红球菌高效利用木糖渣生产生物柴油的方法
【专利摘要】生物柴油含硫量低，且不含芳香族化合物，可生物降解，是一种环境友好型的可再生能源。红球菌属有很强的碳源转化能力，能够将生活生产中难以利用的木质纤维素高效率转化为脂肪酸，浑浊红球菌（ Rhodococcusopacus PD630）利用葡萄糖为碳源时油脂积累量可高达细胞干重的86%，是一种优质的产油菌株。本发明提供了一种通过浑浊红球菌（ Rhodococcusopacus PD630）高效利用木糖渣生产脂肪酸的方法。相比常用的酵母菌属，红球菌属对极性条件的耐受力强，碳源转化能力高，发酵条件较为简单，是一种非常有潜力的生物柴油工业化生产途径。
【专利说明】红球菌高效利用木糖渣生产生物柴油的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物柴油的生产方法，尤其是关于红球菌利用木糖渣产生的脂肪 酸，然后采用生物柴油生产工艺将产出的脂肪酸转化为生物柴油的一种方法。
【背景技术】
[0002] 自20世纪以来，石油一直成为人类大规模开采和使用的能源。到了 20世纪后期， 人类逐渐意识到石油资源的短缺及其使用带来的环境问题。从而，为解决能源和环境的双 重压力，相关研究人员也一直致力于新能源的开发。其中，生物柴油含硫量低，且不含芳香 族化合物，可生物降解，是一种环境友好型的可再生能源。生物柴油的生产原料来源广，随 着社会的发展和技术的进步，生物柴油在人类生活生产中所占比例将越来越大。
[0003] 动植物油脂用来作为生产生物柴油的原料有一定的局限。首先，产油的农作物 受限于土地的利用度，与粮食竞争土地来生产生物柴油有些得不偿失。而目前也不断在 尝试用微生物油脂作为绿色可持续的生物柴油原料，红球菌属有很强的碳源转化能力，能 够将生活生产中难以利用的木质纤维素高效率转化为脂肪酸。浑浊红球菌 OAacm TO630)利用葡萄糖为碳源时油脂积累量可高达细胞干重的86%，是一种优质的产油 菌株。
[0004] 木糖渣是利用玉米芯生产木糖时的下脚料，其主要成分为48. 5%的纤维素、23. 5% 的半纤维素和21. 3%的木质素，是一种优质的生物质资源，并且我国每年有约25万t的木 糖渔产生，
【发明者】长期探索发明了一种通过浑池红球菌（Rhodococcus opacus Η)630)高效 利用木糖渣生产脂肪酸的方法。相比常用的酵母菌属，红球菌属对极性条件的耐受力强，碳 源转化能力高，发酵条件较为简单，是一种非常有潜力的生物柴油工业化生产途径。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种高效产油红球菌一/Sot/ococciAs Ρ?630，保藏编号 DMSZ44193。在浑浊红球菌(TSoi/ococcm OAacm TO630)的发酵培养基中配入适量的木糖 渣粉，在发酵过程中实时监测其浓度，及时补料，同时也要控制好其他条件参数。通过匀浆 使得红球菌细胞破碎释放胞内油脂，然后将浑浊红球菌发酵积累的油脂通过极性有机溶剂 (如氯仿、己烷）萃取出来，接着用酯交换的方法将提纯出来的微生物油脂转化为生物柴油。 或者对红球菌生物质进行直接酯交换以制备生物柴油。具体的实施方式，本文将通过以下 几个实施例来加以详细说明。
【具体实施方式】 [0006] 实施例1 种子培养基：葡萄糖l〇g/L，酵母提取物5g/L，麦芽提取物10g/L，Na2HPO4 · 12H20 9g/ UKH2PO4 1.5g/L。除葡萄糖外将培养基其他成分于121°C条件下灭菌20min，葡萄糖单独于 115°0灭菌2〇1^11。接种量为2%，起始口!17.2±0.02,281：，200卬111，培养2411。
[0007] 24h 后测得 OD6tltl 为 47. 2。
