一种h7n9重组流感病毒灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种H7N9重组流感病毒灭活疫苗的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 流感是流行性感冒的简称，是由流感病毒引起的人兽共患传染性疾病，人感染后 主要表现症状为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器 衰竭导致死亡，病死率很高；2013年4月以来发生的H7N9亚型流感，已对人、禽造成巨大威 胁。目前，主要采用疫苗进行预防，所用疫苗包括病毒灭活疫苗、减毒疫苗、重组亚单位疫苗 等。
[0003] 流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白覆盖，一型为血细胞凝集素（即H)，一型为 神经氨酸酶（即N)，H又分16个亚型，N分9个亚型。此次新出现的H7N9亚型流感属于禽 源由HA7和NA9与H9N2亚型6个内部片段重组形成。对人禽均有巨大威胁。
[0004] 在针对禽流感H7N9病毒的疫苗研宄方面，现有技术中尚未见良好疗效的针对 H7N9亚型的粘膜免疫疫苗，更未有良好疗效的针对H7N9亚型病毒的多表位粘膜免疫疫苗， 面对可能的禽流感H7N9病毒感染的流行，人们迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防禽流 感。
【发明内容】
[0005] 针对【背景技术】所存在的技术问题，本发明目的在于提供一种H7N9重组流感病毒 灭活疫苗的制备方法，该方法制备得到的疫苗能预防H7N9亚型禽流感病毒的感染。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种H7N9重组流感病毒灭 活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)禽流感工作种子批毒种的建立：将来自于A/Anhui/01/2013的H7N9亚型禽流 感病毒株HA、NA序列合成后，通过反向遗传技术救获H7N9/PR8重组流感病毒，检测其遗传 稳定性，接种10日龄的SPF鸡胚，建立H7N9亚型禽流感疫苗主代种子批毒种，从该禽流感 主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种；
[0008] ⑵病毒接种与培养：于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔接种稀释为Kr4-KT稀释度 的H7N9重组禽流感工作种子批毒种，每胚0.1 ml ;将鸡胚置35-37°C培养40-72小时；挑选 活胚置4°C冷胚15-20小时，收获病毒尿囊液；
[0009] (3)病毒灭活：将获得的病毒尿囊液中加入0. 1 %甲醛在37°C下灭活36-72小时， 并将灭活毒在10日龄的SPF鸡胚中盲传3代，检测鸡胚尿囊液HI检测均为阴性为灭活合 格；
[0010] (4)病毒收获液过滤与浓缩：将灭活后的尿囊液进行过滤，即经IOum滤膜粗滤后， 再经0. 45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为500K的超滤膜进行过滤和浓缩，最 后用0· Olmol/L的PBS浓缩，浓缩液中再加入0· 25mol/LPB回收病毒液；
[0011] (5)病毒纯化：鹿糖速率区带离心：分别用30%和60%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以 100000g/min的速度离心4小时；
[0012] (6)去糖，用相对分子质量为300K的超滤膜进行过滤、去糖，加入0.0 lmol/L PBS 回收病毒液；
[0013] (7)半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素 HA蛋白含 量为120ug/ml (总蛋白浓度约360ug/ml)，再加入2. 4mg/ml的氢氧化错佐剂，混勾后于 20-25°C搅拌吸附4小时，即配制成H7N9禽流感病毒灭活疫苗的半成品。
[0014] 本发明的技术方案还包括：步骤（5)中，病毒纯化的具体过程为：当区带离心转速 达到3000rpm/min时，泵入病毒液、30%蔗糖及60%蔗糖，并加入PBS作为封闭液，进样完 毕，再调节机器转速至l〇〇〇〇〇g/min，离心4小时。
[0015] 本发明的有益效果体现在：依据本发明方法制备的H7N9型重组流感灭活疫苗免 疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的 应用价值。
【附图说明】
[0016] 图1是H7N9/PR8AH (灭活疫苗）免疫3W SPF鸡14d，21d，28d抗体水平（HI)的示 意图；
[0017] 图2是rAd-HA7AH免疫3W SPF鸡14d，21d，28d抗体水平（HI)的示意图；
[0018] 图3是rAd-HA7AH免疫3W SPF鸡14d，21d，28d抗体水平（HI)的示意图。
[0019]
【具体实施方式】 为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体 实施方式，进一步阐述本发明。
[0020] 实施例一：
[0021] 本实施例的禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤：将H7N9禽流感重组 病毒接种10日龄的SPF鸡胚，建立禽流感主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中 选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种。
[0022] 将上述制得的H7N9禽流感工作种子批毒种用灭菌PBS稀释为KT5稀释度，接种于 10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔，病毒接种量为0.1 ml/胚，将鸡胚置35°C培养40小时；挑选活 胚置4°C冷胚15小时，收获病毒尿囊液。
