脑膜炎球菌偶联疫苗的制作方法

专利名称：：脑膜炎球菌偶联疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及针对脑膜炎奈瑟球菌(A^^eWame"/"g"/^y)的疫苗。具体地说，本发明涉及基于偶联的(conjugated)多种脑膜炎球菌血清群的荚膜糖的疫苗。
背景技术：
：基于生物的荚膜多糖，已经鉴定到12种脑膜炎奈瑟球菌(Wme"/"g/^fo)血清群(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。血清群A是非洲萨哈拉以南地区流行性疾病最常见的病原体。血清群B和C引起美国和大多数发达国家的大多数病例。血清群W135和Y引起美国和发达国家的其它病例。多年前就已经知道由血清群A、C、Y和W135的荚膜多糖制成的四价疫苗[1，2]。尽管这种疫苗对于青少年和承认有效，但由于多糖是不依赖于T细胞的抗原，其诱导的弱免疫应答不能加强，因此它诱导的免疫应答弱、保护时间短，不能用于婴儿[例如参考文献3]。这种疫苗中的多糖不是偶联的[4]。血清群C的偶联疫苗已批准用于人类，其中包括Menjugate[5]、Meningitec和NeisVac-CTM。血清群A+C的偶联物(conjugate)的混合物是已知的[6-8]，且血清群A+C+W135+Y的偶联物的混合物也已经报道[9-13]。尽管脑膜炎球菌偶联物是熟知的，但它们还不适用于儿科免疫接种计划，发达国家的儿科免疫接种计划通常包括出生时接种乙肝疫苗；从2个月时开始接种白喉/破伤风/百日咳(D-T-P)疫苗、b型流感嗜血杆菌(/Z./My7"enzaetypeb)(Hib)偶联物、灭活的脊髓灰质炎病毒和肺炎球菌偶联物。然而，当将偶联的疫苗加入现有免疫接种计划时，必需解决载体诱导的表位抑制(或者通常称为"载体抑制")，尤其是载体初免(priming)造成的抑制。"载体抑制"是一种由于用载体蛋白预先免疫动物从而阻止随后引起针对该载体上呈递的新抗原表位的免疫应答而造成的现象[M]。如参考文献15所述，一些疫苗抗原含有相同的蛋白质组分(用作免疫原和/或用作偶联物中的载体蛋白)，因此那些抗原之间可能会发生干扰。在参考文献15中，报道了对偶联破伤风类毒素(Tt)载体的某抗原的免疫应答受到先前存在的对Tt的免疫力的抑制。参考文献16报道了D-T-P疫苗与Hib偶联疫苗的组合有何不利影响，因为Hib偶联物的载体与D-T-P疫苗的破伤风抗原是相同的。作者总结出，当引入包含多种偶联物的疫苗时应考虑这种由于通用蛋白质载体的干扰而造成的"载体抑制"现象。与参考文献15和16不同，参考文献17报道了用破伤风类毒素初免不会对针对随后给予的Hib-Tt偶联物的免疫应答造成负面影响，但在带有从母体获得的抗-Tt抗体的患者中观察到抑制现象。然而在参考文献18中报道了由于接种破伤风疫苗而已经具有抗-Tt抗体的患者中的基于Tt的肽偶联物的"表位抑制"效应。在参考文献19中提到，以CRM197(白喉毒素的一种解毒突变体)作为载体的偶联物对于之前未接受白喉毒素作为疫苗一部分(例如作为D-T-P或D-T疫苗的一部分)的儿童可能无效。参考文献20继续了该工作，在随后用Hib偶联物免疫时继续观察到D-T免疫接种造成的载体初免效应。在参考文献21中，作者发现用白喉或破伤风类毒素载体蛋白预先免疫降低了随后用与那些载体偶联的Hib荚膜糖免疫接种后抗-Hib抗体水平的升高，但对IgGl和IgG2的影响照旧。对偶联物载体部分的反应也被抑制。此外，观察到更加常见的非表位特异性抑制，即用一种偶联物预先免疫似乎会影响针对4周后给予的第二种偶联物的载体和糖部分的免疫应答。参考文献22报道了在一种多价肺炎球菌偶联疫苗中采用不同载体蛋白，其中采用多种载体是为了避免载体抑制。作者预测，多价偶联疫苗中的最大载体蛋白负荷可使机体产生耐受而不会引起负面干扰。参考文献23报道，含有混合载体蛋白的肺炎球菌偶联疫苗在引起抗-肺炎球菌应答反应的同时也不经意地增强了对载体的应答反应。参考文献24研究了是否可与单价脑膜炎球菌血清群C偶联物一起给予白喉和破伤风(类毒素)加强免疫，发现当载体是破伤风类毒素载体且患者之前已用含破伤风类毒素的疫苗免疫过时，产生的对脑膜炎球菌偶联物的效价降低。最后，参考文献25报道称，"之前接触载体蛋白能增强或抑制抗体对以糖-蛋白质偶联物形式给予的多糖的反应"。参考文献25所用的偶联物采用破伤风类毒素或CRM197突变体作为载体蛋白。与载体初免和/或抑制有关的情况使人非常困惑，还不清楚任何具体的偶联物是否将受到载体抑制的影响或将受益于载体初免而增强。除非这一问题得到解决，否则脑膜炎球菌偶联疫苗将不会被纳入或加入现有儿童免疫计划中。此外，由于给予的脑膜炎球菌偶联物为四价混合物(即四种不同偶联物)，因此载体抑制的可能性更加危险。除了载体初免对糖类偶联物的免疫应答有负面影响问题外，也可能发生相反的情况，即用偶联物免疫接种可能会对载体的免疫应答产生负面影响[26]。
发明内容参考文献27提到，用一种以上类型的载体蛋白应该可以解决脑膜炎球菌偶联疫苗的载体抑制问题。具体地说，参考文献27提到，流感嗜血杆菌蛋白D应用作脑膜炎球菌偶联物的载体蛋白，同时也可使用破伤风类毒素(Tt)。为避免表位抑制，蛋白D也是参考文献28的备选载体。类似地，参考文献29提到，百日咳杆菌(^^^&/&pw化^的的菌毛应用作载体以避免多价偶联疫苗的载体抑制。相反，本发明采用破伤风类毒素(Tt)作为混合的脑膜炎球菌糖类偶联物的载体。此外，参考文献27还建议应与D-T-P-Hib疫苗同时给予脑膜炎球菌偶联疫苗(例如见实施例3)，从而就没有先接触脑膜炎球菌偶联物的载体蛋白的问题。相反，现在已经发现，即便患者已经接受载体蛋白，其形式为之前的免疫原(例如在D-T-P或D-T免疫接种中)或之前的载体蛋白(例如在Hib偶联物或肺炎球菌偶联疫苗中)，仍旧可以给予该患者脑膜炎球菌偶联物。之前对单价血清群C偶联疫苗进行的载体诱导的表位抑制研究[24]不关心任何之前给予的偶联物的影响。如同与参考文献27相反的那样，即使患者已接受了不同的偶联物，仍能产生对脑膜炎球菌偶联物的免疫应答，这与参考文献21相反。因此，本发明提供了一种免疫患者以抵抗脑膜炎奈瑟球菌造成的疾病的方法，该方法包括给予所述患者一种含有(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物;(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；以及(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物，其中，所述患者己经用(a)和/或(b)预先免疫过(a)破伤风类毒素；(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌外的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物。本发明还提供了(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种物质在制造用于免疫人类患者以抵抗脑膜炎奈瑟球菌造成的疾病的药物中的的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；以及(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物，其中，所述患者已经用(a)和/或(b)预先免疫过(a)破伤风类毒素；(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌外的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物。