一种重组流感病毒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组流感病毒及其应用。本发明提供了一种制备重组病毒的方法，包括如下步骤：将HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部6个基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS共同导入宿主细胞，包装，即得到重组病毒。本发明公开了利用该类重组病毒检测抑制季节性流感N1、N2、2009H1N1N1、2013H7N9N9酶活抗体的检测方法，包括样本处理、结果分析。该发明能快速有效的测定人群对NA免疫应答，操作简单、应用方便，为临床检测、疫苗评估提供了可行的技术支持。
【专利说明】-种重组流感病毒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种重组配流感病毒及其应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒为正粘病毒科，为分节段负链RNA病毒。根据病毒的核蛋白（NP)和基质 蛋白（M)不同分为甲型、乙型、丙型。甲型流感具有高度变异、广泛的感染宿主范围，对公众 健康的威胁最大。根据病毒表面的血凝素（HA)甲型流感病毒又分为HA1-16亚型，依据神 经氨酸酶NA分为NA1-9亚型。目前在人群中流行的甲型流感病毒主要有H1、H2、H3及N1、 N2亚型，近年来感染人的新型流感病毒2009H1NUH7N9禽流感病毒，前者造成流感大流行， 后者的致死率达27. 2%。这些NA能否诱导机体免疫应答，能否用于无症状隐性感染的筛查 指标尚不明确。
[0003] HA、NA糖蛋白在病毒感染、复制过程中起着重要作用，也是重要抗原，能刺激机体 产生中和性保护抗体。抗HA抗体是目前用于评估流感疫苗有效性的重要指标，尽管抗NA抗 体能减轻临床症状，但既往基于β甲醛丙酮酸的生色反应，由于使用试剂有毒、操作繁琐， 不适合大批量筛查，因而抗NA抗体检测未被广泛推广。1990年，Claude R.Lambr6报道基 于花生四烯酸结合半乳糖基团检测的酶链免疫检测法，随后发现抗HA抗体如与病毒相互 作用，该作用也能构象上影响与NA的结合，从而出现抗NA抗体假阳性。2009年，Sandbulte MR研究团队使用仅含流感病毒NA的病毒样颗粒（VLP)用于抗NA抗体检测，该方法已申请 专利，因制备的VLP产量受限，体系中也可能有杆状病毒，对VLP技术缺乏掌握的实验室或 疫苗厂家难以开展。近年来，广谱中和抗体、NA酶活抑制性抗体、NA免疫原性的研究推动了 抗NA抗体检测的发展，利用流感病毒研究最通用的反向遗传学技术，开发具有我国自主知 识产权的抗NA抗体检测平台尤为重要，从而为临床检测、疫苗评估提供技术支持。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种制备重组病毒的方法。
[0005] 本发明提供的方法，包括如下步骤：将HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、流感 病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部6个基因 PB2、PB1、PA、NP、M和NS共同导入宿主细 胞，包装，即得到重组病毒。
[0006] 上述方法中，所述NA基因为NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基 因；
[0007] 所述NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因具体为ΝΑΙ、NA2或 NA9亚型流感病毒的神经氨酸酶编码基因。
[0008] 上述方法中，所述HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因为H6基因，其来源于流感 病毒Α/Εην/2029/2011(Η6Ν1)，其核苷酸序列具体为序列表中序列1 ;
[0009] 所述NAl亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为2007季节性HlNl流感病毒NA 基因（NA2007H1N1)或 2009H1N1 流感病毒 NA 基因（NA2009H1N1)，
[0010] 所述2007季节性HlNl流感病毒NA基因来源于流感病毒A/Brisbane/59/2007,其 核苷酸序列具体为序列表中序列2 ;
[0011] 所述2009H1N1流感病毒NA基因来源于流感病毒A/California/04/2009,其核苷 酸序列具体为序列表中序列5 ;
[0012] 所述NA2亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为2007季节性H3N2流感病毒NA 基因（NA2007H3N2)，其来源于流感病毒A/Brisbane/10/2007,其核苷酸序列具体为序列表 中序列3 ;
[0013] 所述NA9亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为2013H7N9禽流感病毒NA基因 (NA2013H7N9)，其来源于流感病毒A/Anhui/1/2013,其核苷酸序列具体为序列表中序列4 ;
[0014] 所述基因 PB2的核苷酸序列具体为序列表中序列6 ;
[0015] 所述基因 PBl的核苷酸序列具体为序列表中序列7 ;
