RSV‑PCV疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及一种rsv-pcv疫苗及其制备方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：一、呼吸道合胞病毒及其流行病学呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒(influenzavirus，flu)和呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)则是重要的呼吸道病原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而rsv由于自身免疫特性，投入临床的疫苗很少，为其防控提出了挑战。至今仅有美国medimmune公司研制生产的流感三价减毒活疫苗通过fda审批。rsv是婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿因rsv感染导致住院达70％，2周岁以内的儿童甚至高达99％。rsv因其致病范围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。世界卫生组织已将rsv疫苗定为优先发展的疫苗之一。rsv属副粘病毒科肺病毒属，是非节段性单股负链rna病毒，含a、b两个血清型。rsv基因组全长约15kb，编码10种主要蛋白，分别由三个跨膜蛋白(g、f和sh)、两个基质蛋白(m和m2)、三个核衣壳蛋白(n、p和l)及两个非结构蛋白(ns1和ns2)构成，其中融合蛋白f(fusionprotein，f)和附着蛋白g(attchmentprotein，g)是rsv激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白。g蛋白高度变异，并非感染和细胞融合所必须的；的f蛋白高度保守，介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，使得病毒成功入侵宿主细胞并且还可引起相邻细胞质膜间的融合促进体外合胞体的形成。针对rsvf和g糖蛋白的全身性中和抗体能有效防止rsv再感染，因此rsvf和g蛋白已作为公认的保护性抗原和毒力致病分子。对于rsv而言，20世纪60年代，fulginitiva等研制的福尔马林灭活疫苗(fi-rsv)由于诱发th2型免疫过激导致2名儿童死亡和80％住院，以失败告终。目前rsv疫苗的研究主要集中在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、dna疫苗、vlp疫苗，已有多种疫苗类型正在研制，但至今无获批的rsv疫苗可用。rsv疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的rsv疫苗可见，注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、dna疫苗存在潜在安全性以及全长f、g蛋白疫苗存在潜在th1/th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。阻碍rsv疫苗研制的主要障碍有以下几点：一是大多数动物模型包括黑猩猩等均为半许可感染/复制模型，因此难以完全再现rsv的致病性；二是作为疫苗主要目标人群的新生儿免疫系统发育不成熟，同时体内存在的母传抗体能介导免疫干扰；三是rsv存在两种不同抗原亚型，而且自然感染难以产生有效的免疫保护作用；四是福尔马林灭活疫苗(fi-rsv)不仅不能防止婴幼儿感染，在嗣后的自然感染中，接种疫苗的儿童病情加重(即疾病增强作用)、甚至死亡。近年来的研究表明，以载体为基础构建的rsv活载体疫苗是目前有望用于新生儿的rsv候选疫苗rsv。活载体疫苗的种类主要包括病毒载体疫苗和细菌载体疫苗。rsv病毒载体疫苗主要包括：痘苗病毒(vacciniavirus)载体疫苗、腺病毒(adenovirus，ad)载体及副黏病毒(paramyxovirus)载体疫苗等，近年来，腺病毒载体疫苗和副黏病毒载体疫苗受到广泛关注。二、肺炎球菌及其流行病学肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)简称肺炎球菌(pneumococcus)，寄居于正常人的鼻咽腔中，是细菌性大叶性肺炎、脑膜炎、中耳炎、肺炎、支气管炎的主要病原菌。肺炎球菌导致的疾病一直是全球严重的公共卫生问题，在全世界范围内有较高的发病率和病死率，尤其是对2岁以下的儿童和老人。目前已上市的肺炎球菌荚膜糖疫苗和荚膜糖蛋白质结合疫苗，其设计都基于肺炎球菌荚膜糖，涵盖了导致肺炎球菌性疾病的最常见血清型。但肺炎球菌荚膜糖为胸腺非依赖性抗原(thymusindependentantigen，ti-ag)，抗体反应主要依赖于其重复单位组成的线性表位，在无t淋巴细胞辅助的情况下直接与b淋巴细胞表面的igm受体交联，所诱导的抗体主要为igm和igg2，缺少较好的补体活化能力，抗体水平不能维持足够长的时间，且不能诱导免疫记忆，无法在2岁以下幼儿中产生免疫保护。荚膜糖复杂的结构导致每一个血清型的免疫原性不同，无法产生有效的免疫应答。肺炎球菌结合疫苗包括血清型别多，各型别用于结合的特异性结构不同，导致其每个型别的结合方法相异。对荚膜糖的修饰及与载体蛋白的结合要在保证荚膜糖特异基团不丢失、抗原性和免疫原性不受影响的前提下进行，同时为了避免糖链的过度交联和结合物除菌过滤的要求，对荚膜糖及结合物分子的大小应当有一定控制。7价疫苗于2000年2月在美国获准使用。由于肺炎球菌型别多，在结合疫苗的制作过程需要结合蛋白成分，因蛋白成分可以引起局部反应，所以生产包含12个型别以上的结合疫苗就很困难。结合疫苗在初次免疫后活的抗体浓度仅能维持几个月，随后就会下降到免疫前水平；并且结合疫苗的整个工艺过程中需要加入多种化学试剂参与反应，并且荚膜糖蛋白结合疫苗的血清型覆盖率低和非疫苗血清型肺炎球菌感染性疾病的增加使得更多研究者开始关注其他方向的肺炎球菌疫苗开发。