用于治疗或预防草酸盐相关疾病的组合物和方法
【专利说明】用于治疗或预防草酸盐相关疾病的组合物和方法
[0001]本申请是国际申请日2005年6月15日、国际申请号PCT/US2005/021134于2007年I月17日进入中国国家阶段、申请号200580024172.1、发明名称“用于治疗或预防草酸盐相关疾病的组合物和方法”的申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请是2003年9月24日提交的在审美国申请10/671,299的部分继续；其是2002年3月8日提交的美国申请10/093,686的继续；其是2000年2月9日提交的美国申请09/500，500的继续；其要求1999年8月23日提交的美国临时申请60/150，259的优先权，并且其是1998年5月22日提交的在审美国申请09/083，362的部分继续，其要求1997年5月23日提交的美国临时申请60/047，473的优先权。
技术领域
[0004]本发明涉及用于治疗和预防草酸盐相关病症的组合物和方法。尤其是，本发明涉及包含降解草酸盐或还原草酸盐的细菌和酶的组合物和方法。
【背景技术】
[0005]肾-尿路结石疾病(尿石病)是全世界范围的主要健康问题。大多数与尿石病有关的结石由单独的草酸钙组成，或者由草酸钙加上磷酸钙组成。其它疾病状态也被证实与过量的草酸盐有关。包括慢性阴部疼痛(vulvodynia)，与晚期肾病有关的草酸过多症，心脏传导失调，克罗恩氏病及其它肠衣疾病。
[0006]草酸和/或其盐，草酸盐存在于多种食物中，因此是人和动物膳食的许多组分的成分。在食用了含有增加量的草酸的食物后可能发生草酸盐吸收的增加。诸如菠菜和食用大黄的食物公知含有高含量的草酸盐，但是大量其它食物和饮料也含有草酸盐。因为草酸盐存在于如此多样的食物中，因此草酸盐含量低并且同时还可口的膳食难以配制出来。此外，依从低草酸盐膳食常常也是有疑问的。
[0007]内源性草酸盐也由正常组织酶代谢产生。包括可以吸收的膳食草酸盐的草酸盐以及代谢产生的草酸盐不会被组织酶进一步代谢并且因此必须被排出体外。这样的排泄主要经肾进行。肾液中草酸盐的浓度非常关键，草酸盐浓度的增加会引起高危形成草酸钙晶体，并随后由此形成肾结石。
[0008]肾结石的高危形成围绕着大量目前尚未完全明白的因素。肾或尿路结石疾病发生在西方国家多至12 %的人群中，并且约7 O %的结石由草酸钙或草酸钙加上磷酸钙组成。一些个体(例如，患有诸如克罗恩氏病，炎症性肠病或脂肪痢以及进行过空肠回肠(jejunoileal)分流外科手术的病人)在其膳食中比其他来源吸收更多的草酸盐。对于这些个体，草酸盐尿石病的发病率明显增加。发病率的提高是由于肾和尿液中草酸盐水平的增加，并且人的这样最普遍的高草酸尿综合症被称为肠源性高草酸尿。草酸盐也是晚期肾病病人的难题并且最近有证据(Solomons，C.C.，Μ.H.Melmed，S.M.Heitler
[1991] "Calciumcitrate for vulvar vestibulitis〃Journal of Reproductive Medicine 36: 879-882)尿草酸盐的升高也与外阴前庭炎(慢性阴部疼痛)有关。
[0009]降解草酸盐的细菌已经分离自人的粪便(Allison M.J.，H.M.Cook，D.B.Milne,S.Gallagher, R.V.Clayman
[1986]^Oxalate degradat1n by gastrointestinalbacteria from humans"J.Nutr.116: 455-460)。这些细菌类似于草酸盐-还原细菌，这些草酸盐还原细菌分离自大量动物品种的肠渣(Dawson，K.A.，M.J.Allison,P.A.Hartman