[0016] 所述基因 PA的核苷酸序列具体为序列表中序列8 ;
[0017] 所述基因 NP的核苷酸序列具体为序列表中序列9 ;
[0018] 所述基因 M的核苷酸序列具体为序列表中序列10 ;
[0019] 所述基因 NS的核苷酸序列具体为序列表中序列11。
[0020] 上述方法中，
[0021] 所述HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经 氨酸酶的编码基因、及内部6个基因片段PB2、PBl、PA、NP、M和NS分别通过含有HA6亚型 流感病毒血凝素的编码基因重组载体、含有NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的 编码基因重组载体、含有PB2重组载体、含有PBl重组载体、含有PA重组载体、含有NP重组 载体、含有M重组载体、含有NS重组载体共同导入宿主细胞中；
[0022] 所述含有HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因的重组载体为将H6基因插入表达 载体中得到的载体；
[0023] 所述含有NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因重组载体为将 NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因插入表达载体中得到的载体；
[0024] 所述含有PB2重组载体为将基因 PB2插入表达载体中得到的载体；
[0025] 所述含有PBl重组载体为将基因 PBl插入表达载体中得到的载体；
[0026] 所述含有PA重组载体为将基因 PA插入表达载体中得到的载体；
[0027] 所述含有NP重组载体为将基因 NP插入表达载体中得到的载体；
[0028] 所述含有M重组载体为将基因 M插入表达载体中得到的载体；
[0029] 所述含有NS重组载体为将基因 NS插入表达载体中得到的载体；
[0030] 所述表达载体具体为PHW2000。
[0031] 上述方法中，所述含有HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因重组载体、含有NA1-9 亚型流感病毒中任一种神经氨酸酶的编码基因重组载体、含有PB2重组载体、含有PBl重组 载体、含有PA重组载体、含有NP重组载体、含有M重组载体、含有NS重组载体为等质量混 合共同导入。
[0032] 上述方法中，所述宿主细胞为由MDCK细胞和293T细胞混合得到的混合细胞群；
[0033] 所述MDCK细胞和293T细胞的细胞数目比具体为1:1. 5-2。
[0034] 所述含有 Α/Εην/2029/2011(Η6Ν1)ΗΑ 基因的重组载体为 pHW2000-A/ Env/2029/2011_HA ；
[0035] 所述含有季节性流感A/Brisbane/59/2007 (HlNl) NA基因重组载体pHW2000-A/ Brisbane/59/2007_NA ；
[0036] 所述含有季节性流感A/Brisbane/10/2007 (H3N2) NA基因重组载体pHW2000-A/ Brisbane/10/2007_NA ；
[0037] 所述含有禽流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)NA基因的重组载体为pHW2000-A/ Anhui/1/2013_NA ；
[0038] 所述含有流感病毒A/California/04/2009 (HlNl) NA基因的重组载体为 pHW2000-A/California/04/2009_NA。
[0039] 上述方法具体为如下A)-D):
[0040] A)包括如下步骤：将含有HA6基因的重组载体pHW2000-A/Env/2029/2011_HA、 含有 2007H1N1 病毒 NA 基因重组载体 pHW2000-A/Brisbane/59/2007_NA、含有 A/Puerto Rico/8/1934(PR8)流感病毒内部6个基因片段的pHW2000-PB2重组载体、pHW2000-PBl重 组载体、PHW2000-PA重组载体、pHW2000-NP重组载体、pHW2000-M重组载体、pHW2000-NS重 组载体共同导入宿主细胞，包装，即得到重组病毒RGH6Nl(Br59NA);
[0041] B)包括如下步骤：将含有HA6亚型的编码基因重组载体A/Env/2029/2011_HA、 含有2007H3N2病毒NA基因重组载体A/Brisbane/10/2007_NA、含有PR8流感病毒内部 6个基因片段的PHW2000-PB2重组载体、pHW2000-PBl重组载体、pHW2000-PA重组载体、 PHW2000-NP重组载体、pHW2000-M重组载体、pHW2000-NS重组载体共同导入宿主细胞，包 装，即得到重组病毒RGH6N2 (BrlONA);
[0042] C)包括如下步骤：将含有HA6亚型的编码基因重组载体A/Env/2029/2011_HA、 含有2013H7N9病毒NA基因重组载体pHW2000-A/Anhui/l/2013_NA、含有PR8流感病毒内 部6个基因片段的pHW2000-PB2重组载体、pHW2000-PBl重组载体、pHW2000-PA重组载体、 PHW2000-NP重组载体、pHW2000-M重组载体、pHW2000-NS重组载体共同导入宿主细胞，包 装，即得到重组病毒RGH6N9(AH1NA);
