专利名称：：修饰的脑膜炎球菌多糖偶联物疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及化学修饰的B类脑膜炎萘瑟球菌(Neisseriameningitidis)多糖。本发明还提供了疫苗，在该疫苗中各个修饰的多糖被偶联于蛋白质载体等。
背景技术：
：由B类脑膜炎萘瑟球菌和大肠杆菌K1造成的脑膜炎仍然是世界上主要的健康问题。B类脑膜炎有地方性和流行性两种，它约占所有脑膜炎(双)球菌脑膜炎记录病例的一半，而K1阳性大肠杆菌是新生儿脑膜炎的主要病因。目前还没有市售的、针对B类脑膜炎球菌和大肠杆菌K1所造成疾病的疫苗。这主要是因为B类脑膜炎球菌多糖(groupBmeningococcalpolysaccharide，GBMP)在人中仅有弱免疫原性。天然GBMP的弱免疫原性以及会导致免疫耐受性，被假设为是因为在人和动物组织中存在共同的表位。有几种最近报道的候选疫苗，这些疫苗以具有外膜蛋白的GBMP复合物为基础，但是到目前为止还没有证据表明它们在人中是有效的。最近，发展了一种新的疫苗概念，这种疫苗以人工化学修饰的(N-丙酰基化的)B类多糖-蛋白质(N-Pr-GBMP-蛋白质)偶联物(或称缀合物，conjugate)为基础。该疫苗在小鼠中诱导高效价的IgG抗体，这些抗体不仅起保护作用，而且可与未修饰的GBMP(即N-乙酰基-GBMP)交叉反应。这一概念在1988年2月23日授予HaroldJ.Jennings等人的美国专利No.4,727,136中有描述并提出了权利要求。已有这样的暗示，导致产生交叉反应性抗体的疫苗(如在美国专利No.4,727,136中所描述的)只能在破坏免疫耐受性的情况下获得成功。由于在天然的N-Ac-GBMP及人和动物的组织两者中都鉴别出一共同的表位(Jennings，Contrib.Microbiol.Immunol.，Basel，Karger，1989，Vol.10，151-165)，该表位由α-(2-8)-连接的唾液酸残基链(最低要求为10个残基)构成，所以使这种假设得以成立。这些多唾液酰基链(polysialosylchain)的功能是作为发育抗原，而且最主要地是与胎儿阶段的胚胎神经细胞粘附相关(Finne等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1983，112，482)。在出生后的成熟过程中，该抗原是负调控的(friedlander等人，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)，1985，101，412)，但是在成熟的人中在得病肌肉的再生期间(Cashman等人，Ann.Neuron.，987，21，48)、在肿瘤细胞中(Roth等人，美国科学院院报，1988，85，299)以及在天然杀伤细胞(NK)和CD3+T细胞中(Husmann等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，1989，19，1761)是表达的。尽管破坏对这些胎儿抗原的耐受性的后果还不清楚，但是需要开发出对人表位有更低免疫原性的疫苗。因此，本发明的一个目的是开发修饰的B类脑膜炎球菌多糖，它有免疫原性并可诱导出对宿主天然表位的交叉反应性更低的抗体。本发明的另一目的是提供包含这些修饰多糖的多糖-蛋白质偶联物。本发明的另一目的是提供具有免疫原性的疫苗，它与GBMP的交叉反应性大大下降。发明概述本发明主要提供化学修饰的B类脑膜炎萘瑟球菌多糖。本发明还提供了疫苗，在该疫苗中各个修饰的多糖被偶联于蛋白质载体。具体地，本发明提供了不饱和的B类脑膜炎萘瑟球菌N-酰基衍生多糖，共价连于蛋白质的不饱和N-酰基衍生多糖偶联物，含有脑膜炎萘瑟球菌不饱和N-酰基衍生多糖的偶联物分子的药物组合物，以及这些组合物作为疫苗的用途。