使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗已成为近十年来肺炎疫苗的研发主流，具有种属特异性抗原为基础的疫苗广受研发人员的重视，吸引了大量的目光。但由于蛋白本身的结构及理化性质的限制，很多肺炎球菌蛋白无法直接用于人体免疫，需要花费大量的人力和物力进行研究及临床验证。蛋白疫苗利用生物工程技术合成蛋白抗原，蛋白抗原由于其选用的均为高度保守的肺炎球菌特异性蛋白，从而消除了不同血清型之间的免疫差异，并且由于不需要其他类型的通用蛋白载体，消除了现有的肺炎球菌疫苗不能与通用载体蛋白同类型的疫苗同时联合使用的障碍；其蛋白抗原本身也可以作为载体蛋白与肺炎球菌荚膜糖进行自发性组合，因此免疫效果更好，实现了特异性免疫与广泛免疫的联合实现。三、活菌载体疫苗概述活菌载体疫苗是将异源抗原基因插入活细菌的染色体或质粒载体中，激发免疫系统提呈异源抗原并产生免疫保护，从而达到预防一种或多种疾病的新型疫苗。活的减毒细菌疫苗载体因具有：生产相对低廉；操作方法简便易行；可以携带较大的基因片段，易于构建多价疫苗；以及免疫佐剂活性等优点，被广泛用于疫苗研究。沙门氏菌是目前的细菌载体方面的研究热点，沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，可用其作为疫苗载体携带原核表达质粒和真核表达质粒，重组减毒沙门氏菌疫苗制备简单，免疫方便，有较强的免疫原性，能诱导持久的免疫反应，尤其可诱导较强的黏膜免疫反应。但沙门氏菌是一种非常重要的人兽共患细菌病，主要引起人和动物的肠炎、败血症等。因此以沙门氏菌作为细菌载体，需要对其进行减毒处理，减毒沙门氏菌是通过物理、化学或基因工程等方法，使沙门氏菌某些特定的基因发生不可逆的突变，使其毒力大大降低，感染宿主细胞后可在体内生长繁殖。研究表明减毒沙门氏菌在肠道的侵入机制主要包括上皮细胞途径和非上皮细胞途径两种。携带质粒dna的减毒沙门氏菌被巨噬细胞、树突状细胞等细胞吞噬后，这些吞噬细胞被激活活化，开始分化并向脾脏和淋巴结等组织迁移，在此期间减毒沙门氏菌死亡，裂解释放其携带的真核质粒，真核质粒经过“特定转运”和“渗漏”进入吞噬细胞的细胞质，再进入细胞核转录后于细胞质表达外源抗原。由于沙门氏菌作为载体递呈疫苗具有很大的有点，且易于保证体内的免疫平衡，rsv病毒疫苗又具有上述缺陷，因此取长补短，将目光集中在新型载体与rsv病毒的结合上，是本领域研究人员对于rsv疫苗的研究新方向。肺炎球菌由于其血清型多，导致其抗原本身的抗原结构大稳定性差，难以与其他疫苗联合共存使用，但肺炎等下呼吸道感染类疾病的诱发病因较多，很难通过单一疫苗来实现全方位的免疫预防。因此研究一款自身免疫原性够好、能够稳定存在的联合疫苗成为了疫苗研发领域的当务之急。技术实现要素：本申请人的目的是基于在先申请cn2017102214206、cn2017102598140及cn2017105857749的基础上，对重组蛋白载体的另一应用拓展，以解决现有产品中无呼吸道合胞病毒-肺炎球菌联合疫苗的技术空白。本发明的主要目的在于提供一种rsv-pcv疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括：a.rsv(呼吸道合胞病毒)免疫中间体，所述rsv免疫中间体的抗原为可引起机体免疫反应的rsv膜表面融合蛋白f和/或附着蛋白g，其中表达蛋白抗原的核酸序列重组在核酸载体上，重组蛋白的核酸序列以减毒胞内细菌为细菌载体；b.pcv(肺炎球菌)免疫中间体，所述pcv免疫中间体包括肺炎球菌多糖抗原及蛋白载体，其中蛋白载体为重组蛋白载体，由大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(ltb)蛋白及霍乱弧菌肠毒素b亚单位蛋白(ctb)重组获得，ltb核酸序列与ctb核酸序列通过引物序列桥接，编码的载体蛋白序列如序列表seqidno：8所示；上述组分的免疫中间体分别制备，临用混合。rsv特异性蛋白为可以特异性引起rsv免疫反应的蛋白，优选为f蛋白，表达f蛋白序列的基因序列如序列表seqidno：1所示，根据表达蛋白的核酸序列设计特异性引物，引物序列如序列表seqidno：2和seqidno：3所示，引物结合后的待扩增序列如序列表seqidno：4所示。重组的rsv蛋白抗原为pcdna3.1-f。减毒胞内细菌载体选自：l3261、sl7207或ty21a。优选地，转染至细菌载体内的rsv抗原为sl7207/pcdna3.1-f。pcv免疫中间体中编码的重组载体蛋白的基因序列如序列表seqidno：7所示，如序列表seqidno：7所示的载体蛋白为ltb蛋白的c端连ctb蛋白的n端，ltb基因与ctb基因之间通过引物连接，ltb基因的r端引物序列如序列表seqidno：12所示，ctb基因的f端引物序列如序列表seqidno：13所示；ltb基因的f端引物序列如序列表seqidno：11所示，ctb基因的r端引物序列如序列表seqidno：14所示。所述肺炎球菌多糖抗原是分离提纯血清型肺炎球菌荚膜上的多糖，所述肺炎球菌的血清型包括4、6b、9v、14、18、19f和23f。优选地，肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白的每种血清型与蛋白之间的质量比为1.5～4.5:1。rsv免疫中间体及pcv免疫中间体均为冻干粉剂，临用混悬。本发明中所述rsv免疫中间体的制备方法包括如下步骤：a.培养rsv病毒，采用病毒rna/dna快速纯化试剂盒分别提取rsv及流感病毒的菌体rna，将提取出的菌体rna进行逆转录(rt)，以逆转录有的cdna产物为模板进行f蛋白基因序列扩增；b.根据rsv病毒蛋白表达序列设计特异性引物，特异性引物序列如序列表seqidno：2和seqidno：3所示，引物连接待扩增序列及表达载体pcdna3.1-f；c.连接后的表达载体转染至减毒沙门氏菌sl7207中，构建抗原sl7207/pcdna3.1-f。优选地，步骤b具体为：根据rsv病毒蛋白表达序列设计特异性引物，上游特异性引物序列如序列表seqidno：2所示，限制性内切酶位点为hindiii，下游特异性引物序列如序列表seqidno：3所示，限制性内切酶位点为xhoi引物连接待扩增序列及表达载体pcdna3.1-f。