[0043] D)包括如下步骤：将含有HA6亚型的编码基因重组载体A/Env/2029/2011_HA、含 有2009H1N1病毒NA基因重组载体pHW2000-A/California/04/2009_NA、含有PR8流感病毒 内部6个基因片段的pHW2000-PB2重组载体、pHW2000-PBl重组载体、pHW2000-PA重组载 体、PHW2000-NP重组载体、pHW2000-M重组载体、pHW2000-NS重组载体共同导入宿主细胞， 包装，即得到重组病毒RG H6N1 (CA04NA)。
[0044] 上述方法制备的重组病毒也是本发明保护的范围。
[0045] 上述的重组病毒在制备检测待测血清中抗神经氨酸酶抗体产品中的应用也是本 发明保护的范围。
[0046] 上述的重组病毒在制备临床检查和/或评估流感疫苗产品中的应用也是本发明 保护的范围；所述流感疫苗具体为季节性11謂1、!13吧、2009!1謂1、禽流感!17_病毒疫苗。
[0047] 上述的重组病毒在制备流感疫苗中的应用；所述流感疫苗具体为具体为季节性 H1N1、H3N2、2009H1N1、禽流感 H7N9 病毒疫苗。
[0048] 本发明的实验证明，基于ELISA显色技术的NA活性检测同最早用于NA抗体检测 白勺化学显色法比较（Methods for the quantitative estimation of N-acetylneuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids. AMINOFF D.Biochem J. 81:384-92. 1961)，所使用的检测试剂无毒无害，步骤简单。本发明中所使用的H6重配流 感病毒，其包膜含有待测目标病毒NA蛋白，具有与野生病毒相同的NA酶功能特性，HA则是 与含NA的亲代病毒上的HA抗原性明显不同，这种重配方式具有以下优点：1)反向遗传技 术简单可行，可以在鸡胚第一代就获得病毒，获得的病毒滴度在128HAU/50ul以上，病毒产 量高，也能使用BPL灭活，方便实验检测；2)使用不同于亲代病毒HA或抗原性差别大的HA 用于重配病毒，该重配病毒同抗亲代病毒HA抗体无交叉反应性，避免机体已有的抗HA抗体 对NA抗体检测的干扰；3)本发明中用于拯救病毒的PHW2000载体为双向表达编码载体，可 编码正粘病毒vRNA及病毒蛋白，是用于正粘病毒拯救最常用的载体。拯救步骤是同时转染 流感病毒8段基因，在293T细胞上包装病毒，进而感染MDCK细胞，再在鸡胚细胞上扩增，操 作简单，大多数流感病毒实验室具备该技术；4)本发明中选用的H6,基于在人群中H6感染 非常罕见，一般人群或感染人群血清中基本不存在抗H6抗体，H6基因位于Hla分支，该分 支的基因与本研究中使用的NI、N2、N9基因的重配能兼容，能够拯救出病毒。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图 1 为重组病毒 RGH6N1 (Br59NA)，RGH6N2 (BrlONA)，RGH6N1 (CA04NA)，RGH6N9 (AH1 NA) NA酶活
[0050] 图2为H7N9患者血凝抑制抗体（HI)、NA酶活抑制抗体（NI)、中和抗体滴度（MN) 变化动力学
[0051] 图3为H7N9患者NA酶活抑制抗体（NI)与血凝抑制抗体（HI)的相关性
[0052] 图4为NA酶活抑制（NI)抗体与中和抗体滴度（MN)的相关性
【具体实施方式】
[0053] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0054] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055] 实施例1、重组病毒RGH6N1 (Br59NA)、RGH6N2 (BrlONA)制备及其对NA抗体的反应
[0056] 一、重组病毒 RGH6N1 (Br59NA)、RGH6N2 (BrlONA)拯救
[0057] 1、流感病毒H6、NA基因的扩增
[0058] HA基因有不同的亚型，其中之一为H6 ;
[0059] 使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen，cat#74104)提取病毒 RNA，病毒 200 μ L 加入 500 μ L裂解液，病毒RNA50 μ L，以一步法RT-PCR扩增。
[0060] Η6基因以Α/Εην/2029/2011(Η6Ν1，该病毒由中国疾病预防控制中心病毒病控制 所流感室采集）RNA为模板进行重叠 PCR扩增获得PCR产物。
[0061] NA基因分别以不同亚型的病毒株的RNA为模板进行一步PCR扩增，不同 亚型的病毒株分别为 A/Brisbane/59/2007(HlNl)，A/Brisbane/10/2007(H3N2), A/ California/04/2009(H1N1)，A/AH1/2013(H7N9)RNA 扩增，前三种病毒由美国 CDC 提供，中 国疾病预防控制中心病毒病控制所流感室保存，A/AH1/2013(H7N9)由中国疾病预防控制 中心病毒病控制所流感室分离保存。
[0062] 上述基因的扩增引物如下表1所示：
[0063] 表1为扩增引物
[0064]
【权利要求】
