一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用与流程

本发明属于农业废弃物处理与生物质产品生产领域，具体涉及一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用。

背景技术：

农业秸秆是一类产量巨大、处理困难的固体废弃物，农业秸秆的回收利用能够减少秸秆对环境的污染、提高农业生产的效益。纤维包括纤维素和半纤维素，是秸秆的主要成分，占秸秆总重的60％～80％。纤维经水解后制得的高浓度糖溶液，可用于微生物的异养培养。

微藻生物质富含蛋白、多不饱和脂肪酸、色素等物质，在水产、畜禽养殖和高价值生物产品生产等方面有广泛的应用。现有的微藻培养技术主要是在光照条件下，在跑道式浅塘中，利用人工培养基自养培养微藻。受限于光合作用效率和光的传递损失，光自养条件下，藻液的生物质浓度低、藻细胞生长速度慢，导致微藻生物质生产成本过高，制约微藻生物质产品的大规模应用。开发一种利用秸秆水解液的微藻培养技术，对于实现秸秆的资源化利用和高价值微藻生物质产品的大规模生产具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提出一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用。具体技术方案如下：

一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法，以农业秸秆为原料制备纤维水解液，将具备异养生长能力的藻种接种到以纤维水解液为基质配置的培养基中，黑暗条件下异养培养。具体步骤为：

1)采用机械法、碱法或亚硫酸铵法处理农业秸秆，去除木质素，将纤维浸泡在缓冲液中，投加纤维素酶，得到纤维水解液；

2)采用离心或压滤的方式分离水解液与剩余残渣，在水解液中添加必需无机营养元素，调节水解液pH至6.5-7.5，高温高压灭菌，条件为温度115℃，时间15min，得到以纤维水解液为基质的培养基；

3)在培养基中接种微藻，异养培养，培养过程中可进一步投加浓缩水解液，以补充糖分，初始葡萄糖浓度和补料培养时的残糖浓度控制在5～50g/L，待葡萄糖充分利用后，离心收获藻细胞。

步骤2)中所述无机营养元素为Na2CO3、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、柠檬酸、K2HPO4·3H2O、NaNO3、EDTA、柠檬酸铁铵，其中糖与总氮的比值为(5:1)～(250:1)，氮磷比为(5:1)～(40:1)，其他营养元素物质含量同BG11培养基(见表1)。

步骤3)中所述微藻为具备异养生长能力的单细胞光合微生物，如小球藻、螺旋藻、雨生红球藻、栅藻。

步骤3)中所述微藻为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorella vulgaris sp.)ZTY1325，菌种保藏号分别为CGMCC NO.12521和CGMCC NO.12522。

所述的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304的18S rDNA序列如SEQ ID No.1所示；所述的普通小球藻(Chlorella vulgarissp.)ZTY1325的18S rDNA序列如SEQ ID No.2所示。

所述的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304为单细胞微生物，细胞呈球形，细胞壁平滑，直径3～8μm；所述的普通小球藻(Chlorella vulgarissp.)ZTY1325为单细胞微生物，细胞呈球形，细胞壁平滑，直径8～15μm。

步骤3)中所述异养培养的条件为：温度25℃，振荡速率150rpm/min，时间3～10天。

步骤3)中所收获微藻的生物质组成随培养基的糖与总氮投加量的比值而变化，其中蛋白含量为20％～60％，脂肪酸含量为10％～35％，培养基的糖氮比越低，微藻生物质的蛋白含量越高，脂肪酸含量越低。

微藻在饲料添加剂、色素、化工产品、生物柴油生物质产品生产中的应用。

本发明的有益效果为：本发明以农业秸秆纤维水解液为基质，用于培养具备异养能力的经济型微藻。该方法培养微藻无需光照、所得藻液浓度高、藻细胞生长速度快，可为微藻生物质产品的生产提供廉价的生物质原料，降低生产成本；通过调节培养基的营养条件，可以方便地调控微藻生物质的组成，产出的微藻生物质的总蛋白含量为20％～60％，脂肪酸含量为10％～35％，可满足不同用途的使用要求；并且本发明可实现对秸秆资源的有效回收利用。

生物材料保藏说明

分类命名：蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)菌株编号：THUZTY1304

保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2016年06月022日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12521

分类命名：普通小球藻(Chlorella vulgaris)菌株编号：THUZTY1325

保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2016年06月022日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12522

附图说明

图1为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorella vulgaris sp.)THUZTY1325在秸秆纤维水解液和合成培养基中异养生长的生长曲线图。

图2为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorella vulgarissp.)THUZTY1325在秸秆纤维水解液和合成培养基中异养生长的糖浓度变化图。

图3为在不同初始总氮条件下，利用秸秆纤维水解液培养蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304时，藻细胞对培养基中总氮的利用情况。