在本发明的一个方面，提供了一种修饰的B类脑膜炎萘瑟球菌多糖，其唾液酸残基的N-乙酰基(C2)被不饱和的C3-4酰基所取代。另一方面，提供了一种抗原偶联物，它包含偶联于免疫学上合适的蛋白质的、不饱和C2-4N-酰基衍生多糖，并且与天然多糖相比具有更高的免疫原性和对交叉反应抗体的诱导性更低。在另一方面，提供了一种疫苗，它含有不饱和的N-酰基衍生多糖-蛋白质偶联物以及合适的载体或稀释剂。本发明的疫苗还可含有治疗有效量的适用于人体的佐剂，如磷酸铝、氢氧化铝或硬脂酰基酪氨酸。在另一方面，提供了一种使哺乳动物对脑膜炎萘瑟球菌和大肠杆菌K1感染产生免疫的方法，该方法包括给可能受到这种感染的哺乳动物(包括人)肠胃外施用免疫有效量的本发明疫苗。疫苗的典型给药量为约1-50微克/千克体重，例如5-25微克/千克体重。在另一方面，本发明提供了能够防止B类脑膜炎萘瑟球菌和大肠杆菌K1造成的脑膜炎的血清和γ-球蛋白组份。该组份的产生是通过用本发明的疫苗免疫一哺乳动物，然后最好将γ-球蛋白组份从免疫血清中分离出来。接着可将该组份施用于个体，以防止由上述生物体造成的感染或者治疗正发生的感染。根据这一点，并考虑到其有利的免疫原性和对GBMP交叉反应抗体的最低诱导性，就会理解本发明的免疫原性疫苗偶联物是治疗用抗血清的来源。本发明的偶联物还可用于产生单克隆抗体，而且还可产生抗独特型抗体。我们发现，用上述授予Jennings等人的美国专利4,727,136中所描述的N-Pr-GBMP-蛋白质偶联物所诱导出的绝大多数杀菌保护性抗体，与GBMP交叉反应抗体并不相关。事实上，绝大部分保护活性属于一个并不与GBMP交叉反应的N-Pr-GBMP-特异性抗体群。考虑到这一点，人们认为N-Pr-GBMP模拟了B类脑膜炎球菌表面的一个独特的杀菌表位。本发明基于这样的发现可以合成化学修饰的GBMP，这种化学修饰的GBMP模拟杀菌表位并且当处于偶联形式时，不仅表现出更高的免疫原性而且还基本上避免了诱导与GBMP交叉反应的抗体的情况。在完成本发明的过程中，已合成了不同的化学修饰的GBMP，并将其各自偶联于蛋白质，然后将偶联物注射入小鼠，将效果与N-Pr-GBMP蛋白质偶联物产生的效果相比较。出人意料的是，现在已发现在N-酰基中存在不饱和键尤其会产生免疫原性偶联物。通过研读下面本发明具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明的这些特征和其他特征。本发明的范围只受所附权利要求书的限定。发明详述本发明总体而言提供了新的B类脑膜炎萘瑟球菌不饱和N-酰基衍生多糖，新的B类不饱和N-酰基衍生物的偶联物，含有共价连于蛋白质的B类脑膜炎萘瑟球菌不饱和N-酰基衍生多糖片段的偶联物分子的药物组合物，以及这些组合物作为疫苗的用途。本发明涉及式(I)的B类脑膜炎萘瑟球菌不饱和N-酰基衍生多糖其中，R1是含有至少一个双键的C2-C4不饱和烷基。在本发明的一个例子中，式I的R1有3或4个碳原子，而且有两个非相邻双键。在本发明的另一例子中，式I的R1是2个、3个或4个碳原子，而且距酰基碳原子最远的碳原子通过双键而相连。可用于本发明式I的修饰的B类脑膜炎球菌多糖N-酰基衍生多糖的具体(但非限定性)例子包括下列N-戊烯酰基(CH2＝CH-CH2-CH2-CONH-)；和N-巴豆酰基(3-丁烯酰基)(CH2＝CH-CH2-CONH-)B类脑膜炎球菌多糖是从脑膜炎萘瑟球菌中，用本领域中已知的方法分离出的。在一种这样的方法中，B类脑膜炎球菌(981B株)是在发酵罐中于37℃生长，其中对每升蒸馏水用30克脱水ToddHewittBroth(DifcoLaboratoriesDetroit，Michigan)。在发酵生长之前，冻干的菌株先在烛式瓶(candlejar)中，于37℃，在5％(v/v)Sheeps′BloodAgar(DifcoLaboratoriesDetroit，Michigan)平板上生长。