本发明中pcv免疫中间体的制备方法包括如下步骤：a.根据ltb和ctb的cds区核酸序列，设计两对引物，构建pet28a-ltb-ctb质粒，pcr扩增后，通过bamhⅰ和xhoⅰ双酶切，凝胶回收ltb-ctb片段和表达载体pet28a；b.连接转化大肠杆菌dh5α菌株，筛选阳性克隆后进行单克隆扩增，iptg诱导后鉴定；c.取制备好的肺炎球菌荚膜多糖及重组载体蛋白，以重组ltb-ctb载体蛋白与多糖以1：2质量比混合反应。本发明的疫苗，可用公知技术加工成供临床用的各种制剂，所述的制剂选自液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型、片剂、丸剂中的一种，优选剂型是液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型，更优选液体剂型和冻干剂型。本发明的疫苗接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服，还包括鼻腔、口腔、肛门、阴道黏膜途径。总之，本发明提供的rsv-pcv疫苗主要的优点在于：1、以载体为基础构建的rsv活载体疫苗可在人细胞内从头合成，形成的蛋白质构象与rsv自然感染后表达的完全相同，减毒沙门氏菌既可携带原核表达质粒也可携带真核表达质粒，不会导致抗原表位的丧失或变化，形成的免疫力更利于抵抗随后的自然感染；2、避免了rsv存在的体外繁殖滴度低和稳定性差的问题，重组减毒沙门氏菌疫苗生产工艺简单，疫苗易于储存和运输，因此疫苗的成本相对较低，有利于疫苗的大规模制备和运送；3、重组减毒菌疫苗可经口服免疫、鼻内免疫和直肠免疫等多种途径免疫，疫苗可被直接递呈到apc细胞，运送效率高，能有效激发细胞免疫和体液免疫，经黏膜途径免疫不会产生疾病增强作用，且能突破母传抗体的干扰；4、rsv活载体疫苗采用的载体为减毒胞内细菌载体，因而兼有常规活疫苗的免疫效力高、成本低及灭活疫苗的安全性好等优点，减毒沙门氏菌具有免疫佐剂作用，且免疫具有持续性，以减毒沙门氏菌为载体表达的外源蛋白对宿主持续刺激，不需要反复加强免疫；5、本发明采用重组载体蛋白连接肺炎球菌的多种荚膜糖，该载体蛋白还具有激活黏膜免疫的佐剂效果，与肺炎球菌抗原组合后，不仅可以引起高滴度的血清抗体，还可以快速长时间的引起黏膜血清抗体；6、肺炎球菌抗体可选肺炎球菌蛋白及肺炎球菌荚膜多糖，当疫苗的价态较高时，可采用重组的蛋白载体与肺炎球菌同源蛋白组合使用，不仅能够增强现有肺炎球菌血清型引发的免疫反应，而且可以引起肺部的黏膜免疫；7、使用重组载体蛋白的肺炎球菌疫苗具有一定的结构弹性，具有多种多糖蛋白的组合组合，载体蛋白促进机体产生特异性抗原，但本身不致病，也不会产生交叉性的免疫影响，易于与其他疫苗联合使用，副作用小，安全性好；8、肺炎球菌疫苗与rsv疫苗联合用药，可以在很大程度上同时引起免疫反应，使接种者的下呼吸道感染发病率大大降低。附图说明图1是本发明实施例提供的f蛋白pcr扩增产物电泳图。图2是本发明实施例提供的阳性质粒构建插入位点图。图3是本发明实施例提供的小鼠体内感染的f蛋白pcr扩增产物电泳图。图4是本发明提供的构建pet28a-ltb-ctb质粒的质粒示意图。图5是本发明提供的重组ltb-ctb载体蛋白诱导纯化结果示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。一、呼吸道合胞病毒(rsv)的质粒构建、表达和纯化本实施例选择rsvf蛋白的cds区基因(geneid：1489825)进行扩增，f蛋白的cds区基因如序列表seqidno：1所示，根据f基因的特异性设计上下游引物，上游引物序列如序列表seqidno：2所示，下游引物如序列表seqidno：3所示，结合引物后的待扩增片段如序列表seqidno：4所示。1.呼吸道合胞病毒的培养1.1采用vero细胞对rsv进行培养取复苏并进行继代培养的vero细胞，清洗后接入稀释的病毒，37℃吸附1h，每间隔15min摇动接毒细胞一次，使病毒充分感染细胞；倒掉接毒细胞瓶的病毒稀释液和未接毒细胞瓶的培养液，分别加6～8ml含2％血清的dmem维持液，37℃co2孵箱中培养，第二天起每天根据对照观察一次细胞病变。当细胞出现75％病变时收毒(约需要7d)，即将培养液于-80℃反复冻融3次后，10000r/min离心10min，无菌操作取上清，分装，于-80℃冰箱长期保存。1.2rsv病毒rna总提采用depc(焦炭酸二乙酯)对提取rna需要的离心管、枪头及pcr管进行去rna处理，并采用rna/dna试剂盒提取rsvdna。本实施例中采用的提取试剂盒为takara小量病毒rna/dna提取试剂盒，按说明书操作即可。提取出的rna需立即使用或置于-80℃冰箱保存备用。1.3rt-pcr发转录体系采用25μl体系，加入rna12μl，通用引物olingo(d)t181μl轻轻混匀，70℃孵育5min，冰浴2min。向离心管中加入amv1μl，amvbuffer5μl，dntp5μl，rnaseinhibitor1μl轻轻混匀，42℃孵育60min。70℃10min灭活转录酶。得到的产物cdna需立即使用或于-20℃长期保存备用。根据rsvf蛋白cds片段设计特异性引物，引物序列由5’端至3’端依次为保护碱基-酶切位点-连接引物，上游酶切位点为hindiii酶切位点，下游酶切位点为xhoi酶切位点，引物序列具体如下：f:：5'-ccc-aagctt-cagaaaaccgtgacctatcaag-3'r：5'-cc-ctcgag-acatgaagttttgcctcactagta-3'pcr体系采用25μl体系，加入10×rtaqbuffer2.5μl，dntp2μl，rtaq0.25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，水17.25μl，rt-pcr产物cdna1μl；扩增f全长片段的反应条件：94℃5min，94℃50s，55℃退火50s，72℃延伸1.5min，25个循环，72℃延伸10min，4℃结束；扩增g全长片段的反应条件：94℃5min，94℃45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，25个循环，72℃延伸7min，4℃结束。