[1980]〃I so Iat 1n and some characteristics of anaerobicoxalate-degrading bacteria the rumen〃Appl.Environ.Microb1l.40:833-839 ；Allison，M.J.，Η.M.Cook
[1981]"Oxalate degradat1n by microbes of the largebowel of herbivores: the effect of dietary oxalate〃Science 212: 675-676 ；Daniel，S.L.，P.A.Hartman，M.J.Allison
[1987]"Microbial degradat1n of oxalatein the gastrointestinal tracts of rats〃Appl.Environ.Microb1l.53:1793-1797)。这些细菌不同于以前描述的生物体并且已经产生了一个新种和一个新属命名(Allison，M.J.，K.A.Dawson, ff.R.Mayberry, J.G.Foss
[1985] ^Oxalabacter formigenes gen.nov.，sp.nov.； oxalate-degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinaltract〃Arch.Microb1l.141:1-7)。
[0010]并不是所有人在他们的肠道中均携带0.formigenes菌群(Allison，M.J.，S.L.Daniel, N.A.Comick
[1995]"Oxalate-degrading bacteria〃In Khan, S.R.(编辑.)，Calcium Oxalate in B1logical Systems CRC Press ;Doane，L.T.，M.Liebman，D.R.Caldwell
[1989]"Microbial oxalate degradat1n: effects on oxalate andcalcium balance in humans^Nutrit1n Research 9:957-964)。在进行过回肠空肠分流外科手术的人的粪便样品中只具有低浓度的草酸盐降解细菌或完全缺乏草酸盐降解细菌(Allison 等
[1986] 〃0xalate degradat1n by gastrointestinal bacteria fromhumans〃J.Nutr.116: 455-460)。同时，某些人和动物可以维持0.formigenes的菌落，但是因为不能清楚明白的理由仍然具有过量水平的草酸盐。
[0011]目前需要治疗人和动物减少它们体内的草酸盐水平，由此治疗或预防草酸盐相关疾病的方法。合乎需要的方法包括施用还原草酸盐的组合物。
[0012]发明概述
[0013]本发明包括治疗和预防草酸盐相关病症的组合物和方法。本发明的组合物包含可以降低草酸盐的微生物以及包含还原草酸盐的酶的组合物。本发明的方法包含施用该组合物治疗或预防草酸盐-相关的病症。一个实施方案包括通过降低肠道中草酸盐的量降低发展草酸盐-相关的失调的危险的方法。肠道中的这种降低导致系统草酸盐水平的减少由此促进身体健康。
[0014]在一个本发明的实施方案中，通过向肠道补充草酸盐-降解细菌实现草酸盐吸收的减少。在优选的实施方案中，这些细菌是Oxalobacter formigenes.。这些细菌使用草酸盐作为生长底物。这样的利用降低了肠中可溶性草酸盐的浓度，由此降低了用于吸收的草酸盐的量。肠道中草酸盐的降低还可以从循环系统除去草酸盐。本发明的方法预计可以全面降低个体体内草酸盐的量。