然后将细菌转移至锥形烧瓶中的1.0升ToddHewittBroth(如上)中，在37℃于190rpm下振荡培养7小时。接着将接种物转移至发酵罐。在发酵生长(16小时)后，通过加入甲醛至终浓度为0.75％而杀死细菌。通过连续离心去除菌体，从上清液中分离出B类脑膜炎球菌多糖。然后基本上按Bundle等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，249，4797-4801(1974)所述的方法进行纯化，不同点在于将粗制多糖溶液与冷的(4℃)90％苯酚(而不是50-60℃的热苯酚)进行搅拌，从而将蛋白质抽提出。后一步骤保证产生高分子量形式的GBMP。大肠杆菌(018K1H7)(NRCC4283)在发酵罐中，在含脱水BrainHeartInfusion(BHI；37克/升)(DifcoLaboratoriesDetroit，Michigan)的蒸馏水中于37℃生长。在发酵生长之前，冻干的菌株先在锥形烧瓶中的50毫升BHI溶液(同上)中，在37℃于200rpm下振荡培养7小时。然后将这种生长物转移至1.5升BHI(同上)中并在与上述相同的条件下生长7小时。接着将接种物转移至发酵罐。在分离和纯化大肠杆菌K1的荚膜多糖中所用的程序，与上述用于分离B类脑膜炎球菌多糖的程序是相同的。应理解，上述的分离和纯化程序并不是唯一可用的程序，可以使用其他出版的程序，如Watson等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，81，331(1958)和上述美国专利4,727,136中所描述的程序。天然的多糖被N-脱乙酰基化，以便在分子的唾液酸残基部分提供反应性胺基。N-脱乙酰基化可用任何已知方法进行，例如在高温如约90-110℃和约pH13-14时，在碱性水性介质中进行。该碱性水性介质合适地是碱金属氢氧化物的水溶液，例如浓度约2M的氢氧化钠。或者，可以使用肼的水溶液。N-脱乙酰基化的程度可在约30-100％之间随条件而有所变动。较佳地是90-100％N-脱乙酰基化。N-脱乙酰基后的产物可通过例如冷却、中和、纯化(如果需要)和冻干而回收。N-脱乙酰基化的结果是，通常产生平均分子量为约3,000-50,000道尔顿的多糖片段。在本发明中，可使用全长的多糖或多糖片段。N-脱乙酰基的多糖片段或全长的多糖然后被N-酰基化，以产生相应的N-酰基化产物。N-酰基化可这样进行将N-脱乙酰基的多糖溶解在pH约7.5-9.0的水性缓冲介质中，然后加入适当的不饱和酰基酐(以及任选的醇，以提高溶解度)，冷却至低于10℃直至反应结束。如果需要，可以对反应介质进行纯化。可以采用的纯化方法的非限制性例子包括透析，然后通过冻干回收N-酰基化产物。反应大致在约10-20小时内完成。用分析技术(通常为1H-NMR)测得的N-酰基化的程度至少为90％，而且最好接近100％。N-酰基化反应不会导致片段分子量的大幅下降。本发明的偶联物分子具有式II结构其中R2是不饱和的C2-4酰基。因此，该偶联物可包含本发明的不饱和多糖，而且还可包含丙烯酰基衍生物。根据本发明，为了偶联目的，优选选择平均分子量对应于约10-200个唾液酸残基的C2-4N-酰基化材料。因此，优选的偶联物是N-丙烯酰基(2-丙烯酰基)衍生物。这一般可使用Ultragel(商品名)AcA44柱(珠直径为60-140微米)，并将PBS用作洗脱剂，通过凝胶过滤N-酰基化的GBMP而实现。或者，采用合适的筛分膜(sizingmembrane)。平均分子量为30,000-40,000道尔顿如10,000-15,000道尔顿的不饱和N-酰基化材料，被优选用于本发明。这可通过收集平均分子量在该范围内的N-酰基化GBMP材料的柱洗脱组份而获得。平均分子量更高例如在30,000-40,000道尔顿范围内的N-酰基化材料，已表明也可用于本发明。在本发明的偶联物分子中多糖对蛋白质的摩尔比优选为1摩尔蛋白质对20摩尔多糖之间。