本发明属于生物技术领域，涉及一种甲型流感病毒重组蛋白、编码该重组蛋白的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的质粒载体、转化含有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述的重组蛋白制备甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，并应用于甲型流感病毒早期诊断。
背景技术：
流行性感冒(流感)多数是由甲型流感病毒引起的急性呼吸道感染，其传染性强、传播速度快，严重危害人类生命健康。这些年来，该疾病发病率逐年上升，但治疗效果却不甚理想，其中一个关键原因是无法实现甲型流感病毒早期快速诊断以争取治疗时间，从而导致患者病情恶化甚至死亡。因此，能够在流感早期做出正确诊断显得尤为重要。
目前，国内外对于甲型流感病毒诊断有如下几种方法：
1.病毒分离培养
从呼吸道标本(咽拭子、鼻拭子、痰)中分离并培养流感病毒，准确率高、假阳性低。但这种检测方法需要专业设备，对操作人员要求高，检测时间长，不适合大量样本快速诊断。
2.病毒核酸检测
RT-PCR法检测甲型流感病毒核酸，该方法特异性和敏感性好，能快速区分病毒亚型，适合大量样本同时检测，但是设备昂贵，对操作人员要求高，检测时间较长，并且检测费用高。
3.免疫学诊断
通过免疫学方法，具体采用单克隆抗体识别检测呼吸道标本中的甲型流感病毒抗原，该方法特异性及灵敏度俱佳。若结合胶体金平台，一般能在10～15分钟内获得准确结果，适合大批量样本快速检测，无特殊设备及人员要求。
目前，免疫学方法检测甲型流感病毒由于操作简便、结果易于判定，已成为主流方向。该方法通常需要制备可识别不同亚型甲型流感病毒单克隆抗体，工作量极大，因此，相对保守的甲型流感病毒核蛋白成为单克隆抗体制备及识别靶标。但常规甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难、表达量极低，导致后续纯化工作难以开展，严重阻碍其单克隆抗体制备。另外，由于抗原表位氨基酸序列同源性缘故，使用流感病毒全长序列作为免疫原制备得到的单克隆抗体特异性差，与其它物种蛋白具有高度同源性，从而导致检测结果失真。
技术实现要素：
设计目的：解决免疫学方法检测甲型流感病毒的不足之处，通过设计、表达甲型流感病毒重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现甲型流感病毒特异性检测识别，既增强了检测灵敏度兼顾其广谱性，又不会导致检测结果失真。
设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以甲型流感病毒核蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原两个优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位是所有亚型的甲型流感病毒核蛋白共有表位并与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为增强免疫效果并缩短单克隆抗体制备时间，将所选择的两个优势抗原表位序列分别重复后通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接，形成甲型流感病毒重组蛋白氨基酸序列。(3)为提高甲型流感病毒重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将甲型流感病毒重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+),构建甲型流感病毒重组蛋白表达载体。(5)甲型流感病毒重组蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到甲型流感病毒重组蛋白表达菌株。(6)甲型流感病毒重组蛋白表达菌株大规模培养后，经超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化甲型流感病毒重组蛋白。(7)纯化的甲型流感病毒重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮亚克隆筛选最终得到分泌甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(8)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记胶体金颗粒。(9)正交实验筛选显示4C10单抗包被与3D7单抗标记配对为最佳检测甲型流感病毒组合。
设计方案1：一种甲型流感病毒重组蛋白，该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
设计方案2：一种甲型流感病毒重组蛋白，该重组蛋白质的氨基酸序列包含如序列表SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示氨基酸序列。
设计方案3：一种核苷酸序列，该核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示，可编码权利1-2所述的甲型流感病毒重组蛋白。
设计方案4：一种质粒载体，该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。
设计方案5：一种菌株，该菌株包含采用权利要求4所述的质粒载体。
本发明与背景技术相比，一是采用大肠杆菌偏爱密码子优化甲型流感病毒重组蛋白对应的核苷酸序列，从而大大提高了甲型流感病毒重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平；二是作为免疫原的甲型流感病毒重组蛋白仅含有甲型流感病毒特有的优势抗原表位，保证了最终得到的单克隆抗体仅特异性识别甲型流感病毒核蛋白，并筛选得到了最优单抗配对组合，提高了检测灵敏度；三是免疫原含有的优势抗原表位是不同亚型甲型流感病毒核蛋白的共有抗原表位，保证了检测广谱性，避免漏检。
具体实施方式
以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
实施例1：甲型流感病毒核蛋白优势抗原表位选择
以甲型流感病毒核蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位(SEQ ID No:2)和B优势抗原表位(SEQ ID No:3)。同时，序列比较结果显示所选择的A、B两个优势抗原表位序列具备广谱性，是所有甲型流感病毒核蛋白共有表位；并且A、B表位与其它蛋白序列无明显同源性，仅存在于甲型流感病毒核蛋白序列。
实施例2：甲型流感病毒核蛋白优势抗原表位的串联
