一种b群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品领域，具体地，涉及一种B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫 苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 脑膜炎奈瑟菌是细菌性脑膜炎和脓毒血症的主要致病菌，根据脑膜炎球菌菌体表 面荚膜多糖结构和抗原性的差异，脑膜炎球菌分为13个血清群（Serogroup)，其中5个群 (A，B，C，W135和Y群）为主要的致病菌群。全球由脑膜炎球菌引起的脑膜炎发病率每年达 30-50万，其中，约有50%的感染者主要由B群脑膜炎球菌引起。近年来，由于抗生素的滥 用，世界各地陆续出现耐药菌株，这给疾病的治疗增加了更大的困难。
[0003] 人们普遍认为接种安全有效的疫苗是预防和控制流脑的理想措施，脑膜炎球菌各 致病血清型之间没有交叉保护，接种单价疫苗则不能有效预防由其它血清型菌株的感染， 目前国外已有A群、C群、A+C群、ACYW135群等多种单价、二价及四价流脑多糖、多糖蛋白结 合疫苗上市销售，在接种人群中已证明是非常安全和有效的。然而，B群脑膜炎球菌表面的 荚膜多糖在哺乳动物和人胚胎组织及神经节苷脂中含有类似的结构可能产生交叉反应，所 以B群脑膜炎的荚膜多糖不适合用于传统的脑膜炎球菌多糖疫苗或多糖蛋白结合疫苗的 研宄开发，寻找合适的非荚膜抗原是开发B群脑膜炎球菌疫苗的关键。
[0004] 人类H结合因子是所有脑膜炎奈瑟菌菌株都表达的一种抗原蛋白，但由于不同菌 株表达的HBP氨基酸序列不同，从而交叉免疫反应性有所差异，因此按照HBP差异可分为 HBPVl、HBPV2、HBPV3 三个变异种。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗。
[0006] 本发明的另一目的在于提供制备上述疫苗的方法。
[0007] 本发明的B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗含有人类H因子结合蛋白三个变异 体的重组蛋白，分别为rHBPVUrHBPV2、rHBPV3。编码rHBPVUrHBPV2、rHBPV3 重组 蛋白的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 1-3所示。
[0008] 本发明的rHBPVl重组蛋白通过以下方法制备得到：合成rHBPVl基因片段，核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示，并在该基因的Y端和:V端分别添加BglII、XhoI酶切位 点，与表达载体连接，导入宿主细胞，筛选得到高效表达rHBPVl的工程菌株MH-rHBPVI，保 藏编号为CGMCCNO. 10718 ;将该工程菌株发酵培养，诱导表达重组蛋白，纯化、过滤除菌；
[0009] 本发明的rHBPV2重组蛋白通过以下方法制备得到：合成rHBPV2基因片段，核 苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，并在该基因的Y端和:V端分别添加HindIII、XhoI酶 切位点，与表达载体连接，导入宿主细胞，筛选得到高效表达rHBPV2的工程菌株MH-rHBP V2,保藏编号为CGMCCNO. 10719 ;将该工程菌株发酵培养，诱导表达重组蛋白，纯化、过滤除 菌；
[0010] 本发明的rHBPV3重组蛋白通过以下方法制备得到：合成rHBPV3基因片段，核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示，并在该基因的Y端和:V端分别添加NdeI、XhoI酶切位点， 与表达载体连接，导入宿主细胞，筛选得到高效表达rHBPV3的工程菌株MH-rHBPV3,保藏 编号为CGMCCNO. 10720;将该工程菌株发酵培养，诱导表达重组蛋白，纯化、过滤除菌。
[0011] 本发明提供了上述rHBPVUrHBPV2、rHBPV3重组蛋白分别在制备预防或治疗B 群流行性脑膜脑炎诱发的疾病的药物中的应用。
[0012] 本发明的实施例中，制备上述三种基因工程菌株时所用的表达载体为pET-22b，3 个表达重组蛋白的工程菌株分别命名为MH-rHBPVI、MH-rHBPV2、MH-rHBPV3。