[0008] 实施例2 改变培养基中氮源的量，将上述实施例1中的种子培养罐中的菌体分别转入下面的培 养培养基中扩大培养。
[0009] 营养平衡培养基：木糖渣 80g/L，尿素 10g/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，CaCl2 · 2H20 0· 02g/L，FeSO4 · 7H20 0· 5g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 4g/L，MnSO4 · 5H20 0· 02g/L，H3BO3 0· 015g/L， NiCl2 · 2H20 0· 01g/L，EDTA 0· 25g/L，CoCl2 · 6H20 0· 05g/L，CuCl2 · 2H20 0· 005g/L，Stock A溶液lml/L，I. OM磷酸缓冲溶液35. 2ml/L。
[0010] 氮源限制培养基：木糖渣80g/L，尿素0. 636g/L，其他成分与营养平衡型培养基 一致。
[0011] Stock A 溶液配方：NaMoO4 · 2H20 2g/L，FeNa · EDTA 5g/L。
[0012] I. OM 磷酸缓冲溶液配方：KH2PO4 47g/L，K2HPO4 113g/L。
[0013] 将实施例1发酵得到的种子液分别转入营养平衡培养基和氮源限制培养基，分别 置于于7L全自动发酵罐中。发酵罐参数设定为：转速500rpm，pH7. 2±0,02,温度28°C，通 气量0. 5vvm，培养周期为110h。发酵过程中随着木糖渣浓度低于8g/L时，要及时向培养液 中补料使得木糖渣的浓度维持在80g/L左右。
[0014] 实施例3 :测定红球菌细胞油脂产率 A.测定红球菌细胞干重 上述实施例2发酵结束后，分别在两个发酵罐取Iml发酵液，在lOOOOrpm下离心 10min，用水洗涤生物质沉淀两次，并在40°C下恒温干燥24h，通过重量分析确定生物质。
[0015] B.从浑浊红球菌细胞中提取油脂（Folch油的提取方法） 将上述实施例发酵产生的红球菌生物质与20体积的氯仿：甲醇（2:1)混合液一起匀 浆。分散后，室温下在轨道振荡器上过夜搅拌整个混合液，离心并回收液相。用0.2体积的 水洗涤溶剂。漩涡混合几秒后，2000rpm下离心分开两相。虹吸去除上相，氮气流氛围下在 旋转蒸发器中蒸发含有脂质的下相，回收油脂，称重。
[0016] C.浑浊红球菌细胞的油脂产率 通过用红球菌细胞产油脂的量与浑浊红球菌细胞干重的比值来表示细胞的油脂产率。
[0017] D.营养平衡培养基和氮源限制培养基的红球菌细胞的产油率 表1
【权利要求】
1. 一种高效生产生物柴油的方法，其特征在于：生产生物柴油的原料油脂是微生物油 脂。
2. 根据权利要求1所述，微生物油脂的的生产菌种为红球菌属。
3. 根据权利要求2所述产油菌种包括opactts 1^630、 jbWii RHAl等红球菌属的多个种。
4. 根据权利要求1、2或3所述，产油红球菌产油利用的碳源为工业废弃木糖渣。
5. 根据权利要求4所述，木糖渣添加方式为直接配入培养基和补料添加，添加量为 8%-10%。
6. 红球菌细胞产油的提取方式为氯仿-甲醇（2:1)萃取。
7. 利用红球菌细胞产油生产生物柴油的方式为对提取的油脂进行酯交换或直接对冻 干的红球菌细胞进行酯交换反应。
8. 根据权利要求7所述，对细胞进行直接酯交换后提取生物柴油的方法为有机溶剂萃 取，萃取剂包括：氯仿，己烷，乙醚等。
【文档编号】C12R1/01GK104313067SQ201410558740
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】朱道辰, 谢长校, 陈焱 申请人:镇江拜因诺生物科技有限公司