[0023] 将获得的病毒尿囊液中加入0. 1 %甲醛在37°C下灭活36小时；将灭活后的尿囊 液进行澄清过滤，即经IOum滤膜粗滤后，再经0· 45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子 质量为500K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0. 01m〇l/L的PBS浓缩，浓缩液中再加入 0. 25mol/L PBS回收病毒液。
[0024] 再分别用30%和60%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以100000g/min的速度离心3小 时进行病毒纯化；其中，纯化的具体过程为：将空区带离心转头先放入离心机，选择区带离 心功能并启动，当区带离心转速达到3000rpm/min时，打开离心机仓门，放上上样头，开始 上样，从进样口的边孔以50ml/min的泵流速先后加入单型病毒液样品、30 %蔗糖和60 %蔗 糖，其中30%蔗糖的加入量为病毒样品量的1/2,60%蔗糖的加入量为将区带离心转头加 满使有少数液体从中孔留出为止，改变泵的方向，从中孔以相同速度加入PBS作为封闭液， 上样完后，取出上样头，关闭仓门，离心开始。4h后，待离心转速降至3000rpm时，打开离心 机仓门，并在出口处连接紫外分光光度检测仪测定病毒液流出的OD值。
[0025] 由于过滤浓缩后的病毒液中仍含有许多物质，随着病毒液的流出可以看到紫外分 光仪OD值的变化。以OD值变化范围为单位收集病毒液，进行相应血凝效价、卵清蛋白含 量、内毒素检测，以确定合适的用于制备流感裂解灭活疫苗的病毒液所对应的紫外分光仪 OD值区间，同时记录单位时间出样的OD值进行检测，寻找规律用于今后大量生产时直接收 集相应OD值区段的纯化病毒液。最后分区段收集病毒液并分别测定血凝效价、卵清蛋白含 量、内毒素检测，收集血凝效价高，卵清蛋白含量和内毒素低的病毒液合并。
[0026] 将上述纯化后的病毒液加入等量的终浓度为0. 3%的Triton X-100,混匀后置 20°C下作用2小时，再加入甲醛在2°C下灭活24小时，制得裂解液；将制得的裂解物用相对 分子质量为100K的超滤膜超滤浓缩10倍，去除蔗糖和大部分裂解剂；再用0.0 lmol/L的 PBS浓缩20倍，最后用蔗糖密度梯度离心进行纯化，并收集各区段病毒液，进行血凝滴度、 卵清蛋白和内毒素含量测定；其中，蔗糖密度梯度离心是在l〇〇〇〇〇g/min的条件下离心1小 时，制得病毒纯化液；将病毒纯化液用〇. 2um孔径的滤膜过滤即为单价原液；根据所配制的 半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为120ug/ml，再加入2. 4mg/ml的氢氧化铝佐剂， 混匀后于20°C搅拌吸附4小时，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品。
[0027] 将上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，冻干、真空压塞和轧盖，制得冻干疫苗成 品，并于2-8 °C冷库保存。
[0028] 实施例二：
[0029] 禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤：将H7N9禽流感重组病毒接种10 日龄的SPF鸡胚，建立禽流感主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效 价高的毒种作为工作种子批建立毒种。
[0030] 将上述制得的H7N9禽流感工作种子批毒种用灭菌PBS稀释为KT7稀释度，接种于 10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔，病毒接种量为0.1 ml/胚，将鸡胚置37°C培养72小时；挑选活 胚置4°C冷胚20小时，收获病毒尿囊液。
[0031] 将获得的病毒尿囊液中加入0. 1 %甲醛在37°C下灭活72小时；将灭活后的尿囊 液进行澄清过滤，即经IOum滤膜粗滤后，再经0· 45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子 质量为1000K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.0 lmol/L的PBS浓缩，浓缩液中再加入 0. 25mol/L PBS回收病毒液。
[0032] 再分别用30%和60%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以100000g/min的速度离心4小 时进行病毒纯化；其中，纯化的具体过程为：将空区带离心转头先放入离心机，选择区带离 心功能并启动，当区带离心转速达到3000rpm/min时，打开离心机仓门，放上上样头，开始 上样，从进样口的边孔以50ml/min的泵流速先后加入单型病毒液样品、30 %蔗糖和60 %蔗 糖，其中30%蔗糖的加入量为病毒样品量的1/2,60%蔗糖的加入量为将区带离心转头加 满使有少数液体从中孔留出为止，改变泵的方向，从中孔以相同速度加入PBS作为封闭液， 上样完后，取出上样头，关闭仓门，离心开始。4h后，待离心转速降至3000rpm时，打开离心 机仓门，并在出口处连接紫外分光光度检测仪测定病毒液流出的OD值。
[0033] 由于过滤浓缩后的病毒液中仍含有许多物质，随着病毒液的流出可以看到紫外分 光仪OD值的变化。以OD值变化范围为单位收集病毒液，进行相应血凝效价、卵清蛋白含 量、内毒素检测，以确定合适的用于制备流感裂解灭活疫苗的病毒液所对应的紫外分光仪 OD值区间，同时记录单位时间出样的OD值进行检测，寻找规律用于今后大量生产时直接收 集相应OD值区段的纯化病毒液。最后分区段收集病毒液并分别测定血凝效价、卵清蛋白含 量、内毒素检测，收集血凝效价高，卵清蛋白含量和内毒素低的病毒液合并。
[0034] 将上述纯化后的病毒液加入等量的终浓度为0. 3%的Triton X-100,混匀后置 20°C下作用2小时，再加入甲醛在2°C下灭活24小时，制得裂解液；将制得的裂解物用相对 分子质量为100K的超滤膜超滤浓缩10倍，去除蔗糖和大部分裂解剂；再用0.0 lmol/L的 PBS浓缩20倍，最后用蔗糖密度梯度离心进行纯化，并收集各区段病毒液，进行血凝滴度、 卵清蛋白和内毒素含量测定；其中，蔗糖密度梯度