更佳地该比例为1摩尔蛋白对约2-15摩尔多糖。最佳地，该比例为1摩尔蛋白质对4-7摩尔多糖。通过调节偶联反应中原料组份的比例，可改变蛋白质/多糖之比。为了提供包含偶联于蛋白质的不饱和N-酰基衍生多糖的偶联物分子，本发明还设计了多价的偶联物及其疫苗，其中不同类型的多糖被偶联于单个蛋白质上。本发明的疫苗，是通过将不饱和的N-酰基多糖偶联于免疫学上合适的载体蛋白而制得的。较佳地，该载体蛋白本身是免疫原。这种合适的载体蛋白的非限制性例子是细菌蛋白；或包括破伤风毒素、白喉毒素、交叉反应物质(CRM)尤其是CRM197(从SclavoLtd.，Siena，Italy获得)、和细菌蛋白载体的多肽，如脑膜炎球菌外膜蛋白。可用任何的偶联方式将修饰过的多糖片段与载体蛋白相偶联。一种优选的方法是在美国专利4,356,170中所描述的方法，即将末端醛基(通过顺式邻位羟基的氧化)引入N-酰基化多糖中，然后通过还原性胺化作用将醛基偶联于蛋白质的氨基。这样，多糖和蛋白质便通过-CH2-NH-蛋白质键而连接在一起。但是，应理解，本发明的偶联物疫苗并不局限于那些通过还原性胺化反应而产生的偶联物。因此，还可通过用己二酰基二肼间隔体(如Schneerson，R.，等人，Preparation，CharacterizationandImmunogenicityofHaemophilusinfluenzaetypebPolysaccharide-ProteinConjuates，《实验医学杂志》(JExp.Med.)，1952，361-476(1980)和授予LanceK.Gordon的美国专利4,664,059中所述的)，将N-酰基化多糖与载体蛋白偶联在一起，从而产生疫苗。或者，也可使用Merck开发的二元间隔体技术，如Marburg，S.等人，″BiomolecularChemistryofMacromoleculesSynthesisofBacterialPolysaccharideConjugateswithNeisseriameningitidisMembraneProtein″，J.Am.Chem.Soc.，108，5282-5287(1986)中所述的技术，或用还原末端法。根据本发明而制备的偶联物分子通常包含一蛋白质，在该蛋白质上通过多糖片段骨架末端上的单一结合位点而结合有至少一个本发明的脑膜炎球菌多糖片段。因此，如果需要，本发明提供了产生脑膜炎球菌偶联物分子的能力，其中多糖组份除了一个末端之外没有被蛋白质所掩盖。通过支链的末端唾液酸将脑膜炎球菌多糖偶联于蛋白质的其他方法可造成交联，以及多糖被连于蛋白质的多个位点。本发明还包括用这些混合方法产生的偶联物分子。形成的、没有显著交联的N-酰基多糖蛋白质偶联物在水溶液中是可溶的。这使本发明的这些偶联物特别适合用作疫苗。形成的本发明的不饱和N-酰基-多糖蛋白质偶联物，已经用小鼠进行了体外测试，并已表明与N-丙酰基-多糖相比具有更佳的免疫原性。此外，观察到交叉反应抗体的形成显著下降。另外，与其他被测试的偶联物相比，不饱和的偶联物显示了出人意料的高杀菌效价。考虑到这一点，认为本发明的疫苗可用于针对B类脑膜炎萘瑟球菌或大肠杆菌K1生物体造成的脑膜炎。特别感兴趣的是这些疫苗可用于保护人类婴幼儿，他们对细菌性脑膜炎最敏感。本发明的疫苗可含有本领域技术人员已知的、对疫苗合适的标准载体、缓冲剂或防腐剂。此外，在制剂中还可包含佐剂如明矾或硬脂酰基酪氨酸，以增强免疫原性应答。本发明的疫苗，一般是通过将偶联物分散于任何合适的药学上可接受的载体如生理盐水或其他可注射液体中而形成的。本发明疫苗的给药可用任何熟知的方法进行，包括(但并不限于)皮下、腹腔内或肌内给药。疫苗的优选给药方式是非肠胃给药。还可存在疫苗的常规添加剂，例如稳定剂如乳糖或山梨糖醇以及佐剂如磷酸铝、氢氧化物或硫酸盐。本发明的疫苗的给药量应足以引发免疫原性应答。一般，约1-50微克多糖的剂量可有效地产生这样的应答。可根据接受疫苗的个体的大小、体重或年龄等，调整剂量。