g/ml疫苗。
[0031] 三者混合后rHBPVUrHBPV2、rHBPV3在疫苗中的含量为22.5-27.5yg/ml，调节 pH至7. 0-7. 4。优选地，混合后rHBPVUrHBPV2、rHBPV3在疫苗中的含量均为25.Oyg/ ml，调节pH至7. 2。
[0032] 本发明针对B群脑膜炎的荚膜多糖不适合用于传统的脑膜炎球菌多糖疫苗或多 糖蛋白结合疫苗的研发的缺点，利用基因工程技术表达人H因子结合蛋白三个变异体的重 组蛋白抗原，制备获得一种B群流性性脑膜炎球菌疫苗。该疫苗各组分相互协调补充，抗原 性强，具有良好的免疫原性、安全性和生物学活性，能够诱导机体产生高滴度的中和抗体， 并具有杀菌活性，保护力强，疫苗经腹腔注射免疫小鼠，可激发小鼠机体产生抗B群流行性 脑膜炎特异抗体，能使补体介导的血清杀菌抗体升高8倍以上。
【附图说明】
[0033] 图1为rHBP纯化后SDS-PAGE检测图，图IA图为rHBPVlSDS-PAGE检测图，图中 1-3为纯化的rHBPVl，4为去除的杂蛋白，5为Marker;图IB图为rHBPV2SDS-PAGE检测 图，图中1为纯化的rHBPV2,2为Marker;图IC图为rHBPV3SDS-PAGE检测图，图中1-3 为纯化的rHBPV3,4为Marker。
【具体实施方式】
[0034] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0035] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实 验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress, 1989)中所述的条件进行。
[0036] 实施例IB群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗各组分重组蛋白基因工程菌株构建
[0037]UrHBPVl工程菌的构建
[0038]根据NCBI公布的rHBPVl编码基因（GenBank登录号！AE002098. 2)，按照大肠杆 菌密码子偏好性进行序列优化（SEQIDNo. 1)，并在序列上游、下游分别添加BglII、XhoI 酶切位点；将合成的rHBPVl基因片段，与用相同核酸内切酶酶切的表达载体pET-22b进行 连接，导入宿主细胞E.coliBL21 (DE3)，经筛选得到高效表达rHBPVl的工程菌株（表达 量：56. 0mg/L)，命名为：MH-rHBPVl菌株，其保藏编号为CGMCCNO. 10718,该菌株已于2015 年4月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCCJfta: 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，分类命名为大 肠埃希氏菌Escherichiacoli。按照"生物制品生产检定用菌毒种管理规程"的要求，进行 rHBPVl表达菌株三级菌种库的建立。
[0039] 2、rHBPV2工程菌的构建
[0040] 根据NCBI公布的rHBPV2编码基因（GenBank登录号：DQ523568. 1)，按照大肠杆 菌密码子偏好性进行序列优化（SEQIDNo. 2)，并在序列上游、下游分别添加HindIII、Xho I酶切位点；将合成的rHBPV2,与用HindIII、XhoI核酸内切酶酶切的表达载体pET-22b 进行连接，导入宿主细胞E.coliBL21 (DE3)，经筛选得到高效表达（73.lmg/L)rHBPV2的工 程菌株，命名为：MH-rHBPV2菌株，其保藏编号为CGMCCNO. 10719,该菌株已于2015年4月 15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，分类命名为大肠埃希氏 菌Escherichiacoli。按照"生物制品生产检定用菌毒种管理规程"的要求，进行rHBPV2 表达菌株三级菌种库的建立。
[0041] 3、rHBPV3工程菌的构建