为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的激活效果以缩短单克隆抗体制备时间，将甲型流感病毒核蛋白A、B两个优势抗原表位序列分别重复后再通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接,得到重组蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQ ID No:1所示。
实施例3：优化编码甲型流感病毒重组蛋白的核苷酸序列
在甲型流感病毒重组蛋白氨基酸序列不变的前提下,为了提高甲型流感病毒重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码甲型流感病毒重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No:4所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列后，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因连接于pMD20-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。
实施例4：构建甲型流感病毒重组蛋白表达载体
将含目的基因的pMD20-T载体和PET-28a(+)载体(德国Novagen公司)通过限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)分别于37℃双酶切12小时，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和PET-28a(+)载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均来自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和PET-28a(+)载体按一定的比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃恒温培养12小时之后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均来自于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
实施例5：构建甲型流感病毒重组蛋白表达菌株
将构建好的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃过夜培养。第二日，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4个小时后制备蛋白电泳样品。13.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明甲型流感病毒重组蛋白成功表达，得到甲型流感病毒重组蛋白表达菌株。
实施例6：纯化甲型流感病毒重组蛋白
接种甲型流感病毒重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，4度低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱,经洗涤、洗脱最终得到纯化甲型流感病毒重组蛋白。
实施例7：杂交瘤细胞株构建
取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射福氏完全佐剂乳化的100μg甲型流感病毒重组蛋白，共400ul/只。20天后进行第二次加强免疫，方法为取80ug甲型流感病毒重组蛋白用福氏不完全佐剂乳化，共400ul/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天以后，方法同第二次加强免疫相同。20天后，取120μg甲型流感病毒重组蛋白腹腔加强注射，于72小时后，眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1/5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2/0(小鼠骨髓瘤细胞)，混和离心后，加入聚乙二醇(Sigma公司)使二者融合。另外，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板(200μL/孔)，于37℃、5％二氧化碳培养箱培养。5天后，半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞的上清。具体方法如下：
甲型流感病毒重组蛋白经包被液稀释后(终浓度为1μg/mL)，以100μL/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司),4℃包被12小时后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；加入封闭液，200μL/孔，37℃封闭1小时，洗板机洗板1次；加待检细胞培养上清、阳性对照血清及阴性对照样本,100μL/孔，37℃孵育35min后，洗涤液洗涤3次；加HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤四次；每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μL/孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g,加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g,NaH2PO4.2H2O 0.39g,NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g,NaH2PO4.2H2O 0.39g,NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A:200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。
显色液B:柠檬酸2.1g,Na2HPO4.12H2O 71g,加双蒸水定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4,21.7mL浓H2SO4加双蒸水定容至1000mL。
对于检测阳性的杂交瘤细胞克隆，再使用有限稀释法进行亚克隆，挑选单个细胞培养并通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测。经过三次亚克隆，共筛选得到8株单克隆细胞株(1G6、2E8、2A6、3D7、4C10、6F5、7B2、7C6)。