个体的抗体应答可通过测定抗体效价或杀菌活性加以监测，如果需要可进行加强免疫以增强应答。对于人类婴幼儿的疫苗合适剂量一般为约5-25微克，或约1-10微克/千克体重。实施例此处的实施例部分用于阐述实施本发明的各个不同方面，而不用于以任何方式限制本发明范围。实施例1合成N-丙烯酰基GBMPN-丙烯酰基GBMP的合成描述于RoyR.等人，GlycoconjugateJ.(1990)73-12。将N-脱乙酰基化的GBMP(150毫克)溶解在2.0毫升蒸馏水中。将溶液冷却至0℃；然后用50微升(1eq)丙烯酰基氯(AldrichChemicalCo.)分批地处理，总计500微升丙烯酰基氯。通过自动滴定设备，用4MNaOH将溶液的pH维持在8.5。在添加酰基氯完成(2小时)后，将pH升至12，并在该pH下维持30分钟。通过相对4℃蒸馏水的完全透析而纯化材料，然后冻干形成163毫克。对材料的H-NMR揭示，N-酰基化程度为100％，并且具有合适的丙烯酰基取代基的整合模式。实施例2N-丙烯酰基GBMP的活化将N-丙烯酰基GBMP(150毫克)溶解在蒸馏水(1.25毫升)中，然后加入3.75毫升0.2MNaIO4水溶液(约50eq)。该溶液在室温下于黑暗中放置1小时，然后加入乙二醇(400微升，10eq)。在室温下1小时后，溶液直接上样于已经在水中平衡过的SephadexG-10(1.6×100)柱(PharmaciaFineChemicals)上。将活化产物从柱上于空体积峰处洗脱出来，然后收集和冻干。氧化产物再在用磷酸盐缓冲液(pH7.6)平衡过的BioGelA.5柱(1.6×100)(BioRad)上进行分级。根据选定的洗脱物质组份的HPLC(高效液相色谱)分析(Pharmacia-Superose，12柱)结果，将获得分子量的合并物。将各组份的相对Kav值与预先制作的校正曲线进行比较，从而选择出氧化的丙烯酰基GBMP的一个11KD洗脱组份。如上通过透析纯化各组份。分级后材料的H-NMR波谱分析与氧化的N-丙烯酰基GBMP是相符的。实施例3制备N-丙烯酰基GBMP与破伤风毒素的偶联物将新鲜制备的破伤风毒素单体(TT-m；3.5毫克)与10.5毫克氧化的丙烯酰基GBMP的11KD洗脱组份在Pierce反应管中合并。加入氰基氢硼化钠(7.0毫克)，然后将混合物溶解在233微升的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.5)。溶液在37℃总共温育5天。定期地，通过分子排阻HPLC(Superose-12柱，Pharmacia)监测偶联情况，以观察随着偶联的进展向更高分子量变迁的情况。最终的偶联物在已用PBS平衡过的BioGelA.5柱上通过分级而与原料分开，然后进行透析和冻干处理。对总唾液酸(Svennerholm法)和蛋白质(BCA法，Pierce)的比色分析表明，偶联物含有12-30％唾液酸。实施例4对小鼠进行免疫一般，用一定量的相当2微克唾液酸的偶联物(0.2毫升)，通过腹膜内方式对10只雌性CF1小鼠(8-10周大小)进行免疫，可以添加或不添加佐剂如明矾(Alhydrogel，SuperfosBiosector)或RIBI完全或部分佐剂系统(RIBIImmunochem)。在最初接种后，在第21和35天进行加强免疫，然后在第45天进行放血。通过心脏穿刺术收集血液，并将血清分份储存于-86℃。实施例5杀菌测定杀菌测定是在96孔的组织培养微量滴定板(Corning)上进行的。所有的血清在使用前于56℃加热灭活30分钟。B类脑膜炎球菌(株80-165B2bp.l)在巧克力琼脂平板(QueLab)上，于37℃在5％CO2中生长过夜，然后接种于第二个平板并温育5小时。用Hank′s平衡盐溶液(Hank′sbalancedsaltsolution，HBSS)作为稀释剂，直接在平板上对抗血清进行适当的稀释，使终体积为50微升/孔。