一种抗重金属铬的藻株及其筛选方法与流程

本发明涉及一种抗重金属铬的藻株及其筛选方法。

背景技术：

微藻是一类广泛分布于陆地、海洋当中，能够光合产能并且高度自氧的微生物。微藻与其他生物相比其种类繁多，到21世纪初已经发现的藻类约有三万余种，其中微小藻类占据70%。藻类的细胞壁及其功能团使得藻类对重金属吸附和富集能力较强，适合处理高、低浓度金属离子的水体。随着现代工业生产活动的加剧，人类向环境排放的重金属的量日益增多，严重污染了土壤和水体环境，使得人类将环境中的重金属通过食物链而积累，从而对人体健康造成极大的危害。如何去除工业废水中的重金属是一个关系到人类健康和生态环境的重要课题，而微藻正是具备了解决这些问题的开发属性。

但是由于不同藻类对生活环境要求不同，目前仅有蓝藻门、绿藻门、金藻门、红藻门这4个藻门用于人工培养或生产(张永亮,2009,铀矿冶)。衣藻是绿藻门衣藻科真核单细胞微藻，细胞椭球形，其吸附重金属表面比非常大。相关的研究已经证明了衣藻在重金属废水中处理能够起到非常明显的作用，在微藻富集重金属的研究中，衣藻因其独特的细胞结构和功能特性逐渐成为研究热点(caixh,1995,molecularbiologyandbiotechnology)。

而本发明中使用的莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)因其具有基因组简单且已被注释，生长快易培养，研究技术手段相对成熟等特点，而把其列为科学研究的模式生物之一。目前对于衣藻吸附的研究多数是构建衣藻对重金属的等温吸附模型，langmuir和freundlich等温吸附方程是描述藻类对重金属的吸附行为的两个著名的模型。二级吸附动力学模型也能很好地解释莱茵衣藻对汞、镉、铅等金属离子的吸附(ritchieag,1997,journalofthechemicalsociety,faradaytransactions)。此外对衣藻吸附重金属研究较多的还有关于吸附重金属影响因素的研究。随着莱茵衣藻基因组学研究的进展，转基因突变体藻株越来越受到研究者的关注。胡章立等通过对转mt-like基因衣藻和其野生品系的比较分析，发现转基因藻株对重金属镉和铜的结合能力及抗性均有大幅度提高(胡章立,2002,湖泊科学)。已有研究证明，在莱茵衣藻细胞质内表达外援金属硫蛋白显著增强转基因衣藻重金属的结合特性(huacx,1999,internationaljournalofphytoremediationgene)。所以建立一种可以从衣藻突变体文库中大量模式化的筛选出具有高重金属抗性藻株的方法是迫切的，从而可以进一步研究影响衣藻重金属吸附的相关基因以及可进行基因工程改良的重金属吸附藻株的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是建立一种从衣藻突变体文库中筛选抗重金属铬藻株的方法。通过利用莱茵衣藻方波电击所构建的突变体文库，进而从中筛选具有金属铬抗性的突变体衣藻。为下一步研究衣藻重金属吸附的相关基因和进行基因工程改良的重金属吸附藻株的应用打下基础。

本发明的目的是这样实现的：一种抗重金属铬的藻株，分类命名为，莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmccno.13872；保藏日期：2017-06-07,保藏地点：北京市路朝阳区北辰西路1号院3号。

其筛选方法为：从突变体文库tap平板上挑取每个突变体单克隆到画有方格的金属铬筛选tap平板上，该筛选平板上的方格数要保持在每板约30个左右并做好数字编号标记，每个方格内转接一个突变体藻株，在23±0.5°c，8000lx光强下连续光照培养7天左右，筛选存活状态旺盛的藻株。再次验证阶段，在突变体文库中找到与金属筛选板子上存活状态旺盛所对应的突变体藻株，再次将该藻株和野生型21gr藻株分别挑到同一块金属铬筛选平板上进行验证，约7天后野生型21gr死亡而突变体藻株存活正常，则确定该藻株为抗金属铬突变体藻株。

所述的莱茵衣藻即实验藻种：21gr(cc1690)，属于莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)的一个品系，可直接从衣藻实验室或者美国衣藻种质资源库获得。

所述tap固体培养基为：tap盐溶液25ml/l，磷酸盐溶液0.375ml/l，hutner微量元素1ml/l，乙酸1ml/l，tris2.42g/l，琼脂粉15g/l，121°c高压蒸汽灭菌20min，倒平板备用；所述的tap盐溶液为：nh4cl15g/l,mgso4•7h2o4g/l，cacl2•2h2o2g/l；所述的磷酸盐溶液为：k2hpo4288g/l，kh2po4144g/l；hutner微量元素为：edta二钠盐50g/l，znso4•7h2o22g/l，h3bo311.4g/l，mncl2•4h2o5.06g/l，cocl•6h2o1.61g/l，cuso4•5h2o1.57g/l，(nh4)6mo7o24•4h2o1.1g/l，feso4•7h2o4.99g/l，用koh或者hcl调节ph至7.0。