[0015]在特定的实施方案中，本发明提供了向处在患草酸盐-相关疾病高危中的人的肠道递送0.formigenes的方法和组合物。这些细菌及其子代在肠中复制并从肠道除去草酸盐，由此降低可用于吸收的草酸盐的量并引起从血液向肠中排泄草酸盐的提高。
[0016]根据本发明的教导，除了利用草酸盐作为底物的0.formigenes,降解草酸盐的微生物也可用于实现治疗性的草酸盐降解由此降低患尿石病及其它草酸盐-相关疾病的危险。这样的其它微生物可以是，例如，诸如梭状芽孢杆菌或假单胞杆菌的细菌。另外，本发明包括用于给可用于将最初不能分解草酸盐的天然微生物转化成能够还原草酸盐的微生物的微生物提供赋予草酸盐还原功能的外源多核苷酸的方法和组合物。
[0017]在本发明的一个实施方案中，组合物包含用于降解草酸盐产生使这些微生物能够降解草酸盐的酶的微生物。在其他的实施方案中，该组合物可以包含用使转化的微生物能够降解草酸盐的多核苷酸序列转化的微生物。编码草酸盐-还原基因的多核苷酸序列包括在本发明的范围内。编码草酸盐还原微生物，诸如细菌或真菌中发现的酶或其它草酸盐-还原酶的多核苷酸序列可用于本发明的方法中。多核苷酸可被用来转化细胞使细胞具有比天然存在的草酸盐还原微生物更高的草酸盐-还原活性，相同的草酸盐-还原活性，或者更低的草酸盐-还原活性。多核苷酸也可用于合成的或者离体系统来提供具有草酸盐还原活性的蛋白。
[0018]甲酰基-CoA转移酶和草酰-CoA脱羧酶已经被确定为在草酸盐降解中起作用。用于本发明的方法和组合物中的酶包括但不限于甲酰基-CoA转移酶，草酰-CoA脱羧酶，草酸盐氧化酶，草酸盐脱羧酶及其它酶，辅因子，以及辅酶，取代草酸盐降解途径或者参与草酸盐代谢途径，尤其是草酸盐还原。
[0019]在本发明的一个实施方案中，合适的宿主可以用编码这些酶或者相关活性的酶由此使转化的宿主能够增加草酸盐降解的外源多核苷酸转化。宿主可以是，例如，尤其最适宜于口服和/或定殖于肠的微生物。或者，宿主可以是一旦转化将产生所需的酶活性，由此当消耗该植物材料时使这些活性可以被肠利用的植物。或者，转化的植物可以具有较低量的草酸盐，任选地由于由转化提供的蛋白的作用，由此当消耗时，植物将不向膳食提供与未转化的植物一样多的草酸盐。
[0020]本发明也包括用于用草酸盐降解或者草酸盐-还原酶转化的植物的方法和组合物，其中这些植物具有对真菌提高的抗性，所述真菌需要草酸盐用于使植物致病或者产生草酸使植物致病。
[0021]本发明还包括含有用于降低草酸盐水平以便治疗或者预防草酸盐相关病症的酶的方法和组合物。例如，通过施用起降解草酸盐作用的酶实现。这些酶可以是分离和纯化的或者可以作为细胞裂解物施用。细胞裂解物可以由具有草酸盐-还原功能的微生物，例如0.formigenes制成。在特定的实施方案中，施用的酶是本发明的一种或多种酶，诸如但不限于草酸盐脱羧酶，草酸盐氧化酶，甲酰基-CoA转移酶和草酰-CoA脱羧酶。任选地，可以施用改进酶活性的其他因子。这些其他因子可以是例如，草酰CoA，MgCljP TPP(硫胺素二磷酸，维生素B1的活性形式)。包括酶的组合物包含一或多种酶，和任选地，辅因子，辅酶及其它分别或者组合加强酶活性的因子。
[0022]在本发明的一个实施方案中，通过施用由重组微生物诸如大肠杆菌产生的草酸盐-降解酶实现草酸盐水平的降低，所述大肠杆菌已经被转化表达草酸盐-降解酶。重组宿主可以活的或者非-活的形成施用。本发明进一步的方面涉及用于口服的药物组合物和/或营养增补剂。这些组合物释放草酸盐降解微生物或者草酸盐降解酶到人或者动物的肠内。本发明的组合物包含药用的制剂。例如，本发明的方法和组合物包含向预定位置提供组合物，诸如向受体的肠递送组合物的剂量输送系统。本发明的组合物可以作为食物诸如，牛奶，肉和酸奶的成分施用。
[0023]在本发明进一步的实施方案中，在缺乏草酸盐-降解细菌的驯养，农业或者外来动物中通过分别或者组和施用草酸盐-降解微生物，植物和酶实现草酸盐吸收的下降。
[0024]