制备GBM在HBSS中的悬浮液，其O.D.(λ580)＝0.1吸光度。该悬浮液在HBSS中稀释40,000倍，得到用于分析的最终的细菌工作稀释液。将新融化的幼兔补体(Pel-FreezeBiologicals)加至每个孔中(20微升)，然后加入30微升细菌工作稀释液。然后，平板在37℃振荡培养1小时。每个孔的内含物混合后，接种于巧克力琼脂平板上(35微升)。然后将平板在37℃/5％CO2下温育过夜，对菌落形成单位(CFU)数目进行计数。相对HBSS对照孔或无关抗血清的平均值，根据下式确定杀死百分比杀死％＝(CFU对照-CFU抗血清/CFU对照)×100实施例6被动保护测定从用N-酰基GBMP-TT免疫而获得的小鼠抗血清，一般在无菌盐水或PBS(磷酸盐缓冲液)中进行稀释。给几组雌性CF1小鼠(每组5只)(8-10周大小)静脉内注射200微升稀释的抗血清。在1小时后，每组小鼠通过腹膜内注射B类脑膜炎萘瑟球菌(GMB80165B2bP.l)悬浮液(500微升；800-1200CFU/毫升)而进行攻击。在5小时后，从各小鼠中通过心脏穿刺术收获血液，然后将10微升血液接种于巧克力琼脂平板。平板在37℃和5％CO2下温育，在15-20小时后测定菌落形成单位(CFU)的数目。被动保护测定是以特异性抗体存在时细菌减少或消失为基础的，它是相对于没有特异性抗体的对照组进行测量的。由小鼠抗-N-酰基GBMP偶联物血清所提供的保护程度，用相对于无关对照抗血清或PBS时每种抗血清的CFU下降的百分比来表示。实施例7针对脑膜炎萘瑟球菌B血清群(serogroup)的疫苗的合成及其生物活性合成针对脑膜炎萘瑟球菌B血清群的新的偶联物疫苗，其设计以天然多糖的独特修饰形式为基础。天然多糖(N-AcGBMP)通过在氨基末端用N-丙烯酰基(NH-CO-CH＝CH2)完全取代N-乙酰基，对天然多糖(N-AcGBMP)进行衍生。物理方法，如1H和13C-NMR波谱分析可以确切地确定新物质的种类和均质程度，而分子排阻HPLC可显示在解聚过程中多糖分子大小没有改变。按与上述程序相似的方式，制备连于蛋白质的偶联物。简而言之，从制备N-丙烯酰基GBM多糖开始，制备2批不同的N-丙烯酰基GBMP-破伤风毒素偶联物。对两种偶联物的比色分析揭示，总唾液酸对偶联物之比分别为13％和20％。偶联物的1H-NMR揭示在蛋白质上存在未改变的修饰多糖。在各自的动物试验中，在一个例子中将N-丙烯酰基GBMP-TT偶联物与盐水、氢氧化铝，或者与RIBI′s完全佐剂(MPL+TDM+CWS)一起注射入小鼠；而在另一例子中N-丙烯酰基GBMP-TT偶联物仅与RIBI佐剂一起注射。观察表明小鼠可很好地耐对各种抗血清的血清学测试表明，两种偶联物都引发的特异性应答都相当于或高于用N-丙酰基GBMP-TT构建物和RIBI′s佐剂系统时所见的应答(见表1)。对N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清的交叉反应性的初步研究表明，它与用N-丙酰基GBMP-TT抗血清时所见的交叉反应程度相类似(见表2)。两批N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清中的一批，与同一试验中施用的N-丙酰基GBMP-TT构建物相比，对天然GBMP的交叉反应显著下降。对两批N-丙烯酰基GBMP-TT都测试了他们对活GBM的杀菌活性，结果表明相对于N-丙酰基GBMP-TT抗血清而言有明显的活性。这些结果总结于表1和3。在表1中的数据是重复进行的杀菌测试的结果，它与用相同材料进行的其他测试中的稀释度是相同的。表1的数据与丙烯酰基特别具有有效杀菌活性是相符的。表3比较了两批N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清的杀菌活性，以及在相同的动物试验中用N-丙酰基GBMP-TT抗血清获得的结果。