1.4产物检验及纯化采用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行电泳检测，检测后确认f基因片段大小为524bp的pcr扩增片段。扩增产物电泳图如图1所示，图中条带1位f基因，条带m1为标准dnamarker，条带清晰，符合预期理论值。采用dna凝胶回收试剂盒回收纯化pcr产物。-20℃保存。引物连接后的待扩增片段具体如下：cttagttattcaaaaactacatcttagcagaaaaccgtgacctatcaagcaagaacgaaattaaacctggggcaaataaccatggagctgctgatccacaggttaagtgcaatcttcctaactcttgctattaatgcattgtacctcacctcaagtcagaacataactgaggagttttaccaatcgacatgtagtgcagttagcagaggttattttagtgctttaagaacaggttggtataccagtgtcataacaatagaattaagtaatataaaagaaaccaaatgcaatggaactgacactaaagtaaaacttataaaacaagaattagataagtataagaatgcagtgacagaattacagctacttatgcaaaacacaccagctgccaacaaccgggccagaagagaagcaccacagtatatgaactatacaatcaataccactaaaaacctaaatgtatcaataagcaagaagaggaaacgaagatttctgggcttcttgttaggtgtaggatctgcaatagcaagtggtatagctgtatccaaagttctacaccttgaaggagaagtgaacaagatcaaaaatgctttgttatctacaaacaaagctgtagtcagtctatcaaatggggtcagtgttttaaccagcaaagtgttagatctcaagaattacataaataaccaattattacccatagtaaatcaacagagctgtcgcatctccaacattgaaacagttatagaattccagcagaagaacagcagattgttggaaatcaacagagaattcagtgtcaatgcaggtgtaacaacacctttaagcacttacatgttaacaaacagtgagttactatcattgatcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaaattaatgtcaagcaatgttcagatagtaaggcaacaaagttattctatcatgtctataataaaggaagaagtccttgcatatgttgtacagctacctatctatggtgtaatagatacaccttgctggaaattacacacatcacctctatgcaccaccaacatcaaagaaggatcaaatatttgtttaacaaggactgatagaggatggtattgtgataatgcaggatcagtatccttctttccacaggctgacacttgtaaagtacagtccaatcgagtattttgtgacactatgaacagtttgacattaccaagtgaagtcagcctttgtaacactgacatattcaattccaagtatgactgcaaaattatgacatcaaaaacagacataagcagctcagtaattacttctcttggagctatagtgtcatgctatggtaaaactaaatgcactgcatccaacaaaaatcgtgggattataaagacattttctaatggttgtgactatgtgtcaaacaaaggagtagatactgtgtcagtgggcaacactttatactatgtaaacaagctggaaggcaagaacctttatgtaaaaggggaacctataataaattactatgaccctctagtgtttccttctgatgagtttgatgcatcaatatctcaagtcaatgaaaaaatcaatcaaagtttagcttttattcgtagatctgatgaattactacataatgtaaatactggcaaatctactacaaatattatgataactacaattattatagtaatcattgtagtattgttatcattaatagctattggtttgctgttgtattgcaaagccaaaaacacaccagttacactaagcaaagaccaactaagtggaatcaataatattgcattcagcaaatagacaaaaaaccacctgatcatgtttcaacaacagtctgctgatcaccaatcccaaatcaacccataacaaacacttcaacatcacagtacaggctgaatcatttcttcacatcatgctacccacacaactaagctagatccttaactcatagttacataaaaacctcaagtatcacaatcaaacactaaatcaacacatcattcacaaaattaacagctggggcaaatatgtcgcgaagaaatccttgtaaatttgagattagaggtcattgcttgaatggtagaagatgtcactacagtcataattactttgaatggcctcctcatgccttactagtgaggcaaaacttcatgttaaacaagatactcaagtcaatggacaaaagcatagacactttgtctgaaataagtggagctgctgaactggacagaacagaagaatatgctcttggtatagttggagtgctagagagttacataggatctataaacaacataaca片段中下划线位置为f蛋白的启动子和终止子。根据上述引物，采用表达载体pcdna3.1构建pcdna3.1-f，将f蛋白基因片段克隆入pcdna3.1的cmv启动子下游，构建成真核表达质拉pcdna3.1-f。