脑膜炎球菌血清组x偶联物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2012年5月22日提交的美国临时申请号61/650,025 ;2012年9月 9日提交的美国临时申请号61/698,677 ;以及2013年3月15日提交的美国临时申请号 61/799,528的权益。前述的申请通过引用全文纳入本文用于所有目的。
技术领域
[0003] 本发明涉及细菌荚膜糖的领域，具体是脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)血清组X荚膜多糖。该多糖可与载体偶联以形成偶联物。多糖和偶联物可 用于免疫，尤其是在水性制剂中。
【背景技术】
[0004] 在抵御有荚膜细菌的疫苗中使用细菌的荚膜糖已有多年历史。然而，由于糖是T 非依赖性抗原，它们的免疫原性较弱。与载体偶联可将T非依赖性抗原转化成T依赖性抗 原，从而增强记忆反应并能发展出保护性免疫。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶联物，原型 偶联疫苗针对流感嗜血菌（Haemophilus influenzae) ( 'Hib'）[例如见参考文献86的第 14 章]。
[0005] 基于生物体的荚膜多糖，已经鉴定了脑膜炎奈瑟球菌的12种血清组（A、B、C、H、 I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。组A是非洲撒哈拉沙漠以南地区流行疾病中最常涉及的病原 体。血清组B和C是美国和大多数发达国家中的大多数病例的病因。血清组W135和Y是 美国和发达国家中剩余病例的病因。多年来已知来自血清组A、C、Y和W135的荚膜多糖的 四价疫苗[1，2]。虽然在儿童和成人中有效，但是因为多糖是诱导不能加强的弱免疫应答的 非T细胞依赖性抗原，其诱导的免疫应答弱且保护持续时间短，并且不能用于婴儿[例如参 考文献3]。该疫苗中的多糖不是偶联的[4]。针对血清组C的偶联疫苗已被批准用于人， 并且其包括Menjugate?[5]、Meningitec?和NeisVac-C ?。来自血清组A+C的偶联物的混 合物是已知的[6-8]并且已经报道了来自血清组A+C+W135+Y的偶联物的混合物[9-13]。
[0006] 自20世纪70年代以来，已知组X荚膜多糖的结构[14]并且该血清组与脑膜炎疾 病的多次爆发相关，例如，在非洲撒哈拉沙漠以南地区和中国[15，16]。在5岁以下的儿童 中，血清组X已知具有比血清组A明显高的攻击率。虽然多年来已经认识到需要针对这种 血清组的疫苗[17]，但是还没有开发出有效的疫苗。已经提出了针对血清组X的偶联物疫 苗[17,18]，但是这类偶联物是否针对该血清组有免疫原性或保护性还是未知的。
[0007] 因此，仍然存在对血清组X荚膜多糖偶联物的需求。此外，仍然存在对可用于针对 由该血清组造成的疾病的疫苗接种的偶联物的需求。
[0008] 组X荚膜多糖的结构由通过不含0-乙酰基的α 1-4磷酸二酯键[19]结合在一起 的N-乙酰葡糖胺-4-磷酸残基组成：- 4) -D-GlcpNAc- α - (1 - 0Ρ03 - }(图1)。基于遇 它们的结构相似性，已经假定MenA和MenX荚膜多糖之间的生物合成关系[14]。MenA荚膜 多糖易于在水性溶液中发生明显水解[20]。这种不稳定性被认为是由于涉及异头位的磷酸 二酯连接和甘露糖胺2位中的N-乙酰基的存在而造成的，其可有助于磷酸单酯基团的离开
