蛋白来自菌株CMCC29356 ;
[0019] B群血清型15型脑膜炎球菌的外膜蛋白来自菌株CMCC29361。
[0020] 在本发明的脑膜炎球菌结合疫苗中，所述疫苗中游离多糖的含量< 15,游离蛋白 的含量< 3% ;所述疫苗免疫动物后，血清抗体阳转率多90%。
[0021] 可选的，每种荚膜多糖在所述脑膜炎球菌结合疫苗的每剂免疫剂量中各有 4-20 μ g/mL〇
[0022] 可选的，（1)所述疫苗为液体剂型时，任选含或不含铝佐剂；不含铝佐剂时稀释液 为缓冲生理盐水；含铝佐剂时，所述铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝；
[0023] (2)所述疫苗为冻干剂型时，任选含有的赋形剂包括乳糖、蔗糖、明胶、山梨醇或人 血白蛋白。
[0024] 可选的，所述疫苗为冻干剂型，用于稀释疫苗的稀释液是缓冲生理盐水、生理盐 水；或者所述稀释液为含有铝佐剂的缓冲液或生理盐水，其中，每毫升稀释液中铝含量为 0. 2-1. Omg0
[0025] 为达到本发明的第二个目的，本发明提供了所述脑膜炎球菌结合疫苗的制备方 法，其中，A群、C群、Y群、W135群荚膜多糖的制备包括以下步骤：
[0026] (1)分别对A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌菌株进行种子扩增培养，并连续传 代至第4或第5代进行发酵罐培养，甲醛杀菌，离心收获培养上清液，加入十六烷基三甲基 溴化铵，离心收集复合多糖，以氯化钠或氯化钙解聚复合多糖，分步乙醇沉淀，收获粗制多 糖；
[0027] (2)以中性醋酸钠溶液溶解粗制多糖，再以冷酚抽提或离子交换层析和分子筛层 析，收获精制多糖，除菌过滤，获得符合质量标准要求的多糖原液。
[0028] 可选的，B群血清型外膜蛋白的制备包括以下步骤：
[0029] (1)分别对B群血清型4型、15型脑膜炎球菌菌株进行种子扩增培养，并连续传代 至第4或第5代进行发酵罐培养，待细菌生长至对数生长期后期或静止期前期，终止培养， 离心收获菌体；
[0030] (2)外膜囊蛋白溶出：用生理盐水或pH6_8. 8的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤并离心 收获菌体，向菌体中加入0. 5-1. 5M NaCl溶液或0. 1-0. 5M氯化锂-醋酸钠提取液溶出外膜 囊蛋白，离心收集上清液；
[0031] (3)外膜囊蛋白纯化：将步骤（2)的上清液用冷乙醇分步沉淀，离心收集沉淀，用 注射用水复溶后，加硫酸铵分步沉淀，注射用水溶解后加脱氧胆酸钠解聚，超滤收集浓缩 液，用三氯醋酸沉淀，离心收集沉淀，注射用水溶解后超滤浓缩，并依次进行离子交换层析， 疏水层析，分子筛层析，收集样品，除菌过滤，取样检定，符合质量要求的为合格外膜囊蛋白 原液，置2-8 °C保存或冷冻干燥保存。
[0032] (4)步骤（3)的技术参数具体为：向步骤（2)的上清液中加入冷乙醇至终浓度为 55-75% ;离心收沉淀，注射用水复溶后，加硫酸铵至终浓度为15-65%进行分步沉淀，分别 收获上清或沉淀物，沉淀物复溶后加入脱氧胆酸钠至终浓度〇. 2-1. 0 %，振荡后进行超滤， 收集浓缩液，加入三氯醋酸至终浓度〇. 2-3. 0 %，离心收集沉淀，注射用水溶解，超滤，然后 依次进行离子交换层析，疏水层析和分子筛层析，收集样品。
[0033] 可选的，所述方法包括将四种多糖-蛋白偶联原液混合获得4价结合疫苗，其中多 糖-蛋白偶联原液的制备包括以下步骤：
[0034] 分别量取脑膜炎球菌多糖，经CNBr活化后，再在活化糖链上连接ADH，形成荚膜多 糖-ADH衍生物，超滤去除游离的CNBr和ADH后，加入B群血清型0MV，混合均匀，经加入的 EDAC缩合作用，在ADH的桥联作用下形成共价结合的多糖-蛋白偶联物，超滤去除残余的 EDAC等小分子物质并浓缩体积，经分子筛层析，收集高分子量多糖-蛋白偶联物。
[0035] 本发明所提供的脑膜炎球菌结合疫苗有效规避了由单一载体蛋白制备多价疫苗 存在的免疫耐受和抗原位点竞争所致的影响疫苗免疫应答的风险，及以TT、DT为载体蛋白 制备结合疫苗存在的过敏反应和毒性逆转等的安全性风险，并能够增进A群免疫作用，提 供较广泛范围的针对B群有保护作用的杀菌抗体。同时提供了完整的ACYW135群脑膜炎球 菌结合疫苗生产工艺，并能适应规模化生产。研究表明，本疫苗具有良好的免疫原性及可靠 的安全性及稳定的免疫持久性。
[0036] 本发明具有以下优点：
[0037] 1、以二株B群不同血清型OMV为载体蛋白制备的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗 显示了良好的载体效应和更好的免疫应答。与TT、DT为载体蛋白的各血清群偶联物的多糖 回收率比较，OMV载体偶联物回收率更高，尤其是C群、W135群的回收率更高，具有统计学差 异。
[0038] 2、动物免疫原性抗体效价，OMV载体偶联物的二针次免疫效价相等于