图4为利用秸秆纤维水解液培养蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304时，藻生物质的蛋白含量随氮投加量的变化图。

具体实施方式

本发明提出了一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用，下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：蛋白核小球藻THUZTY1304和普通小球藻ZTY1325的分离与鉴定

两株藻种分离自北京市某污水厂的生活污水。取少量污水，以BG11培养基(见表1)稀释后，置于光照条件下扩大培养20～30天；在BG11+2％琼脂的固体平板上划线，继续培养30天左右；挑取平板上的单一藻落，再溶于BG11中扩大培养。重复以上分离步骤2～3次，直至分离出洁净而不受污染的藻落。

以提取的微藻DNA为模版，PCR扩增18S rDNA基因，采用以下2对引物进行扩增：

①上游引物EK82f(5’-GAAACTGCGAATGGCTC-3’)，和下游引物Proto5r(5’-GACGGGCGGTGTGTAC-3’)，

②上游引物16S1N(5’-TCCTGCCAGTAGTCATATGC-3’)，和下游引物16S2N(5’-TGATCCTCTCGCAGGTTCAC-3’)。

扩增序列在Genbank中进行同源比对，两个藻落鉴定为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorella vulgaris sp.)THUZTY1325。其中蛋白核小球藻THUZTY1304的18S rDNA序列如SEQ ID No.1所示；普通小球藻ZTY1325的18S rDNA序列如SEQ ID No.2所示。

蛋白核小球藻THUZTY1304为单细胞微生物，细胞呈球形，细胞壁平滑，直径3～8μm；普通小球藻ZTY1325为单细胞微生物，细胞呈球形，细胞壁平滑，直径8～15μm。

表1BG11培养基配方

实施例2：利用秸秆纤维水解液培养微藻

1)将小麦秸秆洗净切碎，用碱溶液蒸煮，充分去除木质素后，收获纤维浆，脱水并充分洗去残留碱液；将纤维浸泡在乙酸-乙酸钠缓冲液中，固液比(1:5)～(1:30)，单位质量纤维的纤维素酶投加量为5-500FPU，pH4-6，反应温度35–55℃，振荡速率200rpm/min，反应时间12-48h，将纤维水解为高浓度糖溶液；水解后，水解液中的葡萄糖浓度约为45～60g/L，可采用减压蒸馏法(如多级闪蒸等)进一步浓缩糖液至300g/L以上，蒸馏温度50～60℃，降低蒸馏室气压至低于水温所对应的饱和蒸汽压，蒸馏时间为20～40min；

2)采用离心或压滤的形式，将水解液与剩余残渣分开，依据所培养微藻的种类，按期标准自养培养基配方，在水解液中添加必需无机营养20mg/L Na2CO3、75mg/L MgSO4·7H2O、36mg/L CaCl2·2H2O、6mg/L柠檬酸、40mg/L K2HPO4·3H2O、1500mg/L NaNO3、1mg/L EDTA、6mg/L柠檬酸铁铵，其中初始糖浓度控制在10g/L，调节水解液pH至6.5-7.5，温度115℃，时间15min条件下高温高压灭菌，得到以纤维水解液为基质的培养基；

3)在培养基中分别接种蛋白核小球藻THUZTY1304和普通小球藻ZTY1325，接种密度为1.0×10⁷个·mL^-1，异养培养，培养条件为：温度25℃，振荡速率150rpm/min，时间3～10天；培养过程中可进一步投加浓缩水解液和营养盐，以补充营养，初始葡萄糖浓度和补料培养时的残糖浓度控制在5～50g/L，待葡萄糖充分利用后，离心收获藻细胞；

4)藻细胞脱水干化，经进一步处理后用于生产各类微藻生物质产品，也可保留部分藻种继续用于培养。

另按小球藻培养领域一般采用的BG11培养基的配方(见表1)，以分析纯化学品和高纯水为原料配置营养水平相同的合成培养基，在同样条件下培养上述藻种，作为对照。

蛋白核小球藻THUZTY1304和普通小球藻THUZTY1325在秸秆纤维水解液和合成培养基中异养生长的生长曲线如图1，糖浓度变化图如图2。

在初始接种密度为1.0×10⁷个·mL^-1条件下，蛋白核小球藻THUZTY1304在水解液培养基中仅生长5天，藻密度即可增长到2.6×10⁸个·mL^-1，藻细胞倍增时间可缩短至9.2小时，远快于该藻在自养培养基中的生长速率；收获时干重浓度为4.9克/升，蛋白含量为20.3％，总叶绿素含量为51.1ug/mg；产出的蛋白核小球藻生物质富含多不饱和脂肪酸，其中亚麻酸和亚油酸的含量占总脂肪酸含量的42.6％，具有很高的营养价值。普通小球藻在水解液培养基中也表现出了远快于自配培养基的生长速率，收获时干重浓度为6.1克/升，蛋白含量为21.7％，总叶绿素含量为44.6ug/mg，不饱和脂肪酸含量为占总脂肪酸含量的70.2％。

