剂混合液体，混匀，室温吸附lh，4°C保存。
[0059] 2、rHBPV2与磷酸铝佐剂吸附产物的制备
[0060] 取实施例2制得的除菌过滤的rHBPV2蛋白，调节pH至6. 0-7. 0,加入等体积的氢 氧化铝，得到终浓度为lmg/mL的铝佐剂混合液体，混匀，室温吸附lh，4°C保存。
[0061] 3、rHBPV3与磷酸铝佐剂吸附产物的制备
[0062] 取实施例2制得的除菌过滤的rHBPV3蛋白，调节pH至6. 5-7. 0,加入等体积的氢 氧化铝，得到终浓度为lmg/mL的铝佐剂混合液体，混匀，室温吸附lh，4°C保存。
[0063]用5mmol/L磷酸缓冲液（pH7. 2)稀释上述制备的3中rHBP与磷酸铝佐剂的吸附 体系，然后将3种吸附产物等体积混合，使得成品组分及含量为：rHBP的三个变异体Vl、V2、 乂3的含量均为25.〇1^/1111，调节？11至7.2。
[0064] 实施例5B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗的杀菌试验
[0065] 将体重为16_18g雌性BALB/c小鼠随机分组，每组10只，分别用实施例3和实施 例4制备的B群流行性脑膜脑炎球菌重组蛋白疫苗进行免疫，同时设生理盐水对照组。每 只小鼠腹腔注射〇. 5ml，含rHBPVI、V2、V3各25yg，于第0天、第21天、第35天各免疫一 次，末次免疫后第14天眼眶采血，分离血清，无菌分装进行杀菌力等相关检测。
[0066] 1、TTC液体制备：用灭菌蒸馏水制成0. 5% (W/V)TTC溶液，加热溶解，置于棕色瓶 内，2-8 °C保存备用。
[0067] 2、指示菌悬液制备，将B群流行性脑膜炎球菌341215接种于血琼脂平皿，5%C02、 37°C培养16-18h后，用营养肉汤洗下菌苔，用分光光度计于600nm测定OD值，调整OD值至 〇? 1为原液，做1:10000稀释（相当于104cfu/mL)后使用。
[0068] 3、补体-指示菌悬液制备：用灭菌PBS(pH7. 4)或生理盐水将兔补体作1:20稀释， 再加入终浓度为1 % (v/v)的指示菌。
[0069] 4、微量滴定板：4X10孔聚苯乙烯塑料板，其洗涤处理要求同ELISA法。用微量加 液滴管将PBS或生理盐水以垂直方向分别滴加1滴（0. 025mL)于滴定板的每孔穴中，再将 被检测灭活血清加一滴（〇.〇25mL)于每一排的第一孔中，每块板可做4份标本。
[0070] 5、加补体-指示菌悬液：自每排第一孔开始作2倍稀释至第十孔后，每孔加补 体-指示菌悬液1滴，加盖，在微型振荡器上震荡90s，置湿润容器，于37°C水浴箱培养 30min〇
[0071] 6、加ITC营养肉汤：每孔加入含0. 01%TTC营养肉汤0. 15mL，混匀后，继续置湿 润容器内，于37°C水浴箱培养4h。
[0072] 7、观察结果：将反应板放在白纸上观察结果，以血清最高稀释度的孔内无颜色变 化者为检测标本的杀B群流行性脑膜炎球菌抗体的滴度。
[0073] 表ITTC法检测B群流行性脑膜脑炎球菌重组蛋白疫苗激发的杀菌抗体
[0074]
[0075] 补体介导的杀菌抗体滴度提高8倍或更高具有临床意义，B群流行性脑膜脑炎球 菌重组蛋白疫苗的杀菌力结果（表1)显示，两种铝佐剂吸附的抗原都可以激发小鼠抗毒抗 体的产生，其中B群流行性脑膜脑炎球菌重组蛋白疫苗（磷酸铝佐剂）产生的杀菌抗体滴 度升高尤其明显。
[0076] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗，其特征在于，含有人类H因子结合蛋白三 个变异体的重组蛋白，分别为rHBPVUrHBPV2、rHBPV3。2. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，编码rHBPVI、rHBPV2、rHBPV3重组蛋白 的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 1-3所示。3. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于， rHBPVl重组蛋白通过以下方法制备得到：合成rHBPVl基因片段，核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示，并在该基因的5'端和3'端分别添加BglII、XhoI酶切位点，与表达载体 连接，导入宿主细胞，筛选得到高效表达rHBPVl的工程菌株MH-rHBPVI，保藏编号为CGMCC NO. 10718 ;将该工程菌株发酵培养，诱导表达重组蛋白，纯化、过滤除菌； rHBPV2重组蛋白通过以下方法制备得到：合成rHBPV2基因片段，核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示，并在该基因的Y端和:V端分别添加HindIII、XhoI酶切位点，与表达 载体连接，导入宿主细胞，筛选得到高效表达rHBPV2的工程菌株MH-rHBPV2,保藏编号为 CGMCCNO. 