所述含有金属铬筛选tap平板为：金属盐k2cr2o7，在上述tap固体培养基配制灭菌前添加，使得终浓度为100um。

所述筛选培养条件为：在光照培养箱中，设置温度参数23±0.5°c，光强参数8000lx连续光照培养7天左右，最终挑选在筛选平板上生长的突变体藻株。

所述验证培养条件为：在光照培养箱中，设置温度参数23±0.5°c，光强参数8000lx连续光照培养7天左右，最终应为野生型死亡，突变体藻株存活状态良好。

有益效果，由于采用了上述方案，从衣藻突变体文库中大规模筛选抗重金属铬藻株。本方法具有筛选的广泛性，可以大量筛选具有金属铬抗性的突变体，而且后期还可以达到一次构建突变体文库，筛选其他多种金属抗性突变体藻株的便捷效果，应用价值极高。此外还可以通过寻找aphviii片段插入位点而鉴定出与金属抗性有关的基因，为日后进一步对衣藻吸附重金属铬的细胞分子生物学机制研究打下基础，具有很高的研究价值，达到了本发明的目的。

优点：从方波电击转化的衣藻突变体文库中筛选具有金属铬抗性的突变体藻株，具有良好的应用前景。

1、从衣藻突变体文库进行筛选比自然突变筛选，目的性强，便于确定性状与基因的联系，清楚铬抗性或者吸附性的根本原因。

2、本发明甚至可为双重金属抗性或多重金属抗性突变株的筛选方案提供相应的参考，具有很好的推广应用价值。

3、利用本发明获得的突变体藻株，可以对其突变位点进行鉴定，鉴定出与抗金属铬相关的基因，为后续的机理研究或者基因工程藻的应用打下基础。

附图说明

图中，1、野生型21gr；2、74号突变体；3、105号突变体；4、36号突变体，对照野生型21gr在金属铬筛选平板上死亡；74号和105号突变体在金属铬二次验证筛选中死亡，是假阳性藻株；36号突变体在金属铬筛选平板上则存活状态良好，可用于后续研究与应用。

具体实施方式

1、准备重金属铬筛选平板和衣藻突变体文库：配制含有金属铬筛选tap平板，金属盐k2cr2o7的终浓度为100um，在tap固体培养基配制灭菌前添加。所述tap固体培养基为：tap盐溶液25ml/l，磷酸盐溶液0.375ml/l，hutner微量元素1ml/l，乙酸1ml/l，tris2.42g/l，琼脂粉15g/l，121°c高压蒸汽灭菌20min，倒平板备用；所述的tap盐溶液为：nh4cl15g/l,mgso4•7h2o4g/l，cacl2•2h2o2g/l；所述的磷酸盐溶液为：k2hpo4288g/l，kh2po4144g/l；hutner微量元素为：edta二钠盐50g/l，znso4•7h2o22g/l，h3bo311.4g/l，mncl2•4h2o5.06g/l，cocl•6h2o1.61g/l，cuso4•5h2o1.57g/l，(nh4)6mo7o24•4h2o1.1g/l，feso4•7h2o4.99g/l，用koh或者hcl调节ph至7.0。

在灭菌结束降温阶段，提前将超净工作台紫外灭菌15min，在超净台进行平板的配制，过夜晾干，放至4°c冰箱备用。

衣藻突变体文库单克隆提前转接至tap平板上，在23±0.5°c，8000lx光强下连续光照培养3-4天，保证实验所用的单克隆状态良好。

2、转接单克隆衣藻至重金属铬筛选平板：提前将超净工作台紫外灭菌15min，在超净工作台使用灭菌牙签将每个突变体单克隆挑到画有方格的金属铬筛选平板上，金属铬筛选平板上的方格数要保持在每板约30个左右并做好数字编号标记，每个方格内转接一个突变体藻株，在23±0.5°c，8000lx光强下连续光照培养7天左右，筛选存活状态旺盛的突变体藻株。

3、验证初次筛选的突变体藻株：再次验证阶段，在突变体文库中找到与金属筛选板子上存活状态旺盛所对应的突变体藻株，提前将超净工作台紫外灭菌15min，在超净工作台使用灭菌牙签将该藻株和野生型21gr藻株分别挑到同一块金属铬筛选平板上进行验证，在23±0.5°c，8000lx光强下连续光照培养7天左右，野生型21gr死亡而突变体藻株存活正常，则确定该藻株为抗金属铬突变体藻株。如图，编号4中的36号突变体藻株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.13872。

4、抗金属铬突变体藻株保存：可将该突变体藻株划线至tap平板上，在23±0.5°c，8000lx光强下连续光照培养3-4天，用于后续实验。

经过上述实验步骤，可以获得目标的抗金属铬突变体藻株，该方法是一种有目的的大规模衣藻突变体文库的筛选方法。上述实施方案中需要注意的问题是：金属铬筛选平板上的方格数要保持在每板约30个左右，转接过多的藻会造成藻的假阳性；衣藻突变体文库单克隆是状态良好的，以免造成转接后的大量死亡；转接单克隆至方格内时，所涂的藻尽量少且匀，以免产生假阳性；所有与细胞接触的实验用具，实验试剂必须是无菌的。