[0042] 根据NCBI公布的rHBPV3编码基因（GenBank登录号：DQ523569. 1)，按照大肠杆 菌密码子偏好性进行序列优化（SEQIDNo. 3)，并在序列上游、下游分别添加NdeI、XhoI 酶切位点；将合成的rHBPV3,与用NdeI、XhoI核酸内切酶酶切的表达载体pET-22b进行 连接，导入宿主细胞E.coliBL21 (DE3)，经筛选得到高效表达（68. 6mg/L)rHBPV3的工程菌 株，命名为：MH-rHBPV3菌株，其保藏编号为CGMCCNO. 10720,该菌株已于2015年4月15 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichiacoli。按照"生物制品生产检定用菌毒种管理规程"的要求，进行rHBPV3表 达菌株三级菌种库的建立。
[0043] 实施例2rHBPVUrHBPV2、rHBPV3重组蛋白的获得
[0044] rHBP三个变异体rHBPVI、rHBPV2、rHBPV3的获得，过程分为：种子液制备、发 酵、离心收集菌体、菌体破碎、过滤除菌和低温保存。以下为rHBPVl的获得方法，rHBPV2、 rHBPV3的获得方法参考rHBPVI。
[0045] 先将实施例1获得的rHBPVl工作种子批菌种（MH-rHBPVl菌株，其保藏编号为 CGMCCNO. 10718)分别接种于含终浓度为50yg/mL氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基，37°C培养过夜制备种子液，供发酵罐接种用，发酵培养可选择适宜大肠杆菌生长的培养基。发 酵参数：37°C，pH7. 0-7. 2,200转；当细菌生长到OD6tltl= 15时，加入终浓度为0.lmmol/L的 IPTG诱导，诱导温度为30°C，继续培养6~8h后，停止培养，8000rpm，4°C连续离心20min， 收集菌体，用pH7. 0、20mmol/LTris-HCl缓冲液洗涤菌体2遍，匀浆破碎后，12000g，4°C离 心30min，弃去沉淀，离子层析纯化，在280nm波长下检测层析峰，收集目标峰，得到rHBPVl 溶液。纯化后的rHBPVl溶液进行除菌过滤、定量，分装于大瓶，于2~8°C保存。
[0046] 实施例3抗原与氢氧化铝佐剂吸附产物的制备与B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白 疫苗配制
[0047] 氢氧化铝佐剂制备方法为：在PBS中，缓缓加入10 %KAl(SO4)2，磁力搅拌器，以不 形成漩涡为准，混匀。向混合液中缓慢滴加0. 5mol/LNaOH，直到pH达到7. 0停止。4°C，静 置24h后，用0. 85%生理氯化钠溶液换液，并定容到初始体积。共换液四次，每次间隔8h。 每次换液完成，搅拌30min后置4°C冰箱放置。最后一次换液用NaOH调pH至6. 0-7. 0定 容，使用前高压处理。
[0048] UrHBPVl与氢氧化铝佐剂吸附产物的制备
[0049] 取实施例2制得的除菌过滤的rHBPVl蛋白，调节pH至5. 5-6. 5,加入等体积的氢 氧化铝，得到终浓度为I. 5mg/mL的的铝佐剂混合液体，混匀，室温吸附lh，4°C保存。
[0050] 2、rHBP V2与氢氧化铝佐剂吸附产物的制备
[0051] 取实施例2制得的除菌过滤的rHBP V2蛋白，调节pH至6.0-7. 0,加入等体积的氢 氧化铝，得到终浓度为I. 5mg/mL的铝佐剂混合液体，混匀，室温吸附lh，4°C保存。
[0052] 3、rHBPV3与氢氧化铝佐剂吸附产物的制备
[0053] 取实施例2制得的除菌过滤的rHBPV3蛋白，调节pH至6. 5-7. 0,加入等体积的氢 氧化铝，得到终浓度为I. 5mg/mL的铝佐剂混合a液体，混匀，室温吸附lh，4°C保存。
[0054] 用5mmol/L磷酸缓冲液（pH7. 2)稀释上述制备的3种rHBP变异体蛋白与氢氧化 铝佐剂的吸附产物，然后将3种吸附产物等体积混合，使得rHBP的三个变异体V1、V2、V3的 含量均为25yg/ml，调节pH至7. 2。
[0055] 实施例4抗原与磷酸铝佐剂吸附产物的制备与B群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫 苗配制
[0056] 磷酸铝佐剂制备按照专利（CN101730660A)进行，pH调节至6. 5。
[0057]UrHBPVl与磷酸铝佐剂吸附产物的制备
[0058] 取实施例2制得的除菌过滤的rHBPVl蛋白，调节pH至5. 5-6. 5,加入等体积的氢 氧化铝，得到终浓度为lmg/mL的的铝佐