10719 ;将该工程菌株发酵培养，诱导表达重组蛋白，纯化、过滤除菌； rHBPV3重组蛋白通过以下方法制备得到：合成rHBPV3基因片段，核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示，并在该基因的5'端和3'端分别添加NdeI、XhoI酶切位点，与表达载体连 接，导入宿主细胞，筛选得到高效表达rHBPV3的工程菌株MH-rHBPV3,保藏编号为CGMCC NO. 10720 ;将该工程菌株发酵培养，诱导表达重组蛋白，纯化、过滤除菌。4. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，rHBPVI、rHBPV2、rHBPV3在疫苗中的含 量为 22. 5-27. 5yg/ml，调节pH至 7. 0-7. 4。5. 如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，rHBPVUrHBPV2、rHBPV3在疫苗中的含 量均为25. 0yg/ml，调节pH至7. 2。6. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，还含有佐剂，所述佐剂选自磷酸铝、氢氧化 铝和MF59中的一种或多种。7. 如权利要求6所述的疫苗，其特征在于，铝含量为0. 5-1. 5mg/ml疫苗。8. -种制备权利要求1-6任一所述B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗的方法，其特 征在于，包括以下步骤： (1) 制备rHBPVUrHBPV2、rHBPV3重组蛋白；所述重组蛋白的核苷酸序列分别如SEQ IDNO. 1-3 所示； rHBPVUrHBPV2、rHBPV3重组蛋白的制备方法为：分别将rHBPVUrHBPV2、rHBPV3 基因与载体连接，转化，挑取鉴定正确的阳性克隆，转入感受态细胞，挑取单克隆，接种培养 基，加入IPTG诱导选择表达量最高的菌株作为工程菌菌株保存；所述表达量最高的菌株分 别为：MH-rHBPVl保藏编号为CGMCCNO. 10718、MH-rHBPV2 保藏编号为CGMCCNO. 10719、 MH-rHBPV3 保藏编号为CGMCCNO. 10720 ; (2) 将获得的3个重组蛋白高表达菌株分别发酵扩大培养，诱导表达重组蛋白；纯化蛋 白，过滤除菌； (3) 将3种重组蛋白rHBPVUrHBPV2、rHBPV3定量后，分别与佐剂吸附，超速离心去 除内毒素后将三者混合，制得B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（3)中佐剂为铝佐剂，三者混合后，铝含 量为 0. 5-1. 5mg/ml疫苗。10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，rHBPVUrHBPV2、rHBPV3在疫苗中 的含量均为 22. 5-27. 5yg/ml，调节pH至 7. 0-7. 4。
【专利摘要】本发明提供了一种B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗及其制备方法，属于生物制品领域。本发明的疫苗含有人H因子结合蛋白三个变异体重组蛋白。本发明还提供了B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗的制备方法，包括：人类H因子结合蛋白V1、V2、V3重组表达载体构建、表达菌株筛选鉴定、发酵培养、重组蛋白抗原的诱导表达、重组蛋白抗原的纯化以及蛋白检测，根据上述3种抗原成分的浓度，定量混合后结合铝佐剂制得。本发明提供的B群流行性脑膜脑炎球菌重组蛋白疫苗经腹腔注射免疫小鼠，可激发小鼠机体产生抗B群流行性脑膜炎特异抗体，能使补体介导的血清杀菌抗体升高8倍以上。CGMCC NO.1071820150415CGMCC NO.1071920150415CGMCC NO.1072020150415
【IPC分类】A61P31/04, A61K39/095
【公开号】CN104888209
【申请号】CN201510240635
【发明人】林福玉, 魏文进, 孟夏萌, 任玉莹, 张静飞, 郑海发
【申请人】北京民海生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月13日