还原酶的草酸盐降低组合物的食物不局限于包含微生物的那些食物，而是包括所有可以添加活性酶的食物源。通常被认为是食物材料的材料可以用作酶的载体材料，以便酶在食物的所有生产或者生长阶段，或者由人或者动物消化的所有阶段对存在于食物中的草酸盐或者存在于肠中的草酸盐有活性。
[0052]在更进一步的实施方案中，本发明提供了新型的酶递送系统。该系统包括已经转化有异源多核苷酸表达草酸盐降解酶的植物。该表达酶的转基因植物可以作为例如沙拉的组分施用于病人。此外，表达酶的植物可以作为例如饲料的组分施用给动物，或者生长在牧场中。可以喂给这些产物的动物包括，例如，牛，猪，狗和猫。
[0053]由此，作为向肠施用的替代方法，对植物进行遗传工程化来表达草酸盐降解酶。这些转基因植物被添加到膳食中，酶的活性引起草酸盐的下降。编码这些酶的DNA序列是本领域已知的，例如描述在WO 98/16632中。
[0054]除可以用作膳食的组分促进人或者动物体内健康草酸盐的水平的植物之外，本发明提供了对微生物感染具有增强的抗性的植物。具体地，本发明的转化的植物可以抗需要或者利用所存在的草酸盐对植物致病的微生物。本发明被转化表达草酸盐降解酶的植物抗例如某些需要草酸盐致病的真菌。编码酶的基因可以被修饰提高在植物中的表达和/或稳定性。同时，表达可以在指导在特定组织中表达的启动子的控制下。
[0055]在一个实施方案中，根据本发明使用的细菌，例如0.formigenes的菌株是分离自已经用来自正常人或者为动物时，来自正常动物的肠渣的稀释物接种的厌氧培养物的纯培养物。可以使用包含可以检测草酸盐降解菌落的包含专用的草酸钙的培养基。在一个实施方案中，每个菌株的纯度可以通过利用至少2个随后的重复克隆步骤进行确认。
[0056]根据本发明使用的0.formigenes菌株已经基于若干检验进行了表征，包括:细胞脂肪酸图谱，细胞蛋白质图谱，DNA 和 RNA(Jensen，N.S.，M.J.Allison(1995) "Studieson the diversity among anaerobic oxalate degrading bacteria now in thespecies Oxalobacter formigenes〃Abstr.to the General Meeting of the Amer.Soc.Microb1l.，1-29)，和对寡核苷酸探针的应答(Sidhu等，1996)。已经描述了 2组这样的细菌(I和II组，均存在于目前种的描述中)。所使用的菌株是基于草酸盐降解能力，以及定殖于人肠道的能力的证据进行选择的。所选的菌株包括I以及II组的种的代表。
[0057]本发明的一个实施方案中包括选择，制备以及向多种受试者施用合适的草酸盐-降解细菌的方法。主要但不是排他地，这些是在他们的肠中没有这些细菌的人或者动物。利用即使在混合细菌群落中，诸如肠渣中发现的相对低浓度的生物体，也可以快速并且明确检测到0.formigenes的检验可以鉴定这些没有被定殖或者只被微弱定殖的人或者动物。本发明的方法还可以用于治疗由于例如抗生素治疗或者手术后的情况耗尽了草酸盐-降解细菌的个体或者动物。本发明的方法还可以用于治疗具有草酸盐-降解细菌的菌落但是仍然由于例如，草酸盐敏感性和/或过量产生内源草酸盐具有不健康草酸盐的水平的个体或者动物。
[0058]根据本发明可以使用的细菌可以由至少两种方法进行鉴定:
[0059]I)可以使用这些细菌的特异性寡核苷酸探针；和/或
[0060]2)其中接种具有1mM草酸盐的厌氧培养基并在37°C培养I至7天后的培养物检验，确定草酸盐的损失。
[0061]0.formigenes菌株的纯培养物可以在大发酵罐中分批培养并利用本领域技术人员公知的技术收获。来自选择的单个或者或者已知菌株的混合物的细胞可以根据需要进行处理(例如与海藻糖或者甘油冻干)来保存活力然后置于设计用来保护细胞通过传代到达酸性胃的胶囊(肠溶包衣的胶囊)中。