构建成功的部分连接片段如图2所示。分别扩增f蛋白基因序列和pcdna3.1质粒，限制性内切酶酶切pcr产物和pcdna3.1，双酶切产物后连接，完成质粒构建。pcr质粒pcr产物f片段长约2150bp，与预期pcr产物一致。阳性质粒序列测定结果与原f基因序列完全一致。双酶切载体和目的片段位置也与预期一致。证明阳性质粒构建成功。二、重组真核表达质粒导入减毒沙门氏菌2.1减毒沙门氏菌感受态细胞的制备在lb平板上划线培养鼠伤寒沙门氏菌sl7207；挑取单个菌落接种3mllb液体培养基，37℃过夜振荡培养；每5mllb液体培养基接种100μl过夜培养物，37℃，225prm振荡培养，至od600nm＝0.6；培养物冰浴30min，4000rpm离心10min；倾去所有营养液，用等体积、冰浴的wb溶液重悬细菌，4000prm，离心10min(wb＝10％甘油，90％双蒸水，过滤)；重复上一步2次：倾去大部分wb，使剩余体积为50μl(每10ml原始培养物制备感受态细胞50μl，即0.5％)，混匀即为感受态细胞。2.2电转化每40ul感受态细胞中加入5μl质粒pcdna3.1-f、pcdna3.1以及荧光质粒pegfp，混匀；吸取40μl加入冰预冷的电极杯中，进行电转化。参数设置为2.5kv，200ω，25μf，t≈4.5-5.0ms。另取不加质粒的感受态细胞电转化作对照：电击后，立即向电极杯中加入1mllb，混匀，37℃振荡培养1h；取200μl铺带有ampr抗性的lb平板，37℃过夜培养。挑取转化出的菌落在带有ampr的lb液体培养基中培养至od600nm＝1.0；提取质粒后电泳鉴定，证明与已知质粒大小相同。三、重组的沙门氏菌载体呼吸道合胞病毒免疫学评价3.1感染腹腔原代巨噬细胞预试验取小鼠腹腔原代巨噬细胞，摘除眼球放血后，断颈处死小鼠，用75％的乙醇浸泡小鼠；将小鼠固定，无菌打开小鼠腹部的皮肤，暴露腹膜；将10ml37℃水浴的无血清培养基rpmi1640沿耻骨前沿、腹中线一侧注射入小鼠的腹腔，不要拔出针头，然后用手指轻轻按摩腹部；无菌收集腹水，并分离巨噬细胞。将分离的巨噬细胞进行细胞计数，种植24孔细胞板，5×105～1×106个cell/孔，在含有rpmi培养基的细胞瓶中37℃吸附2h；用无抗生素的不完全培养基rpmi1640洗涤细胞2次，以除去未吸附的细胞；5000rpm离心收集菌体，用0.01mol/lpbs(ph7.4)重悬；将减毒沙门氏菌计数后与细胞数按1:1、5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、500:1和1000:1不同的比例加入到24孔细胞板中每个比例重复3孔，37℃孵育30min；用0.01mol/lpbs(ph7.4)洗涤细胞3次，再用含有100mg/l的硫酸庆大霉素的rpmi1640培养液培养细胞2h，以杀死胞外菌；再向细胞培养物中加入10mg/l的四环素，37℃孵育2h，以阻断胞内菌的繁殖；再换用含有10mg/l的硫酸庆大霉素的rpmi1640(含有10％fcs)继续培养48-96h，每隔12h观察有无污染出现，以确定感染量。将重组减毒沙门氏菌与巨噬细胞按moi＝20作用，感染后48～72h用荧光显微镜观察细胞中有无绿色荧光表达。在感染后48h和72h都能够看见大约有34/的细胞中有绿色荧光表达，而对照中没有发现荧光，3.2重组减毒沙门氏菌体内感染试验本实施例采用小鼠进行体内感染试验，口服给药。取6-8周龄雌性小鼠，分成4组，sl7207/pcdna3.1-f一组，对照sl7207/pcdna3.l一组，fi-rsv疫苗作为疫苗阳性对照一组，pbs组作为阴性对照。免疫前30min先用7.5％的nhaco3灌胃中和胃酸，100μl/只，然后口服免疫重组菌(108cfu/只，200μl)。分别在口服免疫后0h、24h、48h和72h，提取肠道粘膜的总rna，每次2只。剪取小肠粘膜约100mg，剪碎后加入1.0moltrizol试剂，用组织捣碎机匀浆，在15～30℃温育5min；加入200μl的氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡15s；15～30℃温育2-3mni；2-8℃12000g离心15min；转移水相到一新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，15i-30℃作用10min，2-8℃12000g离心10min；弃去上清液，加入75％乙醇l.0ml，振摇，2-8℃7500g离心5min；弃去上清，干燥沉淀物(室温约5min)；加入20μldepc水溶解，-20℃保存。提取总rna后，进行反转录cdna合成及pcr扩增，扩增目的基因f的是否转录表达。扩增时用β-actin作为内参。β-actin特异性引物：pβl序列为5’-gtgggccgctctaggcaccaa-3’；pβ2序列为5’-ctctttgatgtcacgcacgatttc-3’；f蛋白基因：94℃预变性3min，35个cycle，72℃延伸10min，产物置冰箱待测。β-actin：取反转录产物2.0μl，加入pcr混合液48.0μl，包括pβ1、pβ2各40pmol，94℃预变性5min，35个cycle，72℃延伸5min，产物置冰箱待测。pcr产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检验，检验结果如图3所示。图中条带1为f蛋白基因，条带2为β-actin基因。检验结果显示条带位置正确清晰，说明目的基因f正确转录表达。四、重组ltb和ctb蛋白的表达与纯化根据genebank登录的ltb和ctb核酸序列和氨基酸序列，具体序列如下：核酸，ltb核酸序列(375bp)如序列表seqidno：5所示，由此核酸序列编码出的氨基酸序列(124a.a，mw＝14133.74)如序列表seqidno：6所示。ctb核酸序列(375bp)如序列表seqidno：7所示，由此核酸序列编码出的ctb氨基酸序列(124a.a.mw＝13896.46)如序列表seqidno：8所示。