实施例3：氮投加量对微藻生物质的蛋白含量的影响

步骤同实施例2，不同之处在于，水解液中葡萄糖浓度为10克/升，控制培养基中的总氮含量分别为180mg/L，360mg/L和900mg/L，氮磷比控制在10:1，置于25℃培养箱恒温培养，振荡速率为150rpm/min。

蛋白核小球藻THUZTY1304对培养基中总氮的利用情况如图3，藻生物质的蛋白含量随氮投加量的变化图如图4。

在初始接种密度为1.0×10⁷个·mL^-1条件下，培养5天后，蛋白核小球藻THUZTY1304即可充分同化培养基中的糖分，蛋白含量随总氮投加量的增加而明显上升，总蛋白含量为20％～60％，脂肪酸含量随蛋白含量的升高而降低，变化范围为10％～35％。通过该方式调节微藻生物质的组成，可充分满足不同用途对微藻产品的要求。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> 一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1592

<212> DNA

<213> 蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）

<400> 1

aatctagagc taatacgtgc gtaaatcccg acttctggaa gggacgtatt tattagataa 60

aaggccgacc gggctctgcc cgactcgcgg tgaatcatga taacttcacg aatcgcatgg 120

ccttgtgccg gcgatgtttc attcaaattt ctgccctatc aactttcgat ggtaggatag 180

aggcctacca tggtggtaac gggtgacgga ggattagggt tcgattccgg agagggagcc 240

tgagaaacgg ctaccacatc caaggaaggc agcaggcgcg caaattaccc aatcctgaca 300

cagggaggta gtgacaataa ataacaatac tgggcctttt caggtctggt aattggaatg 360

agtacaatct aaacccctta acgaggatca attggagggc aagtctggtg ccagcagccg 420

cggtaattcc agctccaata gcgtatattt aagttgctgc agttaaaaag ctcgtagttg 480

gatttcgggt ggggcctgcc ggtccgccgt ttcggtgtgc actggcaggg cccaccttgt 540

tgccggggac gggctcctgg gctttactgt ccgggactcg gagtcggcgc tgttactttg 600

agtaaattag agtgttcaaa gcaggcctac gctctgaata cattagcatg gaataacacg 660

ataggactct ggcctatcct gttggtctgt aggaccggag taatgattaa gagggacagt 720

cgggggcatt cgtatttcat tgtcagaggt gaaattcttg gatttatgaa agacgaacta 780

ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcaaga acgaaagttg ggggctcgaa 840

gacgattaga taccgtccta gtctcaacca taaacgatgc cgactaggga tcggcggatg 900

tttcttcgat gactccgccg gcaccttatg agaaatcaaa gtttttgggt tccgggggga 960

gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggcgtggagc 1020

ctgcggctta atttgactca acacgggaaa acttaccagg tccagacata gtgaggattg 1080

acagattgag agctctttct tgattctatg ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt 1140

gggttgcctt gtcaggttga ttccggtaac gaacgagacc tcagcctgct aaatagtcac 1200

ggttggttcg ccagccggcg gacttcttag agggactatt ggcgactagc caatggaagc 1260

atgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc gcgctacact 1320

gatgcattca acgagcttag ccttggccga gaggcccggg taatctttga aactgcatcg 1380

tgatggggat agattattgc aattattaat cttcaacgag gaatgcctag taagcgcaat 1440

tcatcagatt gcgttgatta cgtccctgcc ctttgtacac accgcccgtc gctcctaccg 1500

attgggtgtg ctggtgaagt gttcggattg gcgaccgggg gcggtctccg ctctcggccg 1560

ccgagaagtt cattaaaccc tcccacctag ag 1592

<210> 2

<211> 1585

<212> DNA

<213> 普通小球藻（Chlorella vulgaris）

<400> 2

agagctaata cgtgcgtaaa tcccgacttc tggaagggac gtatatatta gataaaaggc 60

cgaccgggct ttgcccgacc cgcggtgaat catgatatct tcacgaagcg catggccttg 120

tgccggcgct gttccattca aatttctgcc ctatcaactt tcgatggtag gatagaggcc 180

taccatggtg gtaacgggtg acggaggatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga 240

aacggctacc acatccaagg aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatcc tgatacgggg 300

aggtagtgac aataaataac aataccgggc atttaatgtc tggtaattgg aatgagtaca 360

atctaaatcc cttaacgagg atccattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa 420

ttccagctcc aatagcgtat atttaagttg ttgcagttaa aaagctcgta gttggatttc 480

gggtgggttc tagcggtccg cctatggtga gtactgctat ggcctatctt tctgtccggg 540

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