测试使用15倍的细菌，因此仅检测出具有强活性的抗血清。从N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清与N-丙酰基GBMP-TT抗血清的比较中可看出，杀菌活性几乎相同。用不同的稀释度进行被动保护研究，所有的稀释度都显示出明显的清除情况，这暗示存在对小鼠的保护作用(见表1)。在不同稀释度下与N-丙酰基GBMP-TT抗血清的比较，给出了几乎相同的结果。在被动保护试验中，两批N-丙烯酰基-GBMP-TT抗血清的比较表明，两批对小鼠的保护情况相同(在试验误差内)(见表3)。表1试验RPV-1-63的总结，用于比较修饰的B类脑膜炎球菌多糖-破伤风毒素偶联物在不同佐剂中的性能</tables>aELISA效价被定义为O.D.×稀释度，对曲线上的3点进行平均。盐水、明矾和RIBI是产生抗血清中所用的佐剂。b杀灭50％或90％GBM80-165所需的抗-修饰的GBMP-TT/RIBI血清的倒数稀释度。数值被精确到+/-1稀释度。c相对于HBSS对照而言，在抗-修饰的GBMP-TT/RIBI血清的不同稀释度下GBM80165被清除的百分比。表2修饰的N-酰基GBMP-TT抗血清(RPV-1-63)对天然N-乙酰基GBMP抗原的交叉反应</tables>aELISA效价被定义为O.D.×稀释度，对曲线上的3点进行平均。盐水、明矾和RIBI是产物抗血清中所用的佐剂。bN-酰基表示作为包被抗原的同源多糖-人血清白蛋白偶联物。cN-乙酰基表示作为包被抗原的N-乙酰基GBMP-人血清白蛋白偶联物。表3相对于N-丙酰基GBMP-TT抗血清而言两批N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清保护性能的总结a抗血清是用RIBI佐剂系统产生的。b杀灭50％GBM870165所需的抗血清倒数稀释度。注意，相对于所述的程序使用15倍数量的GBM(2600cfu/100微升)。这导致仅可测出强杀菌抗血清的杀菌活性。c相对PBS对照而言，用1∶4稀释的各种抗血清清除GBM80165的百分比。实施例8用N-酰基修饰的GBMP-TT偶联物进行的进一步研究按基本与上述相同的方法，合成一系列的N-酰基修饰的GBM多糖(N-丙酰基GBMP(NPr)、N-丁酰基GBMP(NBu)、N-戊酰基GBMP(NPe)和N-丙烯酰基GBMP(NAcryl))，不同点在于控制pH以限制多糖的解聚。1H和13C-NMR波谱分析可完全确定修饰后多糖的种类，而且已确定每种多糖都100％得以衍生。根据在标准柱上的SEC-H-PLC曲线，产生一系列的相同分子量(11KD)的氧化的多糖片段。所有的偶联物都在完全相同的条件下合成。对偶联物的比色分析得到如下的唾液酸掺入情况NPr-28％、NBu-30％、NPe-18％、NAcryl-19％。用在盐水中吸附在氢氧化铝上的，或者乳化在RIBI佐剂上的2微克唾液酸/偶联物免疫小鼠。所有的偶联物都能被小鼠很好地耐受，没有观察到不适的症状。不同抗血清对同源多糖抗原的ELISA效价总结于表1。发现产生最高效价的佐剂是RIBI系列(从N-丙酰基至N-戊酰基依次增加)，证实了以前用其他疏水性佐剂系统得到的发现。在诸如明矾之类的佐剂系统中，并没有相应的效价增加趋势。对免疫多糖的特异性还随着酰基链(从N-丙酰基至N-戊酰基)长度的增加而提高，最明显的是在RIBI系列中(见表2)。这个结果也与以前显示相同趋势的结果相符。尽管效价和特异性增加了，但是在杀菌测试和被动产生测试中对天然杀菌的活性并没有相应增加。在50％和90％杀菌水平时，N-Pr抗血清显示出比N-Bu和N-Pe抗血清高得多的杀菌效价(高14-25倍)。相应地，对不同稀释度的抗血清的被动保护研究表明，与N-Pr抗血清不同(即使在1∶6稀释度下也有明显清除效果)，N-Bu和N-Pe只有在高浓度下才有明显的清除效价的效果。权利要求1.