选择pet28a作为载体，根据genebank登录的ltb和ctb的全长cds序列，设计引物如下：ltb-fwd由5’端至3’端依次为：保护碱基--bamhⅰ酶切位点--ltb蛋白n端序列。引物(如序列表seqidno：11所示)具体如下：5’-cg--ggatcc--atgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgtta-3’ltb-rev由5’端至3’端依次为：保护碱基--eco311酶切位点--ctb蛋白n端序列--ltb蛋白c端序列。引物(如序列表seqidno：12所示)具体如下：5’-ctag--ggtctc--cat--gtttttcatactgattgccgcaa-3ctb-fwd由5’端至3’端依次为：保护碱基--eco311酶切位点--ltb蛋白c端序列--ctb蛋白n端序列。引物(如序列表seqidno：13所示)具体如下：5’-ctag--ggtctc--aac--atgattaaattaaaatttggtgttttttttacagtttta-3’ctb-rev由5’端至3’端依次为：保护碱基--xhoⅰ酶切位点--ctb蛋白c端序列。引物(如序列表seqidno：14所示)具体如下：5’-cc--ctcgag--ttaatttgccatactaattgcggcaa-3’如图4所示，构建pet28a-ltb-ctb质粒。由于ltb和ctb的具有较高的同源性，因此在ltb片段插入ctb的片段，以引物连接，搭桥进行pcr，可扩增得到重组ltb-ctb载体蛋白全长片段。构建的pet28a质粒的全序列如序列表seqidno：9所示，编码的氨基酸序如序列表seqidno：10所示。载体和pcr产物通过bamhⅰ和xhoⅰ双酶切后，凝胶回收ltb和ctb片段。胶回收后，用dna连接酶，16℃连接过夜，连接转化大肠杆菌dh5α，单克隆扩增，小提质粒后，bamhi和xhoⅰ双酶切鉴定的约800bp条带，在氨苄青霉素抗性下筛选阳性克隆，阳性筛选后测序，将测序结果在ncbi网站进行比对，结果完全正确。重组ltb-ctb载体蛋白在20℃诱导30h，iptg浓度为0.3mmol/l，诱导条件最佳。诱导后去适量超声波裂解产物的上清和沉淀进行sds-page，同时设诱导前的蛋白做为对照。破菌后，发现表达蛋白质以包涵体形式存在。将包涵体洗涤后，用8mol/l的尿素溶解，经复性液复性，再经谷胱甘肽转硫酶(gst)亲和层析柱纯化，得到纯度约为93％的重组融合蛋白。sds-page结果显示重组菌裂解沉淀中出现一条约30kd的额外条带，与预期结果相近。由于蛋白主要以包涵体的形式表达，因此选择较低温度的长时间诱导，以保证蛋白表达量。诱导表达的纯化结果如图5所示，条带1为蛋白marker；2为诱导前总的蛋白；3为诱导后总的蛋白；4为细菌破碎液离心后上清；5为细菌破碎液离心后沉淀；条带6为冻干后的重组ltb-ctb载体蛋白。五、制备肺炎球菌蛋白-荚膜多糖结合体5.1.1肺炎球菌多糖(7价)的制备选取7种血清型(4、6b、9v、14、18c、19f、23f)的肺炎球菌发酵培养后，采用沙培离心机、碟片式离心机或其他大容量离心机分离培养液，收集离心上清；将离心上清以100kd膜包超滤浓缩，采用25～80％的乙醇进行分级沉淀，收集沉淀并用无水乙醇及丙酮分别洗涤，得到粗制多糖；灭菌注射用水溶解多糖并经脱氧胆酸钠处理后，采用离子交换填料，以串联层析或分步层析的方法进行粗糖精制，收集流穿峰，采gesephadexg25coarse对流穿峰进行脱盐，乙醇沉淀或冻干回收多糖，置于-20℃保存备用。5.1.2重组ltb-ctb载体蛋白肺炎球菌多糖结合物将纯化备用的重组ltb-ctb载体蛋白以氨基还原法与肺炎球菌荚膜多糖进行偶联，具体为将上述步骤获得的重组ltb-ctb载体蛋白与多种荚膜糖以1：2质量比混合。取各血清型多糖溶于ph7.2的150mmol/lpbs中，加入过碘酸钠(终浓度为2mmol/l)室温氧化10min，以制备10ml疫苗原液为例，加入荚膜多糖4、9v、14、19f及23f各40μg，寡糖18c20μg及多糖6b80μg，加入乙二醇(终浓度为25mmol/l)终止反应。用150mmol/lpbs透析3次后加入预先复溶的重组ltb-ctb载体蛋白160μg，室温轻轻搅拌5d，出现颗粒状结合物，在4℃离心10min收集。经凝胶层析柱层析纯化，得到纯化的肺炎球菌与重组ltb-ctb的结合物。重组ltb-ctb载体蛋白肺炎球菌多糖结合物可选择冻干剂型，便于储存与运输。冻干剂型蔗糖作为冻干骨架，其中蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量不大于20％，冻干后得到肺炎球菌荚膜糖-蛋白疫苗冻干制剂。5.1.3重组ltb-ctb载体蛋白肺炎球菌多糖结合物检验将结合产物通过凝胶过滤层析柱进行纯化，洗脱液为0.2mnacl，检测紫外280nm处的吸光值，收集个洗脱峰内的物质。采用sds-page法确认结合产物中含有重组ltb-ctb组分，并检测蛋白含量。采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，确认产物中多糖含量约为95μg/ml。通过gm1-elisa检测结合产物是否与小肠表面的gm1结合，刺激黏膜系统产生黏膜iga。具体测定方法如下：1)包被：用碳酸盐包被缓冲液将gm1稀释至10μg/ml。在96孔板的每个反应孔中加100μl上述包被抗原，4℃放置过夜。次日，移去孔内溶液，用洗涤缓冲液pbst洗3次；2)封闭：加4％的bsa溶液200μl于上述已包被的反应孔中，37℃放置2小时。弃去封闭液，洗涤3次；3)加样：分别加入一系列稀释梯度的ctb溶液和结合物样品溶液，每孔100μl，置于37℃孵育1.5小时，然后洗涤3次；4)加一抗：每孔加入1：4000稀释的兔抗ctbigg抗体100μl，37℃孵育2小时；5)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标驴抗兔igg抗体100μl，37℃孵育1小时，洗涤3次；6)加底物液显色：于各反应孔中加入tmb底物溶液100μl，室温放置10～15分钟；7)终止反应：于各反应孔中加入2m硫酸50μl；8)读数：在酶标仪上，于紫外450nm处检测各孔的吸光值，打印记录。