脑膜炎球菌引起的疾病通常是脑膜炎，更通常是细菌性脑膜炎，最通常是脑膜炎球菌性脑膜炎。因此，本发明可用于保护抵抗造成脑膜炎的脑膜炎球菌感染。縱^度舰薪孝要免疫的患者已经用(a)和/或(b)预先免疫过(a)破伤风类毒素；(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌外的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物。典型的预先免疫将通常包括破伤风类毒素抗原；采用破伤风类毒素载体的Hib荚膜糖偶联物；和/或采用破伤风类毒素载体的肺炎球菌荚膜糖偶联物。患者将已经接受至少1次(例如1、2、3次或更多次)剂量的预先免疫抗原，且该剂量(或多次剂量中最早的一次)已在用本发明的脑膜炎球菌偶联物免疫前至少6(例如6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、120、180、240、300或更多)个月时给予。在优选的患者组中，预先免疫在出生后3年内进行，例如在出生后2年内、出生后1年内、出生后6个月内、或者甚至出生后3个月内、2个月内或1个月内。要用本发明免疫的患者通常是人。人的年龄通常为至少1个月，例如至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少6个月、至少2岁、至少5岁、至少11岁、至少17岁、至少40岁、至少55岁，等等，患者宜为至少6个月大。另一组优选的患者年龄为2-55岁，另一组优选的患者年龄为11-55岁。再一组优选的患者年龄为小于11岁，例如2-ll岁。然而在所有情况中，无论年龄如何，患者将已经如上所述预先免疫过。患者将通常已经接受过破伤风类毒素，如D-T-P或D-T预先免疫接种中的'T，抗原。这种免疫接种通常被给予2、3和4个月的新生儿。当免疫接种包括百日咳疫苗时，该疫苗可以是全细胞或细胞百日咳疫苗("Pw")，但优选非细胞百日咳疫苗("Pa")。预先免疫接种Pa疫苗将通常包括l、2或3种以下熟知并充分表征的百曰咳杆菌(5./7eWw^W抗原(1)百日咳类毒素('PT')，通过化学方法或通过定点诱变解毒，如'9K/129G，突变体[30];(2)丝状血凝素('FHA，);(3)黏附素(pertactin)(也称为'69kDa外膜蛋白')。非细胞百日咳疫苗也可包含凝集原2和/或凝集原3。D-T-P预先免疫接种中的'D'抗原通常是白喉类毒素。患者也可接受或者已经接受破伤风类毒素作为蛋白质-糖类偶联物的载体蛋白。这种偶联物包括'PRP-T，Hib偶联物[见参考文献31的表14-7]，例如ActHffiTM、OmniHIBTM和HIBERIXTM产品。患者也可己经用血清群C脑膜炎球菌('MenC，)偶联物预先免疫过。采用破伤风类毒素载体的MenC偶联物包括NeisVac-CTM产品。然而优选用Hib和/或肺炎球菌偶联物而不用MenC偶联物预先免疫患者。如果已用MenC偶联物预先免疫患者，则根据本发明给予的疫苗可以包含或不含血清群C偶联物。当用偶联的抗原预先免疫时，由于偶联物有低水平污染(例如偶联物在储藏期间发生水解)，患者将不可避免地也接受少量游离的破伤风类毒素，当这种较小的量通常不足以提供显著的免疫应答。破伤风类毒素是一种熟知并充分表征的蛋白质[例如见参考文献31的第13章]，可通过将破伤风梭菌(C/o^W騰Wam')产生的内肽酶('破伤风毒素，)灭活得到。可对这种毒素进行处理以得到不再具有毒性但保留了抗原性因此能够在注射后刺激产生特定的抗-毒素抗体的类毒素。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制得的。可使破伤风梭菌(Cfe似m')在生长培养基(例如衍生自牛酪蛋白的Latham培养基)中生长，然后通过甲醛处理、超滤和沉淀以获得破伤风类毒素。然后用包括无菌过滤和/或透析的方法处理该材料。术语'破伤风类毒素'在文中包括保留了与破伤风毒素的免疫交叉反应性的破伤风类毒素的衍生物。预先免疫的结果为，患者的免疫系统已经接触过预先免疫抗原。这通常意味着患者的抗-Tt抗体反应将升高(抗-Tt效价通常将大于0.01IU/ml)并将产生特异于Tt的记忆B细胞和/或T淋巴细胞，即预先免疫通常足以在患者中引起记忆性抗-Tt免疫应答。当用Tt作为偶联物中糖类的载体进行预先免疫时，预先免疫将提高抗-糖类反应，同时患者将产生特异于糖类的记忆B细胞和/或T淋巴细胞，即预先免疫通常足以在患者中引起记忆性抗-糖类免疫应答。预先免疫宜足以在患者中引起例如分别针对破伤风或针对含有糖类的生物的保护性免疫力。因此，要按照本发明免疫的患者将不同于普通患者，他们属于一小类免疫系统中已产生对预先免疫抗原的免疫应答的普通人群中的一元，因此，按照本发明用含有破伤风类毒素载体的脑膜炎球菌偶联物免疫接种将在这一小类人群中产生与之前未产生对预先免疫抗原的免疫应答的患者不同的免疫应答。优选用Tt作为偶联物(尤其是Hib偶联物)的载体预先免疫患者。特别优选用Tt作为偶联物的载体同时以Tt作为未偶联的免疫原预先免疫患者。除了可以用偶联或非偶联形式的破伤风类毒素预先免疫，患者也可用其它抗原预先免疫。这种抗原包括但不限于百日咳抗原一见上文；白喉类毒素一见上文；B型流感嗜血杆菌(//aemo;7/^//M/"y7Me"zaetypeB)—见上文；乙肝表面抗原(HBsAg);脊髓灰质炎病毒，如灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV);肺炎链球菌(5^印tococc^;"ewmom'fle)—见上文；流感病毒；BCG;甲肝病毒抗原；麻疹病毒；腮腺炎病毒；风疹病毒；水痘病毒；等等。患者可以用或不用一种或多种脑膜炎球菌偶联物预先免疫。在一些优选的实施方案中，当患者第一次接受脑膜炎球菌偶联物时，他们已经用Tt预先免疫过。在其它实施方案中，脑膜炎球菌偶联物被给予已经用(i)Tt和(ii)脑膜炎球菌偶联物预先免疫过的患者。錄微本发明用偶联的糖类免疫患者。偶联被用来增强糖类的免疫原性，因为偶联可以将不依赖于T细胞的抗原转变成依赖于T细胞的抗原，从而使初免后产生免疫记忆力。偶联尤其适用于儿科疫苗[例如参考文献32]并且是一种熟知的技术[例如见参考文献33-41]。用于本发明的组合物含有至少两种脑膜炎球菌偶联物，其中所述各偶联物含有破伤风类毒素(或其衍生物)载体蛋白以及荚膜糖。所述荚膜糖选自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y，从而该组合物包含2种、3种或所有4种血清群的糖类。具体的组合物包含来自以下血清群的糖类血清群A和C;血清群A和W135;血清群A和Y;血清群C和W135;血清群C和Y;血清群W135和Y;血清群A和C和W135;血清群A和C和Y;血清群A和W135和Y;血清群C和W135和Y;血清群A和C和W135和Y。最优选含有所有4种血清群的糖类的组合物。这4种血清群中每一种的荚膜糖已经充分表征。血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖是(al—6)-连接的N-乙酰-D-甘露糖胺-l-磷酸的均聚物，在C3和C4位有部分被O-乙酰化。乙酰基可用封闭基团取代以防止水解[42]，且这种修饰的糖类仍旧是本发明意义内的血清群A糖类。