1. 一种制备重组病毒的方法，包括如下步骤：将HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、 流感病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部6个基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS共同导入宿 主细胞，包装，即得到重组病毒。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述NA基因为NA1-9亚型流感病毒中任 一种的神经氨酸酶的编码基因； 所述NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因具体为NA1、NA2或NA9亚 型流感病毒的神经氨酸酶编码基因。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于： 所述HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因为H6基因，其来源于流感病毒A/ Env/2029/2011(H6Nl)，其核苷酸序列具体为序列表中序列1 ; 所述NAl亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为NA 2007H1N1基因或NA 2009H1N1基 因，所述NA H1N12007基因来源于流感病毒A/Brisbane/59/2007,其核苷酸序列具体为序 列表中序列2 ; 所述NA H1N12009基因来源于流感病毒A/California/04/2009,其核苷酸序列具体为 序列表中序列5 ; 所述NA2亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为H3N2NA基因，其来源于流感病毒A/ Brisbane/10/2007,其核苷酸序列具体为序列表中序列3 ; 所述NA9亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为H7N9NA基因，其来源于流感病毒A/ AH1/2013,其核苷酸序列具体为序列表中序列4 ; 所述基因PB2的核苷酸序列具体为序列表中序列6 ; 所述基因PBl的核苷酸序列具体为序列表中序列7 ; 所述基因PA的核苷酸序列具体为序列表中序列8 ; 所述基因NP的核苷酸序列具体为序列表中序列9 ; 所述基因M的核苷酸序列具体为序列表中序列10 ; 所述基因NS的核苷酸序列具体为序列表中序列11。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特性在于： 所述HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、NA1-9亚型流感病毒中任一种神经氨酸酶 的编码基因、及内部6个基因片段PB2、PBl、PA、NP、M和NS分别通过含有HA6亚型流感病 毒血凝素的编码基因重组载体、含有NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基 因重组载体、含有PB2重组载体、含有PBl重组载体、含有PA重组载体、含有NP重组载体、 含有M重组载体、含有NS重组载体共同导入宿主细胞中； 所述含有HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因的重组载体为将H6基因插入表达载体 中得到的载体； 所述含有NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因重组载体为将NA1-9 亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因插入表达载体中得到的载体； 所述含有PB2重组载体为将基因PB2插入表达载体中得到的载体； 所述含有PBl重组载体为将基因PBl插入表达载体中得到的载体； 所述含有PA重组载体为将基因PA插入表达载体中得到的载体； 所述含有NP重组载体为将基因NP插入表达载体中得到的载体； 所述含有M重组载体为将基因M插入表达载体中得到的载体； 所述含有NS重组载体为将基因NS插入表达载体中得到的载体； 所述表达载体具体为PHW2000。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特性在于：所述含有HA6亚型流感病毒血凝素的编 码基因重组载体、含有NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因重组载体、 含有PB2重组载体、含有PBl重组载体、含有PA重组载体、含有NP重组载体、含有M重组载 体、含有NS重组载体为等质量混合共同导入。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特性在于：所述宿主细胞为由MDCK细胞和 293T细胞混合得到的混合细胞群； 所述MDCK细胞和293T细胞的细胞数目比具体为1:1. 5-2。
7. 由权利要求1-6任一所述方法制备的重组病毒。
8. 权利要求7所述的重组病毒在制备检测待测血清中抗神经氨酸酶抗体产品中的应 用。
9. 权利要求7所述的重组病毒在制备临床检查和/或评估流感疫苗产品中的应用；所 述流感疫苗具体为季节性H1N1、H3N2、2009H1N1、禽流感H7N9病毒疫苗。
10. 权利要求7所述的重组病毒在制备流感疫苗中的应用；所述流感疫苗具体为具体 为季节性!1謂1、113吧、200911謂1、禽流感117_病毒疫苗。
【文档编号】C12N7/01GK104312983SQ201410559367
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】周剑芳, 秦堃, 朱云, 白天, 王大燕, 舒跃龙 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所