检测结果显示，ctb纯蛋白的od值为0.30左右，且与gm1的结合能力稳定。重组ltb-ctb蛋白的od值在0.25～0.48之间波动，说明结合产物中的重组ltb-ctb仍然维持与gm1结合的能力，并且该能力是稳定的，可以引起良好的黏膜免疫反应。各峰值处于预计结果完全相同。收集各峰产物，并进行gm1-elisa检测，确认结合产物中的重组ltb-ctb仍然维持与gm1结合的能力，并且该能力是稳定的，可以引起良好的黏膜免疫反应。六、rsv-pcv疫苗的免疫学评价6.1小鼠体内igg抗体滴度检测取40只5周龄的雌性balb/c小鼠，随机分为4组，即fi-rsv组、沛儿组、rsv-pcv疫苗组、pbs阴性对照组，每组10只小鼠。腹腔注射、每只每次注射5μg，每周注射一次，共注射3次，21天后眼眶取血。用elisa法检测小鼠血浆中肺炎球菌各血清型igg抗体滴度及rsvigg抗体滴度。实验结果见表1。表1由上表1可知，本发明中的rsv-pcv联合疫苗可以有效地引起小鼠体内的pcv、rsv两种免疫反应，产生免疫效果，但与现有疫苗相比抗体滴度略低，可能是由于两种抗原在体内引发了免疫竞争，导致抗体滴度略低于现有单苗产品，这一点可以作为后续的研发方向继续深入研究。6.2小鼠体内iga抗体滴度检测取40只5周龄的雌性balb/c小鼠，随机分为4组，分别为fi-rsv组、沛儿组、rsv-pcv疫苗组、阴性对照(sl7207空白菌)组。用1.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，至小鼠不再活动后，将rsv-pcv混合物用无菌枪头逐滴滴入实验组小鼠鼻腔，每只30μl(含15μg疫苗混合物)，同时用sl7207空白菌滴注对照组小鼠鼻腔，每只30μl；每周免疫一次，连续免疫四周。末次免疫一周后，将卡巴胆碱经腹腔注入小鼠体内使其产生唾液，每只小鼠30ul，用无菌枪头收集唾液(粘膜免疫组采集)；用pbs将各组小鼠唾液从1：200开始倍比稀释至1：25600，间接elisa检测抗体效价。黏膜免疫检测唾液iga滴度(几何平均值)。检测结果见表2。表2fi-rsvpcv7(沛儿)rsv-pcv阴性对照4型--5861781106b型--7356779909v型--89939631014型--60137141018型--79138515019f型--90369581023f型--762987910rsv7022--106400由上表可知，混合后使用的rsv-pcv疫苗中的细菌载体起到了一定的黏膜佐剂的作用，相比现有产品，黏膜免疫抗体滴度有小幅增加，但在pcv抗原的抗体方面未发现显著效果，可能是由于细菌载体为rsv抗原的载体，对pcv的促进作用不足，也有可能是不同抗原之间的免疫竞争引起的，关于黏膜免疫的具体原理及深入分析，可作为后续实验的研究课题继续讨论。最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。sequencelisting<110>武汉博沃生物科技有限公司<120>rsv-pcv疫苗及其制备方法<130>2017<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>1725<212>dna<213>respiratorysyncytialvirus<220><223>fcdsdna<400>1atggagctgctgatccacaggttaagtgcaatcttcctaactcttgctattaatgcattg60tacctcacctcaagtcagaacataactgaggagttttaccaatcgacatgtagtgcagtt120agcagaggttattttagtgctttaagaacaggttggtataccagtgtcataacaatagaa180ttaagtaatataaaagaaaccaaatgcaatggaactgacactaaagtaaaacttataaaa240caagaattagataagtataagaatgcagtgacagaattacagctacttatgcaaaacaca300ccagctgccaacaaccgggccagaagagaagcaccacagtatatgaactatacaatcaat360accactaaaaacctaaatgtatcaataagcaagaagaggaaacgaagatttctgggcttc420ttgttaggtgtaggatctgcaatagcaagtggtatagctgtatccaaagttctacacctt480gaaggagaagtgaacaagatcaaaaatgctttgttatctacaaacaaagctgtagtcagt540ctatcaaatggggtcagtgttttaaccagcaaagtgttagatctcaagaattacataaat600aaccaattattacccatagtaaatcaacagagctgtcgcatctccaacattgaaacagtt660atagaattccagcagaagaacagcagattgttggaaatcaacagagaattcagtgtcaat720gcaggtgtaacaacacctttaagcacttacatgttaacaaacagtgagttactatcattg780atcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaaattaatgtcaagcaatgttcagata840gtaaggcaacaaagttattctatcatgtctataataaaggaagaagtccttgcatatgtt900gtacagctacctatctatggtgtaatagatacaccttgctggaaattacacacatcacct960ctatgcaccaccaacatcaaagaaggatcaaatatttgtttaacaaggactgatagagga1020tggtattgtgataatgcaggatcagtatccttctttccacaggctgacacttgtaaagta1080cagtccaatcgagtattttgtgacactatgaacagtttgacattaccaagtgaagtcagc1140ctttgtaacactgacatattcaattccaagtatgactgcaaaattatgacatcaaaaaca1200gacataagcagctcagtaattacttctcttggagctatagtgtcatgctatggtaaaact1260aaatgcactgcatccaacaaaaatcgtgggattataaagacattttctaatggttgtgac1320tatgtgtcaaacaaaggagtagatactgtgtcagtgggcaacactttatactatgtaaac1380aagctggaaggcaagaacctttatgtaaaaggggaacctataataaattactatgaccct1440ctagtgtttccttctgatgagtttgatgcatcaatatctcaagtcaatgaaaaaatcaat1500caaagtttagcttttattcgtagatctgatgaattactacataatgtaaatactggcaaa1560tctactacaaatattatgataactacaattattatagtaatcattgtagtattgttatca1620ttaatagctattggtttgctgttgtattgcaaagccaaaaacacaccagttacactaagc1680aaagaccaactaagtggaatcaataatattgcattcagcaaatag1725<210>2<211>31<212>dna<213>artificialsequence<220><223>f-f引物<400>2cccaagcttcagaaaaccgtgacctatcaag31<210>3<211>32<212>dna<213>artificialsequence<220><223>f-r引物<400>3ccctcgagacatgaagttttgcctcactagta32<210>4<211>2306<212>dna<213>artificialsequence<220><223>待扩增片段<400>4cttagttattcaaaaactacatcttagcagaaaaccgtgacctatcaagcaagaacgaaa60ttaaacctggggcaaataaccatggagctgctgatccacaggttaagtgcaatcttccta120actcttgctattaatgcattgtacctcacctcaagtcagaacataactgaggagttttac180caatcgacatgtagtgcagttagcagaggttattttagtgctttaagaacaggttggtat240accagtgtcataacaatagaattaagtaatataaaagaaaccaaatgcaatggaactgac300actaaagtaaaacttataaaacaagaattagataagtataagaatgcagtgacagaatta360cagctacttatgcaaaacacaccagctgccaacaaccgggccagaagagaagcaccacag420tatatgaactatacaatcaataccactaaaaacctaaatgtatcaataagcaagaagagg480aaacgaagatttctgggcttcttgttaggtgtaggatctgcaatagcaagtggtatagct540gtatccaaagttctacaccttgaaggagaagtgaacaagatcaaaaatgctttgttatct600acaaacaaagctgtagtcagtctatcaaatggggtcagtgttttaaccagcaaagtgtta660gatctcaagaattacataaataaccaattattacccatagtaaatcaacagagctgtcgc720atctccaacattgaaacagttatagaattccagcagaagaacagcagattgttggaaatc780aacagagaattcagtgtcaatgcaggtgtaacaacacctttaagcacttacatgttaaca840aacagtgagttactatcattgatcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaaatta900atgtcaagcaatgttcagatagtaaggcaacaaagttattctatcatgtctataataaag960gaagaagtccttgcatatgttgtacagctacctatctatggtgtaatagatacaccttgc1020tggaaattacacacatcacctctatgcaccaccaacatcaaagaaggatcaaatatttgt1080ttaacaaggactgatagaggatggtattgtgataatgcaggatcagtatccttctttcca1140caggctgacacttgtaaagtacagtccaatcgagtattttgtgacactatgaacagtttg1200acattaccaagtgaagtcagcctttgtaacactgacatattcaattccaagtatgactgc1260aaaattatgacatcaaaaacagacataagcagctcagtaattacttctcttggagctata1320gtgtcatgctatggtaaaactaaatgcactgcatccaacaaaaatcgtgggattataaag1380acattttctaatggttgtgactatgtgtcaaacaaaggagtagatactgtgtcagtgggc1440aacactttatactatgtaaacaagctggaaggcaagaacctttatgtaaaaggggaacct1500ataataaattactatgaccctctagtgtttccttctgatgagtttgatgcatcaatatct1560caagtcaatgaaaaaatcaat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