血清群C荚膜糖是(a2—9)-连接的唾液酸(N-乙酰神经氨酸或'NeuNAc')的均聚物。大多数血清群C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8上有a乙酰基，但约15%的临床分离物缺乏这些0-乙酰基[43,44]。这种糖的结构被写成—9)-NeupNAc7/8OAc-(a2—。血清群W135糖类是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。与血清群C糖类一样，它具有可变的O-乙酰化作用，但乙酰化出现在唾液酸的7和9位上[45]。其结构可写成一4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Gal-a-(l—。血清群Y的糖类似于血清群W135的糖，但二糖重复单元含有葡萄糖而不是半乳糖。与血清群W135—样，它在唾液酸的7和9位具有可变的0-乙酰化作用[45]。血清群Y糖类的结构可写成一4)-D-Neu;5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Glc-a-(l—。用于本发明的糖类可以是上述O-乙酰化的糖(例如与天然荚膜糖具有相同的O-乙酰化模式)，或者它们可以在糖环的一个或多个位置被部分或完全脱-O-乙酰化，或者它们可以相对于天然荚膜糖被超-O-乙酰化。用于本发明的糖类优选短于在细菌中发现的天然荚膜糖。因此糖类优选被解聚，且解聚发生在纯化之后偶联之前。解聚降低了糖类的链长。优选的解聚方法包括使用过氧化氢[9]。将过氧化氢加入糖中(例如使H202的最终浓度为1%)，然后孵育混合物(例如在约55"C)直到链长度达到所需的縮短。另一种解聚方法涉及酸水解[IO]。其它解聚方法是精通本领域的技术人员已知的。用来制备用于本发明的偶联物的糖类可用这些解聚方法中的任何一种获得。解聚可用来提供最佳链长以得到最佳免疫原性和/或用来縮短链长以在物理上便于处理糖类。用于偶联物的典型的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉毒素(或其CRM197突变体)和破伤风毒素。其它载体多肽包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、合成肽、热激蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白、流感嗜血杆菌的D蛋白、肺炎球菌表面蛋白PspA、铁摄取蛋白、艰难梭菌(C.^^c&)的毒素A或B等。然而根据本发明，脑膜炎球菌偶联物包含破伤风类毒素载体蛋白。优选共价偶联。组合物中可采用一种以上的载体蛋白。因此不同的载体蛋白可用于不同的血清群，例如血清群A的糖类可偶联到Tt，而血清群C的糖类可偶联到Dt。特定的糖类抗原也可采用一种以上的载体蛋白，例如血清群A的糖类可采用两种，其中一些偶联到Tt而其余的偶联到Dt。然而通常，组合物中的所有脑膜炎球菌糖类优选采用相同的载体蛋白，更优选所有的糖类(即包括可能存在的任何非-脑膜炎球菌偶联物)都采用相同的载体蛋白。优选本发明的组合物不含任何白喉类毒素载体蛋白。一个载体蛋白可携带一种以上的糖类抗原[46]。例如，一个载体蛋白可偶联到来自血清群A和C的糖类。为实现该目的，在偶联反应之前可将糖类混合。然而通常优选各血清群有单独的偶联物。优选将各偶联物以基本上1:1:1:1的比例混合(以糖类质量测量)，例如，各血清群糖类之间的质量差异在±10%之内。组合物中各血清群的脑膜炎球菌抗原的典型含量为l-20)ig，例如各血清群2-10pg，或约4ng。除了1:1:1:1的比例，血清群A的剂量也可以加倍(2:1丄1)。偶联物中糖类:蛋白质的比例(w/w)在1:15(即蛋白质过量)和15:1(即糖类过量)之间，优选在1:10和10:1之间，更优选在1:5和5:1之间。优选载体蛋白过量。优选糖类:蛋白质之比约为1:12或约1:6或约1:3的偶联物。偶联物可与游离载体蛋白联合使用[47]。然而，当特定载体蛋白以游离形式或偶联形式出现在本发明的组合物中时，未偶联的形式优选不超过组合物中载体蛋白总量的5%，更优选不超过2%重量。类似地，未偶联的糖类优选不超过糖类总重量的15%。可采用任何合适的偶联反应，需要时可采用任何合适的接头。偶联之前糖类通常应活化或功能化。活化可以涉及，例如氰化试剂，如CDAP(例如1-氰基-4-二甲基氨基吡啶镓四氟硼酸盐)[48、49等]。其他合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU(也可参见参考文献39的介绍)。可采用任何已知方法，例如参考文献50和51中所描述的方法经接头基团进行连接。一种类型的连接涉及多糖的还原氨化，获得的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，随后将己二酸接头基团的另一端与一种蛋白质偶联[37、52、53]。其他接头包括B-丙酰胺[54]、硝基苯-乙胺[55]、卤酰基卤(haloacylhalide)[56]、糖苷接头[57]、6-氨基己酸[58]、ADH[59]、C4到。12部分[60]等等。作为使用接头的另一种选择，可以采用直接连接。与蛋白质的直接连接可以包括氧化多糖，随后与该蛋白进行还原氨化，例如参考文献61和62所述。优选的方法包括在糖类中引入氨基基团(例如通过用-NH2取代末端二0基团)，随后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生化并与载体蛋白反应。在一种优选的偶联方法中，使糖类与己二酸二酰肼反应。对于血清群A，在该阶段也可加入碳二亚胺。反应之后加入氰基硼氢化钠。然后例如通过超滤制备衍生的糖类。然后将衍生的糖类与载体蛋白(例如与破伤风类毒素)混合并加入碳二亚胺。反应之后可回收偶联物。这种偶联方法其它细节可见参考文献10。可通过这种方法获得的偶联物是优选用于本发明的偶联物，例如含有破伤风类毒素载体和己二酸接头的偶联物。优选单独制备偶联物然后再混合。混合之后，可用例如无菌无热原的磷酸缓冲的生理盐水调节混合的偶联物的浓度。混合前，各偶联物优选含有不超过15)lg载体。给予本发明的脑膜炎球菌偶联物的结果优选为，对于给予的各种血清群，患者的血清杀菌抗体(SBA)反应增强，同时SBA效价升高(与预先免疫过的患者接受混合的脑膜炎球菌偶联物之前相比)至少4倍，优选至少8倍。SBA检验是确定脑膜炎球菌保护作用的标准相关数(correlate)。有关脑膜炎球菌疫苗血清学相关数的其它细节见参考文献63。^f本发欲游资^激游真&拔嚴遂分除了脑膜炎球菌偶联物，用于本发明的组合物可任选含有1、2或3种以下其它抗原1.偶联的肺炎链球菌(S./7"ewwom'ae)的荚膜糖[例如参考文献31的第23章；参考文献64-66]。优选包含肺炎链球菌(S.;wewmom'^)多种血清型的糖类。例如，广泛使用23种不同血清型的多糖混合物，诸如使用5到11种不同血清型多糖的偶联疫苗[67]。例如，PrevNarTM[68]包含7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，每种糖类通过还原氨化与CRM197偶联，每0.5毫升剂量含2ng各种糖类(4(ig的血清型6B)，偶联物吸附在磷酸铝佐剂上。当用于本发明的组合物含有肺炎球菌偶联物时，该组合物优选至少包括血清型6B、14、19F和23F。2.偶联的B型流感嗜血杆菌的荚膜糖[例如参考文献31的第14章]。