[0062]根据个体需要确定的量和间隔摄取细胞。有时候，单个或者周期利用可能都需要，在其它情况下可能只需要定期摄取(例如，与饮食一起)。
[0063]本发明更进一步涉及给人或者动物肠道施用从草酸盐降低生物体诸如
0.formigenes细胞或者其他来源制备的草酸盐-降解产物或者酶，或者通过诸如重组体手段的方法。在一个实施方案中，可以纯化草酸盐降解酶并制备成用于经口消耗的药物或者营养组合物。在优选实施方案中，这些酶是重组产生的。编码这些酶的DNA序列是本领域已知的，例如描述在WO 98/16632中。这些序列，或者其他的编码草酸盐-降解蛋白质的序列可以表达在合适的宿主中。宿主可以是例如E.coli或者乳酸杆菌。转化的宿主将包括合适的调节和运输信号。可以如本文所述分离，纯化和施用表达的蛋白质。或者，可以施用表达所需的草酸盐降解蛋白质的重组体宿主。重组体宿主可以活或者非活的形式施用。在另一优选实施方案中，酶是有涂层的或者配制或者修饰成保护酶，使其在胃中不失活，并且在小肠中发挥其草酸盐降解活性。这样的制剂的实例是本领域已知的，例如描述在美国专利 5，286，495 中。
[0064]在这里使用的草酸盐降解酶包括所有参与草酸盐途径的酶，并且包括但不局限于草酸盐氧化酶，草酸盐脱羧酶，甲酰基CoA转移酶和草酰-CoA脱羧酶。草酸盐氧化酶表达在高等植物中，并催化草酸盐氧依赖的氧化至C02，同时伴随H2O2的形成。草酸盐氧化酶纯化自许多来源，例如大麦苗根和叶；甜菜茎叶；小麦胚芽；高粱叶；和香蕉皮。已经开发了用于从大麦根获得草酸盐氧化酶的快速三步纯化方法。已经克隆，测序并表达了编码大麦根草酸盐氧化酶的基因。
[0065]草酸盐脱羧酶主要存在于真菌中。最近已经报到了在B.subtilis中的细菌草酸盐脱羧酶并由yvrk基因编码。草酸盐脱羧酶催化游离草酸盐降解成CO2和甲酸盐。这些酶已经报道在若干真菌中，包括统孢漆斑菌(Myrothecium Verrucaria)，黑曲霉的某些菌株和白腐真菌，云芝。编码金针燕(Flammulina velutipes)草酸盐脱羧酶的基因已被克隆并测序；参见WO 98/42827。
[0066]草酰-CoA脱羧酶在CoA-激活的底物上有活性并将其转化成甲酰基_CoA。然后甲酰基CoA转移酶起作用交换CoA上的甲酸盐和草酸盐。在草酸盐降解细菌，存在于土壤中的Pseudomonas oxalaticus和残留在包括人的脊椎动物胃肠道中的Oxalobacterformigenes中对这些酶进行了研究。0.formigenes已经显示出与其宿主通过调节肠中吸收的草酸以及血浆中的草酸水平为共生关系。缺少这些细菌已经被认为是草酸盐有关的紊乱，例如复发性的自发草酸钙尿石病和回肠空肠分流手术继发的肠源性的高草酸尿和炎症性肠病的危险因素。
[0067]描述多种草酸盐-降解酶和编码这些酶的基因的专利包括美国专利5，912，125 ；6，090，628和6，214，980。这些专利在此处全文引入作为参考，与具体引用一样。术语草酸盐-降解酶包括但是不局限于草酸盐氧化酶，草酸盐脱羧酶，草酰-CoA脱羧酶和甲酰基CoA转移酶，并且包括能够与草酸盐或者草酸相互作用的酶。这些酶可以源自于天然源或者使用本领域已知的重组方法合成的，并且包括诸如结合部位，活性部位或者能够与草酸盐或者草酸相互作用的片段的所有的片段。这个术语还包括但是不局限于所有必需的辅因子，辅酶，金属，或者酶与草酸盐或者草酸相互作用必需的结合或者基质材料。本发明还包括这些酶的所有的结合伴侣并且包括结合于或者与酶相互作用的抗体和抗体片段。
[0068]0.formigenes的使用尤其有利，因为它是不在需氧组织环境中生长并且不产生对人和动物有毒性的化合物的厌氧菌。作为0.formigenes或者重组宿主的替代，可以使用其它草酸盐降解细菌，诸如梭菌，枯草芽孢杆菌，假单胞菌，乳酸杆菌，双歧杆菌。可以施用从这样替代性的细菌制备的草酸盐降解酶或者可以施用整个微生物。