[21]。另一种可能性是N-乙酰甘露糖胺亚基的4位上的羟基与磷酸二酯基团相互作用通 过内部参与机制促进水解，如在6A型肺炎链球菌[22]和B型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b) [23]的荚膜多糖中所见。在MenX和MenA荚膜多糖的结构中的相似 性，尤其是它们共有的异头磷酸二酯连接，表示在水性溶液中时，MenX多糖可能存在相似的 稳定性问题。MenA荚膜多糖在水溶液中的固有不稳定性表明当包含于疫苗（例如，在多糖 疫苗Mencevax?和偶联物疫苗MenAfriVac ?、Menveo?和Nimenrix ?)中时，其通常以冻干 形式存在。虽然MenX荚膜多糖可以相似地以冻干形式存在以改善其稳定性，但是水性制剂 是更为方便的。在水性制剂中含有MenA荚膜多糖偶联物的仅有的疫苗是Menactra?，但是 这种疫苗需要在低温下储存。这种低温储存是昂贵的并且在MenA和MenX时常爆发的许多 国家（例如，非洲撒哈拉沙漠以南地区）中存在实际困难。
[0009] 因此，存在对血清组X荚膜多糖及其偶联物的水性制剂的需求，尤其是无需冷藏 的水性制剂。
[0010] 针对MenX的疫苗的开发需要用于多糖定量的方法，其可用作加工中测试和/或用 于最终疫苗的表征。在MenX荚膜多糖中磷酸基团的存在表示可通过测量总磷含量的比色 法来定量多糖[24]。然而，这种方法缺少选择性并且因此不适于某些加工中应用，例如，磷 酸盐缓冲液中或在含磷酸盐杂质存在下的多糖分析。更有选择性的方法是NMR，其已经被 提出用于MenX多糖定量[25]。然而，这种方法要求纯的样品和大量的材料。参考文献26 证明了替代的方法，其中通过HPAEC-PAD来对MenX多糖进行定量，其比NMR更灵敏并且比 测量磷酸含量更有选择性。参考文献26的作者通过水解样品生成葡糖胺，并且将释放的葡 糖胺的量与衍生自N-乙酰基-葡糖胺-6-磷酸的定量标准物的校准曲线做比较来对MenX 多糖进行定量。然而，由于污染，可能存在葡糖胺，其产生不精确的结果。因此，存在对测量 MenX多糖的替代或改良方法，并且尤其是对MenX更有选择性的方法的需求。
【发明内容】
[0011] 本发明部分基于用于将血清组X荚膜多糖偶联至载体分子的方法。本发明的发明 人已经发现，所得的偶联物是免疫原性的并且能够诱导杀菌抗体应答。因此，血清组X偶联 物可用于免疫原性组合物，并且尤其是用于疫苗。本发明的发明人已经发现，能够将血清组 X荚膜多糖抗原，例如，血清组X偶联物与其他抗原结合而不失去针对血清组X的免疫应答。 具体地，血清组X偶联物可与其他偶联物组合，例如包含其他细菌荚膜糖抗原的偶联物。血 清组X偶联物特别适于与包含来自其他脑膜炎奈瑟球菌血清组（例如，血清组A、C、W135和 Y)的荚膜糖抗原的偶联物组合。在这些组合中，不仅血清组X偶联物保持其免疫原性，血清 组A、C、W135和/或Y偶联物也保持其免疫原性。此外，本发明的发明人也已经发现尽管 其与血清组A荚膜多糖在结构上相似，来自血清组X的荚膜多糖令人惊讶地在溶液中稳定。 因此，血清组X荚膜多糖及其偶联物特别适用于水性制剂。
[0012] 在第一方面，本发明提供了脑膜炎奈瑟球菌血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联 物。本发明的发明人已经发现可使用下述的本发明的第二方面的第一实施方式的过程来制 备血清组X荚膜多糖和载体分子的特别稳定的偶联物。例如，在37°C下28天后，偶联物可 含有低于50%的游离糖。可如下文稳定性研宄（2)所述测定游离的糖％。因此，在本发明 的第一方面内，本发明提供了在37°C下28天后包含低于50%的游离的糖的血清组X荚膜 多糖和载体分子的偶联物。偶联物可具体包含低于25%的游离的糖，尤其是低于20%的游 离的糖并且更具体地低于15%的游离的糖，例如，约10%的游离的糖。
[0013] 在第二方面，本发明提供了用于制备血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物的方 法，尤其是下述第一、第二和第三实施方式的方法。第二方面也提供了下述的第四实施方式 的方法。通常通过这些方法之一得到或可得到本发明的第一方面的偶联物。然而，可通过 任意合适的方法替代性地制备第一方面的偶联物。当通过这些其他方法之一制备本发明的 偶联物时，该方法通常不包括以下步骤中的一个或两个：a)将多糖与接头偶联，以形成多 糖-接头中间体，其中接头的游离末端是酯基团，尤其是其中偶联间接地发生，即采用额外 的接头，该接头用于在偶联到接头上之前对多糖衍