偶联物的载体蛋白可以是破伤风类毒素、CRM197、Dt或脑膜炎奈瑟球菌的外膜复合物。偶联物的糖类部分可以是多糖(例如全长的磷酸聚核糖基核糖醇(PRP))，但优选解聚荚膜多糖以形成寡糖(例如分子量约l-5kDa)。一种优选的Hib偶联物包括经己二酸接头与CRM197或Tt共价连接的寡糖[69、70]。给予Hib抗原优选导致抗-PRP抗体浓度大于0.15ng/ml，更优选大于l|ig/ml。当组合物含有Hib糖类抗原时则优选不再含有氢氧化铝佐剂。如果组合物含有磷酸铝佐剂则Hib抗原可被佐剂吸附[71]，或可不被吸附[27]。在混合抗原/佐剂时选择正确的pH、选择具有合适零电荷点的佐剂以及选择在组合物中加入各种不同抗原的合适顺序可以防止吸附[72]。3.脑膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白质抗原[例如参考文献73]。所述组合物可含有一种或多种这些其它抗原。这些抗原可以吸附或不吸附到铝盐上。如果以一系列剂量给予脑膜炎球菌偶联物，则这些剂量中没有一种、有一些或全部含有这些这些额外抗原。含有脑膜炎球菌偶联物的组合物优选不含白喉类毒素。它们优选不含百日咳抗原。它们优选不含乙肝病毒表面抗原。它们优选不含脊髓灰质炎病毒。组合物优选含有每种脑膜炎球菌偶联物不超过50pg破伤风类毒素，且更优选对于所有组合的脑膜炎球菌偶联物不超过50昭破伤风类毒素。资微，用于本发明的组合物将通常含有药学上可接受的载体。这种载体包括任何本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的载体。合适的载体可以是诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚合体(如油滴或脂质体)等通常较大的、缓慢代谢的大分子。这种载体是本领域普通技术人员熟知的。所述疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外也可存在诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等辅助物质。典型的载体是无菌无热原的磷酸缓冲的生理盐水。药学上可接受的载体及赋形剂的全面论述参见参考文献74。用于本发明的组合物可含有抗菌剂，尤其是如果包装成多剂量形式。用于本发明的组合物可含有吐温类(聚山梨醇酯)去污剂，如吐温80。去污剂通常以低水平存在，例如<0.01%。用于本发明的组合物可含有钠盐(例如氯化钠和/或磷酸钠)。钠盐可用于调节张力。NaCl的浓度为10±2mg/ml，例如约8.8mg/ml。磷酸钠的浓度通常为1.2mg/ml。用于本发明的组合物将通常含有缓冲剂，如磷酸缓冲液。用于本发明的组合物可含有糖醇(例如甘露醇)或二糖(例如蔗糖或海藻糖)，例如约15-30mg/ml(例如25mg/ml)，尤其是如果要将它们冻干或者如果它们含有已经从冻干材料重建的材料时。然而优选的组合物不是冻干的，即所有脑膜炎球菌偶联物从包装阶段到给药阶段都以液体形式存在。组合物将通常直接给予患者。直接递送可以经胃肠外注射实现(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙注射)，或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜给药实现。优选大腿或上臂肌内给药。注射可以通过注射针(例如皮下注射用针)，但或者可使用无针注射。典型的肌内注射剂量是0.5ml。来自多种血清群的脑膜炎球菌偶联物可混合成一种组合物给予。该组合物可以单剂量给予，或者可在多剂量方案中分一次以上给予。多次剂量可用于初次免疫接种方案和/或强化免疫接种方案。初次免疫之后可用脑膜炎球菌偶联物加强免疫。可根据惯例确定初免剂量之间的时间间隔(例如4-16周)以及初免和加强免疫之间的时间间隔。通常可与其它疫苗同时给予偶联物，如与D-T-P疫苗同时给予，或者与肺炎球菌偶联疫苗同时给予，或者与流感疫苗同时给予，或者与MMR或MMRV疫苗同时给予。这些疫苗通常是单独给予的，但在同一次就医时给予。细菌感染影响身体的各个部位，因此本发明组合物可以各种形式制备。例如，该组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬浮液。也可制备成适于在注射前溶解或悬浮在液体运载体中的固体形式(例如冻干的组合物)。该组合物可以制备为局部给药，例如乳膏、油膏或粉末的形式。该组合物可以制备为口服给药，例如药片、胶囊或糖浆(任选进行调味)的形式。该组合物可以制备为肺部给药，例如使用细微粉末或喷雾的吸入器的形式。该组合物可以制备为栓剂或阴道栓剂。该组合物可以为鼻、耳或眼睛给药而制备成例如喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[例如参考文献75和76]。然而通常，脑膜炎球菌偶联物被制成供肌内注射。用于本发明的组合物可以含有或不含疫苗佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于A#存,激廣游蕴合激适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(如过氧化物(oxyhydroxide))、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见参考文献77的第8和9章]，或不同矿物质化合物的混合物，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选(具有)吸附性。含有矿物质的组合物也可配配制为金属盐颗粒[78]。特别优选磷酸铝，典型的佐剂是P04/A1摩尔比在0.84和0.92之间的无定形羟基磷酸铝，含量为0.6mgAl3+/ml。可用低剂量磷酸铝吸附，例如每剂每偶联物50-100figAl3+。当组合物中含有一种以上偶联物时，不需要吸附所有偶联物。5.浙储适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献77的第10章；也可参见参考文献79](利用微流化剂配制成亚微米颗粒的5%角鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85)。也可用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。C.舒虔微参教腐77鄉"萄皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologousgroup)。皂树(2w说a/"^o朋WflMolina)树皮中的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可购自丽花菝葜(5"脂7ax翻—(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(G炉opM/ap画.cwto")(婚纱花(bridesveil))和肥皂草OSa/o"flWac#c/a"a/&)(皂根(soaproot))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。QS21的商品名为StimulonTM。也可利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术特别纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B禾卩QH-C。