一种修饰的B类脑膜炎球菌多糖，其特征在于，N-乙酰基被式(I)所示的N-酰基衍生物所取代其中，R1是含有至少一个双键的C3-C4不饱和烷基。2.如权利要求1所述的多糖，其特征在于，R1有4个碳原子并且有2个非相邻的双键。3.如权利要求1所述的多糖，其特征在于，R1有4个碳原子并且有1个双键。4.如权利要求1所述的多糖，其特征在于，R1有3个碳原子。5.如权利要求2所述的多糖，其特征在于，R1是CH2＝CH-CH2-CH2。6.如权利要求3所述的多糖，其特征在于，R1是CH2＝CH2-CH2。7.如权利要求1所述的多糖，其特征在于，距酰基碳原子最远的碳原子是通过双键而连接的。8.如权利要求7所述的多糖，其特征在于，R1有4个碳原子。9.如权利要求7所述的多糖，其特征在于，R1有3个碳原子。10.一种偶联物分子，其特征在于，它具有至少一个式II多糖片段其中R2是不饱和的、具有至少一个双键的酰基，而且该片段共价地连于蛋白质。11.如权利要求10所述的偶联物分子，其特征在于，该蛋白质来自细菌。12.如权利要求11所述的偶联物分子，其特征在于，该细菌是是脑膜炎萘瑟球菌。13.如权利要求10所述的偶联物分子，其特征在于，该蛋白质来自细菌并选自下组破伤风毒素、白喉毒素、CRM197和脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)。14.如权利要求10所述的偶联物分子，其特征在于，该多糖片段是N-酰基衍生多糖，蛋白质是破伤风毒素和DMP，以及多糖片段的分子量在约3-50千道尔顿之间。15.如权利要求10所述的偶联物分子，其特征在于，该多糖片段是N-酰基衍生多糖，蛋白质是破伤风毒素，以及多糖片段的分子量为约10,000道尔顿。16.如权利要求19所述的偶联物分子，其特征在于，多糖对蛋白质的摩尔比为约20多糖和1蛋白质之间。17.如权利要求20所述的偶联物分子，其特征在于，多糖对蛋白质的摩尔比为约4-7摩尔多糖对1摩尔蛋白质。18.如权利要求10所述的偶联物分子，其特征在于，它包含N-酰基衍生片段。19.一种偶联物分子的疫苗组合物，其特征在于，它包含共价地连于蛋白质的B类脑膜炎球菌的不饱和的C3-5N-酰基衍生多糖。20.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，该蛋白质组份来自细菌并选自下组破伤风毒素、白喉毒素、CRM197和脑膜炎球菌外膜蛋白。21.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，该多糖片段是N-酰基衍生多糖，以及多糖片段的分子量在约3-50千道尔顿之间。22.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，蛋白质组份来自脑膜炎萘瑟球菌。23.一种免疫血清，其特征在于，它含有用权利要求10所述的偶联物免疫的哺乳动物所产生的抗体。24.如权利要求23所述的免疫血清，其特征在于，偶联物的多糖是不饱和的C3-5N-酰基衍生多糖的片段。25.一种针对脑膜炎萘瑟球菌和大肠杆菌K1感染而免疫哺乳动物的方法，其特征在于，给该哺乳动物施用免疫有效量的权利要求19所述的疫苗。全文摘要本发明涉及化学修饰的B类脑膜炎萘瑟球菌(Neisseriameningitidis)多糖。本发明还提供了疫苗,在该疫苗中各个修饰的多糖被偶联于蛋白质载体等。更具体地,本发明还提供了新的B类脑膜炎球菌不饱和的N－酰基衍生多糖、新的B类脑膜炎球菌不饱和的N－酰基衍生多糖偶联物、含有共价连于蛋白质的B类脑膜炎球菌不饱和N－酰基衍生多糖片段的偶联物分子的药物组合物,以及这些组合物作为疫苗的用途。文档编号A61P31/04GK1187136SQ96194582公开日1998年7月8日申请日期1996年6月7日优先权日1995年6月7日发明者H·J·詹宁斯,R·蓬尼,M·吕西耶,F·米雄申请人:加拿大国家研究院