[0069]此外，上述的实施方案适用于驯养，农业或者动物园饲养的缺乏草酸盐降解细菌的动物以及人类。例如，草酸盐-降解酶和/或微生物可以施用于宠物，诸如狗，猫，兔，雪紹，豚鼠，仓鼠和沙土鼠以及农用牲畜，诸如马，羊，牛和猪，或者用于育种目的的野生动物，诸如水獭。许多能够降低草酸盐的动物当被捕获时就丧失了降低草酸盐的能力。本发明包括恢复丧失或者还原草酸盐还原活性的方法和组合物。本发明的一个方面包括用本发明教导的组合物处理从野外获得的丧失或者降低了草酸盐还原活性的动物。
[0070]本发明包括用于向人或者动物的胃肠道施用包括一或多种草酸盐-降解细菌，一或多种酶，或者细菌和酶的组合的组合物的组合物和方法。这样的组合物和方法可有效降低草酸盐的量和/或浓度。这样的方法和组合物可有效治疗和预防草酸盐相关的病症。本发明的一个方面包括用于将草酸盐-降解酶导入人或者动物的胃肠道的组合物和方法。本发明包括向人或者动物的胃肠道递送一或多种草酸盐-降解酶作为药物和/或营养载体组合物的方法。这样的酶包括但不限于草酸盐氧化酶，草酸盐脱羧酶，-CoA脱羧酶和甲酰基CoA转移酶。这些酶可以获自本领域公知的来源。例如，植物酶，草酸盐氧化酶(0X0)可以纯化自大麦幼苗，草酸盐脱羧酶可以纯化自细菌或者真菌来源。
[0071]或者，可以通过重组法衍生草酸盐降解酶。例如，诸如克隆，表达和纯化的重组法可用来获得草酸盐还原酶，例如枯草芽孢杆菌草酸盐脱羧酶。这样的重组方法是本领域公知的。例如，通常公开的是枯草芽孢杆菌草酸盐脱羧酶(YvrK)基因的克隆和表达:草酸盐脱羧酶蛋白(YvrK)的基因已经被克隆到pET-9a和pET-14b质粒(Novagen，WI)中，在强噬菌体T7启动子的控制下，用于过表达可溶性cytosolic蛋白。表达宿主是E.coli菌株BL21 (DE3)pLysS，缺乏蛋白酶并且含有在lacUV5控制下的T7-RNA聚合酶基因的染色体拷贝的λ DE3溶源菌。此外，该菌株携带编码Τ7溶菌酶的ρΕΤ-相容的质粒，所述Τ7溶菌酶是切割细胞壁肽聚糖层中的键并抑制T7RNA聚合酶的双功能酶。能够更有力的控制未诱导的基态表达并使用破裂内膜的方法，诸如冻融，或者温和洗涤剂，等等，来有效地裂解细胞。通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导基因产物的表达。因此，本发明的一个方面包括含有施用已经通过重组微生物产生的草酸盐降解酶的方法。可以使用多种表达载体和宿主来产生作为重组蛋白的草酸盐降解酶，并且这样的方法是本领域技术人员已知的。
[0072]本发明的另一个方面包括通过给人或者动物的胃肠道补充草酸盐-降解细菌降低草酸盐吸收的方法。这样的细菌可以包括但不限于Oxalobacter formigenes，梭菌，乳酸杆菌，双歧杆菌以及假单胞菌。0.formigenes已经分离自人奠便样品并通过选择单个菌落被克隆。包括最初由Dr.Milton Allison在1996的Ix1n生物技术获得的分离物HC-10例如，可以使用人菌株HC-1的冷冻原种。本发明的方法包含使肠富集一或多种草酸盐降解细菌，总体降低肠渣中的草酸盐，降低肠中吸收的草酸盐，降低血液和肾液中的草酸盐浓度并降低由于草酸盐的存在对身体的有害作用。
[0073]因此，本发明一个方面包括补充草酸盐-还原细菌和草酸盐降解酶的组合物和方法，所述还原细菌和草酸盐降解酶可以降低具有草酸盐-相关疾病和/或病症的高危人肠道中的草酸盐。这样的疾病和病症包括但不限于高草酸尿，原发性高草酸尿，自发草酸钙肾结石疾病(尿石病)，肠源性高草酸尿，慢性阴部疼痛，与晚期肾病有关的草酸过多症，心脏传导失调，炎症性肠病，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，进行回肠空肠分流外科手术的人，具有不充分浓度的草酸盐降解细菌的人，及其它肠疾病。进行抗生素治疗，化学治疗或者其它治疗改变了肠内菌丛