皂苷优选QS21。参考文献80公开了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[81]。可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献77的第23章]。ISCOM—般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有一种或多种QuilA、QHA和QHC。参考文献81-83进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它去污剂[84]。皂苷佐剂开发的综述见参考文献85和86。D.疯毒,谅毒微粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种任选与磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白质。它们通常是非病原性、非复制性，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的病毒蛋白包括源自以下的蛋白质流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Q卩-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白pl)。参考文献87-92进一步讨论了VLP。例如，参考文献93进一步讨论了病毒体。五.潘萝或微主激好生激适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物。LPS的无毒衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-0-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-0-酰化单磷酰基脂质A的混合物。参考文献94公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选"小颗粒"形式。3dMPL的这种"小颗粒"足够小从而可经0.22pm膜无菌过滤[94]。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基垸基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[95、96]。脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A的衍生物，例如OM-174。例如，OM-174描述于参考文献97和98。适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰物并且可以是双链或单链的。参考文献99、100和101公开了可能的类似物取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献102-107进一步讨论了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[108]。CpG序列，例如CpG-AODN特异地诱导Thl免疫应答，或者，例如CpG-BODN更特异地诱导B细胞应答。参考文献109-111讨论了CpG-A和CpG-BODN。CpG优选是CpG-AODN。优选将CpG寡核苷酸构建为5'端易于为受体识别。两条CpG寡核苷酸序列任选在它们的3'端相连以形成"免疫聚物"(immunomer)。参见，例如参考文献108和112-114。细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素"LT'〕、霍乱(病毒)("CT")或百日咳(病毒)("PT")。参考文献115描述了解毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，参考文献116描述了其作为胃肠外佐剂的应用。毒素或类毒素优选为含有A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有解毒性突变；B亚基优选未突变。佐剂优选是解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献117-124。氨基酸取代的数字基准优选以参考文献125所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础，该文献专门全文纳入本文作为参考。F人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[126]等)[127]、干扰素(如，干扰素-力、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。G生物粘合剂和粘膜粘合剂生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[128]，或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[129]。//.微微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(a-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm至150(im，优选约200nm至30pm，最优选约500nm至10|im的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。/.微浙参教劍77鄉"，萄适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献130-132。織乙微或顆Z鄉鄉适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[133]。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[134]以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[135]。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。丄.應垄微适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰-Sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。K覆錄薪尸C尸"PCPP制剂描述于，例如参考文献136和137中。M欲辟#墜诺^￥众^激适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物包括参考文献138和139中进一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")。见-银^"基M",众^欽缩氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献140所述内容。縮氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-a方面特别有效。