实施例8：单克隆抗体制备及纯化
取6-8周龄的健康Balb/c雄鼠，腹腔注射液体石蜡，每只500μL，3天后腹腔注射单克隆细胞(约1.2×106个/只)，7-9天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水。用50ml平衡缓冲液PBS(pH＝7.4)平衡琼脂糖亲和介质Protein A层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)，至电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)显示吸光度调为0。腹水12000rpm离心5分钟，收集上清过0.45um滤器并上样后加PBS洗涤至吸光度为0，接着用0.1M甘氨酸(pH＝3.0)洗脱，收集流出液并加入500Mm Tris-HCl(pH＝8.5)缓冲液中和至pH＝7.0左右，得到的即为单克隆抗体。
实施例9：胶体金颗粒标记单抗
取10ml 0.01％胶体金溶液加入0.2mol/L碳酸钾溶液20uL，充分混匀后加入100ug抗体,室温反应2小时后添加10％牛血清白蛋白(BSA)1ml，封闭处理2小时后，离心(7500rpm/min、20分钟)，弃去上清后沉淀用1ml复溶液充分溶解，采用喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将复溶液按照10ul/cm均匀喷涂于玻璃纤维(宽度6mm)，再置于电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置30分钟。
以上述方法分别对1G6、2E8、2A6、3D7、4C10、6F5、7B2、7C6单抗进行胶体金标记。相关溶液配方如下:
0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。
1％氯金酸溶液：1gAuCL3.HCl.4H2O粉末加超纯水溶解并定容至100ml。
1％柠檬酸溶液：1g柠檬酸晶体加超纯水溶解并定容至100ml。
复溶液：Tris碱6.057g溶解于800ml双蒸水，用适量HCL调节pH至8.0，加双蒸水定容到1000ml。
实施例10：配对单抗筛选
甲型流感病毒单克隆抗体(1G6、2E8、2A6、3D7、4C10、6F5、7B2、7C6)分别经包被液稀释后(终浓度为1mg/ml)，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1ul/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius)，此为T线。通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将羊抗鼠溶液(终浓度为1mg/ml)按照1ul/cm均匀包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置30分钟。
按照常规工艺将样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、滤纸在PVC垫板上依次组装后切成宽4mm长条，装上试剂卡条壳并压紧。相关溶液配方如下：
包被液：Na2HPO4.7H2O 43.42g,NaH2PO4.H2O 5.244g,加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
甲型流感患者临床血清样本及正常人血清样本,100μL/孔上样，室温放置15min后，通过层析读数仪(上海捷浩科学仪器有限公司)分别读值并计算P/N值(阳性样本检测值与阴性样本检测值的比值)，详见表1。
表1配对单抗P/N值统计
通过上表可知，4C10单抗包被与3D7标记配对检测甲型流感为最佳组合。
SEQ ID NO1：甲型流感病毒重组蛋白氨基酸序列；
SEQ ID NO2：甲型流感病毒核蛋白A优势抗原表位氨基酸序列；
SEQ ID NO3：甲型流感病毒核蛋白B优势抗原表位氨基酸序列；
SEQ ID NO4：编码甲型流感病毒重组蛋白的核苷酸序列。
序列表
<110> 杭州贤至生物科技有限公司
<120> 一种甲型流感病毒重组蛋白及其单克隆抗体的制备
<160> 4
<210> 1
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含甲型流感病毒核蛋白优势抗原表位
<400> 1
Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly
5 10 15
Gly Gly Gly Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys
20 25 30
Lys Thr Gly Gly Gly Gly Trp Met Ala Cys His Ser Ala Ala Phe Glu Asp
35 40 45 50
Leu Arg Val Ser Ser Phe Gly Gly Gly Gly Trp Met Ala Cys His Ser Ala
55 60 65
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe
70 75
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Virus
<400> 2
Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr
5 10 15
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> Virus
<400> 3
Trp Met Ala Cys His Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe
5 10 15
<210> 4
<211>231
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据大肠杆菌的偏爱密码子设计
<400> 4
TATCTGGAAG AACATCCGAG CGCCGGCAAA GATCCGAAAA AAACCGGCGG 50
CGGCGGCAAA TATCTGGAAG AACATCCGAG CGCCGGCAAA GATCCGAAAA 100
AAACCGGCGG CGGCGGCTGG ATGGCCTGCC ATAGCGCCGC CTTTGAAGAT 150
CTGCGCGTGA GCAGCTTTGG CGGCGGCGGC TGGATGGCCT GCCATAGCGC 200
CGCCTTTGAA GATCTGCGCG TGAGCAGCTT T 231