[0013]MH-rHBPVl菌株，其保藏编号为CGMCCNO. 10718,该菌株已于2015年4月15日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichiacoli〇
[0014]MH-rHBPV2菌株，其保藏编号为CGMCCNO. 10719,该菌株已于2015年4月15日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichiacoli〇
[0015]MH-rHBPV3菌株，其保藏编号为CGMCCNO. 10720,该菌株已于2015年4月15日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichiacoli〇
[0016] 上述3个表达重组蛋白的工程菌株的发酵培养方法为：将工程菌株分别接种于含 终浓度为50yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37 °C培养过夜制备种子液，种子液移入适 合大肠杆菌生长的液体培养基中发酵：37°C，pH7. 0-7. 2,200r/min;
[0017] 诱导表达重组蛋白的方法为：当细菌生长到0D_= 15时，加入终浓度为0.lmmol/ L的IPTG诱导，诱导温度为30°C，继续培养6~8h后，停止培养，8000rpm，4°C连续离 心20min，收集菌体，用pH7. 0、20mmol/LTris-HCl缓冲液洗绦菌体2遍，勾衆破碎后， 12000g，4°C离心30min，弃去沉淀。
[0018] 本发明的疫苗中，rHBPVUrHBPV2、rHBPV3在疫苗中的含量均为22. 5-27. 5yg/ ml，调节pH至 7. 0-7. 4。
[0019] 优选地，本发明疫苗中，rHBPVUrHBPV2、rHBPV3在疫苗中的含量均为25.Oyg/ ml，调节pH至7. 2。
[0020] 本发明的疫苗还含有佐剂，所述佐剂选自磷酸铝、氢氧化铝和MF59中的一种或多 种；优选磷酸铝。
[0021] 本发明的疫苗中，铝含量为0.5-1. 5mg/ml疫苗。
[0022] 本发明还提供一种制备B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗的方法，包括以下步 骤：
[0023] (1)制备rHBPVI、rHBPV2、rHBPV3重组蛋白；所述重组蛋白的核苷酸序列分别 如SEQIDNO. 1-3 所示；
[0024]rHBPVI、rHBPV2、rHBPV3 重组蛋白的制备方法为：分别将rHBPVI、rHBPV2、 rHBPV3基因与载体连接，转化，挑取鉴定正确的阳性克隆，转入感受态细胞，挑取单克隆， 接种培养基，加入IPTG诱导选择表达量最高的菌株作为工程菌菌株保存；所述表达量最高 的菌株分别为：保藏编号为CGMCCNO. 10718的MH-rHBPVI、保藏编号为CGMCCNO. 10719的 MH-rHBPV2、保藏编号为CGMCCNO. 10720 的MH-rHBPV3 ;
[0025] (2)将获得的3个重组蛋白高表达菌株分别发酵扩大培养，诱导表达重组蛋白；纯 化蛋白，过滤除菌；
[0026] (3)将3种重组蛋白rHBPVUrHBPV2、rHBPV3定量后，分别与佐剂吸附，超速离 心去除内毒素后将三者混合制得B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗。
[0027] 步骤（1)的载体为pET_22b。
[0028] 步骤（2)中菌株的发酵培养方法为：先将本发明的三株菌种分别接种于含终浓 度为50yg/mL氨节青霉素的新鲜LB液体培养基，37°C培养过夜制备种子液，供发酵罐接 种用，发酵培养可选择适宜大肠杆菌生长的培养基；发酵控制参数设定：37°C，pH7. 0-7. 2， 200转/分钟。
[0029] 步骤（2)中诱导表达重组蛋白、纯化、过滤的方法为：当细菌生长到0D_= 15时， 加入终浓度为0.lmmol/L的IPTG诱导，诱导温度为30°C，继续培养6~8h后，停止培养， 8000rpm，4°C连续离心20min，收集菌体，用pH7. 0、20mmol/LTris-HCl缓冲液洗涤菌体2 遍，勾衆破碎后，12000g，4°C离心30min，弃去沉淀，离子层析纯化，在280nm波长下检测层 析峰，收集目标峰，得到rHBPVl溶液，纯化后的rHBPVl溶液进行除菌过滤、定量，分装，于 2~8°C保存。
[0030] 步骤（3)中佐剂为铝佐剂，三者混合后，铝含量为0.5-1. 5m