O.经嚴維^激色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献141所述内容。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-a方面特别有效。本发明也可包括以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，本发明可采用以下佐剂组合物(1)皂苷和水包油乳剂[142];(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[143];(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[144];(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[145];(6)SAF，含有10。/。鲨烯、0.4。/。吐温80tm、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121禾口thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液。(7)Ribi佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem)，含有2%鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox);(8)—种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL);和(9)一种或多种无机盐(如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(如含CpG基序的核苷酸序列)。参考文献77的第7章公开了用作免疫刺激剂的其它物质。特别优选使用氢氧化铝或磷酸铝佐剂，且偶联物通常被吸附到这些盐上[例如参考文献9的实施例7和8;参考文献10的实施例J]。也可以与铝盐混合但不吸附[27、72]。磷酸钙是另一种优选的佐剂。可将偶联物分别与佐剂混合(任选被吸附)然后再将偶联物混合物在一起，或者可以先将偶联物混合在一起然后在于佐剂混合。用于本发明的组合物的pH宜为6-8，优选约为7。可用缓冲液维持稳定的pH。当组合物含有氢氧化铝盐时，优选使用组氨酸缓冲液[146]。组合物可以是无菌和/或无热原的。组合物可以对人等渗。组合物可包含防腐剂(例如硫柳汞、2-苯氧乙醇)，或者可不含防腐剂。优选的本发明的组合物不含任何含汞物质，例如不含硫柳汞。为防止抗原、尤其是偶联物抗原之间相互影响，优选含有聚阴离子聚合物，如聚-L-谷氨酸[147]。组合物可装在药瓶内，或者可装在装好的注射器内。注射器可以配备或不配备针头。注射器通常含有单剂量组合物，而药瓶可含有单剂量或多剂量。可注射的组合物将通常为液体溶液或悬浮液。或者它们可以固体形式(例如被冻干)存在，在注射之前用液体载体制成溶液或悬浮液。组合物可以单位剂量形式或多剂量形式包装。对多剂量形式而言，药瓶优于预装的注射器。可常规建立有效剂量体积，但该组合物的典型人类剂量体积约为0.5ml。当组合物要在使用之前临时制备(例如当组分以冻干形式存在时)并以试剂盒的形式出现时，该试剂盒可包含两个药瓶，或者可包含一个已经装好的注射器和一个药瓶，注射器的内容物用于在注射之前复活药瓶内的内容物。就含有血清群A荚膜糖的组合物而言，血清群A的糖类可被冻干，而其它血清群的糖类可以液体形式存在。组合物将含有免疫学有效量的脑膜炎球菌偶联物以及所需要的任何其它组分。'免疫学有效量'指给予个体该用量(单一剂量或作为系列剂量的一部分)可在患者中引起保护性的抗-脑膜炎球菌免疫应答。该用量取决于所治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类学分组(例如非人灵长类、灵长类等等)、该个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配方、主治医生对身体状况的评估以及其他相关因素。估计该用量应处于可通过常规试验确定的相对较宽的范围内，每剂中各脑膜炎球菌抗原的典型含量为每种血清群l-20)ig(根据糖类测定)，例如每种血清群2-10ng。优选剂量为每种血清群约4pg(即四价混合物的总量为16pg)。组合物中载体蛋白的总量优选不超过100吗/剂，例如<90路/剂、〈80)Lig/剂、<70昭/剂、<60叱/剂、〈50)ig/剂等。组合物中载体蛋白的总量通常为至少10吗/剂。縦术语"含有"包括"包含"以及"由……构成"，例如"含有"X的组合物可仅由X构成或可包含其它的物质，例如X+Y。与数值x相关的术语"约"表示，例如xi10。/。。"基本上"不排除"完全"，例如"基本上无"Y的组合物可完全无Y。"基本上"可视需要从本发明定义中省去。本发明的实施方式iWB7份^/C/W55/T錄凝凝合欽没,载沐，劍可按照参考文献9和10的描述制备血清群A+C、C+W+Y或A+C+W+Y的脑膜炎球菌偶联物的混合物。需要的话可将它们与氢氧化铝或磷酸铝佐剂混合，也如参考文献9和10的描述。这些疫苗可用共价连接到糖类的破伤风类毒素(Tt)载体蛋白[147]制备。选择接受儿童D-T-P疫苗(D-T-Pa或D-T-Pw)的患者，包括那些接受含有D-T-P和其它抗原(例如D-T-P-Hib四价、D-T-P-HBsAg四价、D-T-P-Hib-HBsAg五价、D-T-P-Hib-HBsAg-IPV六价等)的疫苗的患者接受含有Tt载体的偶联物的混合物。选出的对照组患者接受两种偶联物混合物中的一种。对照患者先前未接受过破伤风类毒素，无论是作为单独的抗原或是作为偶联物中的载体蛋白。评价了四价偶联物在患者何种引起免疫应答的能力。如果测试组的抗-脑膜炎球菌免疫应答明显低于对照患者，尤其是如果偶联物无法在患者中引起有效的SBA反应，则表明有载体抑制。在临床试验V59P2中测试了5种制剂，该试验在芬兰和德国进行，其中包括620名12-16个月大的对象。疫苗采用CRM197载体和磷酸铝佐剂[10]。用每0.5ml药剂中糖类质量的微克数表示，各血清群糖类的剂量如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在0时给儿童注射疫苗，其中25%的儿童4周后接受第二次疫苗剂量。给予疫苗1个月后采集患者的血清，在采用人补体的SBA试验中检测抗各血清群脑膜炎奈瑟球菌的杀菌抗体。SBA效价与O时的血清相比升高，其标准为》1:4和》1:8。还测定了抗各血清群的荚膜糖的抗体效价(GMT)。结果见下表l。因此，该三价和四价疫苗在儿童中都具有免疫原性。每种偶联物糖含量低至2.5pg时具有免疫原性。产生的免疫应答可加强，给予第二次剂量后SBA效价大幅增加。在该试验中未观察到载体抑制的证据。应当理解，以上仅通过举例描述了本发明，可对其作出改进而不超越本发明的范围和精神。表1-V59P2试验的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>参考文献(其内容在此全文并入以供参考)[I]Armand等，(1982)■/历o/.Sto"t/.10:335-339.[2]Cadoz等，(1985)K願."e3:340-342。[3]MA#ra(1997)46(RR-5)1-10.[4]Baklaic等，(1983)/"/e"./mww".42:599-604.[5]Jones(2001)C群/羅幼,gDrags2:47-49.[6]Costantino%，(1992)r腦."e10:691-8.[7]Lieberman等，(1996)275:1499-503.[8]WO2005/000345.[9]WO02/058737.[10]WO03/007985.[II]Rennels等，(2002)Pea^^/"/e"IfcJ21:978-979.[12]WO2004/013400.[13]Campbell等，(2002)￡fe186:1848-1851.[14〗Herzenberg等，(1980)淑脏285:664-667.[15]Schutze等，(1985)//画画/135:2319-2322.[16]Dagan等，(1998)66:2093-2098.[17]Barington等，(1994)/"/ec"wmw"62:9-14.[18]Dilohn等，(1989)2(8677):1415-8.[19]Granoff等，(1993)Kcc/"e增刊1:S46-51.[20]Granoff等，(1994)X4M4272:1116-1121.[21]Barington等，(1993)61:432-438.[22]澳大利亚专利748716(授权自W098/51339).[23]Olander等，(2001)racd"e20:336-341.[24]Burrage等，(2002)/"/ec,/mww"70:4946-4954.[25]Peeters等，(1999)59:3504-3510.[26]Hoppenbrouwers等，(1999)17:2588-98.[27]WO02/00249.[28]WO00/56360.[29]Reddin等，(2001)F￡MS/mm/"o/Mei/M/cra&W31:153-162.[30]Podda等，(1991)&cc/"e9:741-745.[31]Plotkin和Orenstein编的(f疫^V」(T^cc/"e^，2004，ISBN0-7216-9688-0[32]Ramsay等，(2001)丄認"357(9251):195-196.[33]Lindberg(1999)Facc/"e17增刊2:S28-36.[34]Buttery和Moxon(2000)JiCo〃尸/z;^c/ara34:163-168.[35]Ahmad和Chapnick(1999)/"/e"C""7VoW/爿w13:113-33，vii.[36]Goldblatt(1998)J:MedM/craWo/.47:563-567.[37]欧洲专利0477508.[38]美国专利5,306,492.[39]W098/42721.[40]Dick等，见Cruse等编的(f錄凝资帝j^Cwy'wga^KaccZ"一Karger，Basel,1989，10:48-114.[41]Hermanson(f主激錄凝发术j1(B/oc呵'wga,e7fec/zw々腦」，AcademicPress，SanDiego(1996)ISBN:0123423368.[42]WO03/080678.[43]Glode等，(1979)J/"/e"Z^139:52-56WO94/05325;美国专利5,425,946.英国专利申请0323103.2.WO96/40242Lees等，(1996)Kacc/"e14:190-198.WO95/08348.美国专利4,882,317美国专利4,695,624Porro等，(1985)Mo//mmw"o/22:907-919.EP-A-0208375WO00/10599Gever等，MMM/cto6/o/./w附w"o/，165:171-288(1979).美国专利4,057,685.美国专利4,673,574;4,761,283;4,808,700.美国专利4,459,286.美国专利4,965,338美国专利4,663,160.美国专利4,761,283美国专利4,356,170Bahner禾口Borrow(2004)五x;ertievP&cc/we3:77-87.Watson(2000)尸^fe^J19:331-332.Rubin(2000)iW/a^"C""MjW/z為47:269-285，v.Jedrzejas(2001)M.craWo/Mo/廳iev65:187-207.Zielen等，(2000)/w薩.68:1435-1440.Darkes禾口Plosker(2002)/W/欲Dr卿4:609-630.Kanra等，(1999)TwrAi^Jow"a/o/Paefl^Way42:421-427.Ravenscroft等，(2000)￡ev说'o/(Saw/)103:35-47.WO97/00697.W096/37222;美国专利6,333,036.WO2004/032958Gennaro(2000)(f^欲銜劍^W学与类'應》^em/"g,o"..77^Sc/e"ce尸m"!'ceo/泡腦cy」，第20版，ISBN:0683306472.IAlmeida和Alpar(1996)/i>wgK,力g3:455-467.Agarwal和Mishra(1999)J五x;说o/37:6-16.Powell和Newman编的《度度设(六..JVFacc/"eISBN:030644867X,Plenum.WO00/23105.WO90/14837.美国专利5,057,540.W096/33739.EP-A-0109942.W096/11711.WO00/07621.Barr等，(1998)Jcfwmcet/￡>e/;ver_y32:247-271.Sjolanderet等，(1998)Wvtmcet/i>wgZ)e//ve^yievZe概32:321-338.Niikum等，(2002)Wra/ogy293:273-280.Lenz等，(2001)166:5346-5355.Pinto等，(2003)J7"/e"￡fe188:327-338.90]Gerber等，(2001)Wra/75:4752-4760.91]WO03/024480.93]Gluck等，(2002)Facc/"e20:B10-B16.94]EP-A-0689454.95〗Johnson等，(1999)MWC/zew丄e"9:2273-2278.96]Evans等，(2003)五x;eWKacc/"e2:219-229.97]Meraldi等，(2003)^ccZ"e21:2485-2491.98]Pajak等，(2003)&cc/"e21:836-842.99]Kandimalla等，(2003)fc/e/c」c/Aie廳rc/31:2393-2400.100]WO02/26757.]W099/62923.jKrieg(2003)NatureMedicine9:831-835.]McCluskie，(2002)F￡MS/附ww"o/ogyam/Me^ca/M/cra^Wogy32:179-185.]WO98/40100.]美国专利6,207,646.]美国专利6,239,116.]美国专利6,429，199.]Kandimalla等，(2003)5bc/e(y7>araa"/ora31(第3部分):654-658.]Blackwell等，(2003)J/膽廳/170:4061-4068.110]Krieg(2002)7e油/麵腳/23:64-65.Ill]WO01/95935.]Kandimalla等，(2003)55iC306:948-953.]Bhagat等，(2003)S5/C300:853-861.]WO03/035836.]W095/17211.]W098/42375.]Beignon等，(2002)/"/ec〃www"70:3012-3019.]Pizza等，(2001)K顯."e19:2534-2541.]Pizza等，(2000)JMec/M/cra編290:455-461.]Scharton-Kersten等，(2000)/"/ec〃www"68:5306-5313.]Ryan等，(1999)/"/ec//www"67:6270-6280.]Partidos等，(1999)/附ww"o"eW67:209-216.]Peppoloni等，(2003)￡，Wfecc/we2:285-293.]Pine等，(2002)JCoWra/化/^ye85:263-270.]Domenighini等，(1995)她/M/cra編15:1165-1167.126]WO99/40936.127]W099/44636.128]Singh等，(2001)JCoWie/mye70:267-276.129]WO99/27960.]美国专利6,0卯,406]美国专利5,916,588132]EP-A-0626169.133]W099/52549.134]WO01/21207.135]WO01/21152.136]Andrianov等，(1998)历owafe〃a/s19:109-115.137]Payne等，(1998)A/vDragZ)Wveo^eWew31:185-196.101102103104105106107108109112113114115116117118119120121122123124125130131Stanley(2002)C""鄉D謂ato/27:571-577.fl39JJones(2003)Cwr(9戸'"/"ve^gZ)n/gs4:214-218.[140]W。04/60308[141]WO04/64759.[142]W099/11241.[143]WO94/00153.[144]W098/57659.[145]欧洲专利申请0835318，0735898和0761231.[146]WO03/009869.[147]WO2004/110480.权利要求1.一种免疫人类患者以抵抗脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的方法，该方法包括给予所述人类患者一种含有(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；以及(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物，其中，所述患者已经用下述(a)和/或(b)预先免疫过(a)破伤风类毒素；(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌外的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物。2.(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种物质在制造用于免疫人类患者以抵抗脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的药物中的的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物；以及(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物，其中，所述患者已经用下述(a)和/或(b)预先免疫过(a)破伤风类毒素；(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌外的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的偶联物。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述组合物含有(a)、(b)、(c)和(d)中所有四种。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是(a)、(b)、(c)和(d)中所有四种的应用。5.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者已经用含有破伤风类毒素的疫苗预先免疫过。6.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者已经用含有Hib偶联物的疫苗预先免疫过。7.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者己经用含有至少一种肺炎球菌偶联物的疫苗预先免疫过。8.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者在所述方法或应用前至少6个月已经预先免疫过。9.如权利要求8所述的方法或应用，其特征在于，所述患者在所述方法或应用前至少8年已经预先免疫过。10.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述预先免疫在患者出生1年内进行。11.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述脑膜炎球菌偶联物(aMd)中的糖短于在脑膜炎球菌中发现的天然荚膜糖。12.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述脑膜炎球菌偶联物包含破伤风类毒素载体和己二酸接头。13.如权利要求16所述的方法或应用，其包含不超过60ng的破伤风类毒素载体。14.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物还含有偶联的肺炎链球菌的荚膜糖。15.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物还含有偶联的B型流感嗜血杆菌的荚膜糖。16.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物还含有脑膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白质抗原。17.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物含有氢氧化铝佐剂和/或磷酸铝佐剂。18.如上述任一权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟球菌造成的疾病是脑膜炎球菌性脑膜炎。全文摘要在不久的将来，脑膜炎球菌偶联荚膜糖将被引入免疫接种计划，但首先要解决“载体抑制”现象，尤其是当使用多种偶联物时。在本发明中，破伤风类毒素被用作载体蛋白，即使当同时给予多种脑膜炎球菌偶联物和当患者已经接触过在先免疫原(例如在DTP疫苗中)或在先载体蛋白(例如在Hib或肺炎球菌偶联疫苗中)形式的该载体蛋白时。本发明提供了一种免疫患者的方法，该方法包括给予多种脑膜炎球菌荚膜糖的偶联物，其中所述各偶联物含有破伤风类毒素载体蛋白和荚膜糖，且其中所述患者已经用破伤风类毒素预先免疫过。文档编号A61K47/48GK101163508SQ200680005096公开日2008年4月16日申请日期2006年1月13日优先权日2005年1月14日发明者C·J·马歇尔申请人:诺华疫苗和诊断有限公司