抗蓝舌病病毒血清4型VP2蛋白的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及用途的制作方法

本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗BTV4VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体在制备诊断或预防BTV4感染检测中的应用，属于蓝舌病的防治领域。
背景技术：
：蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)引起的反当动物虫媒传染病。蓝舌病是一种急性非接触性传染病，其主要特征为以发热、白细胞减少、颊粘膜和胃肠道粘膜严重卡他性炎症。BTV能感染大多数家养的和野生的反当动物，因动物的易感性不同表现出不同的临床症状。BTV主要感染绵羊，牛等家养及野生反当类动物，反当动物感染BTV后的死亡率5％-30％不等，易感绵羊可高达80％。由于BT对世界经济的影响，世界动物卫生组织(OIE)将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为一类动物疫病。BT所造成的相关经济损失一方面通过直接降低动物的生产能力和增加动物的死亡率，更重要的是由于控制动物的流动、控制牛精液出口以及实施这些控制措施所需的费用而间接造成的动物贸易损失。蓝舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)蓝舌病病毒亚群(Bluetonguevirussubgroup)。BTV是双链RNA(dsRNA)病毒，其基因组由10个线性dsRNA片段组成，BTV总基因组约有19，200bp组成，共编码11种蛋白，包括7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4)。BTV的内层衣壳主要由VP3蛋白组成，由L3编码，围绕着三个次要蛋白VP1、VP4、VP6和10个基因组片段构成病毒的亚核心；VP7蛋白构成BTV的中间衣壳，由S7编码，该蛋白与亚核心组分以及病毒内部其他成分共同装配成病毒的核心；VP2和VP5蛋白组成病毒的外层衣壳，分别由L2和M5编码。而四种非结构蛋白主要出现在被感染的细胞中。BTV血清型众多，目前已发现24个血清型，而随着气候变化新的血清型不断出现。然而由于各个血清型之间交叉免疫保护性差，使得疫苗免疫错综复杂不能起到很好的保护作用，到目前为止尚未有有效的可用于防治蓝舌病的疫苗。早期准确诊断，早期预防，是防止本病爆发的最有效方法。所以，必须加强我国BT的相关工作的研究，做好必要的技术储备。技术实现要素：本发明目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒血清4型(Bluetonguevirus4，BTV4)VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本发明目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与BTV4-VP2蛋白发生特异性反应；本发明目的之三是提供上述单克隆抗体在制备已检测BTV4型中的用途。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：本发明以pET-28a为载体构建表达的VP2-4B蛋白作为免疫原免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合。此外，本发明还以pMAL-c5x为载体构建表达的VP2-4B蛋白作为包被抗原，经间接ELISA方法筛选得到一株稳定分泌抗BTV4-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株1B6，分类命名是杂交瘤细胞株1B6；保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号为：CCTCCNo.C2016107，保藏时间为2016年7月1日。本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，命名为BTV4-VP2-1B6，经鉴定该单克隆抗体BTV4-VP2-1B6为IgG1亚型，轻链为Kappa链。Westernblot检测结果表明BTV4-VP2-1B6可与BTV4-VP2蛋白发生特异性反应，而与SP2/0细胞不发生反应。进一步的，本发明还提出了所述杂交瘤细胞株以及由其分泌的单克隆康体在制备检测BTV4病毒试剂中的用途。综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对BTV4-VP2蛋白的单克隆抗体，本发明的单克隆抗体为建立BTV4型特异性免疫学检测方法研究奠定了基础。附图说明图1为pET-28a-4A、pET-28a-4B和pET-28a-4C的鉴定结果；1.Trans2KPlusⅡDNAMarker；2.pET-28a-4A质粒；3.pET-28a-4A经BamHⅠ单酶切；4.pET-28a-4A经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切；5.pET-28a-4B质粒；6.pET-28a-4B经BamHⅠ单酶切；7.pET-28a-4B经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切；8.pET-28a-4C质粒；9.pET-28a-4C经BamHⅠ单酶切；10.pET-28a-4C经BamHⅠ和XhoI双酶切；图2为pMAL-c5x-4A、pMAL-c5x-4B和pMAL-c5x-4C的鉴定结果；1.Trans2KPlusⅡDNAMarker；2.pMAL-c5x-4A质粒；3.pMAL-c5x-4A经SalⅠ单酶切；4.pMAL-c5x-4A经SalⅠ和NotⅠ双酶切；5.pMAL-c5x-4B质粒；6.pMAL-c5x-4B经SalⅠ单酶切；7.pMAL-c5x-4B经SalⅠ和EcoRⅠ双酶切；8.pMAL-c5x-4C质粒；9.pMAL-c5x-4C经SalⅠ单酶切；10.pMAL-c5x-4C经SalⅠ和EcoRⅠ双酶切；图3为重组His-4B蛋白的SDS-PAGE分析结果；1.pET-28a-4B/BL21诱导前；2.pET-28a-4B/BL21诱导后；3.蛋白质分子量标准；图4为重组MBP-4B蛋白的SDS-PAGE分析结果；1.蛋白质分子量标准；2.pMAL-c5x-4B/BL21诱导前；3.pMAL-c5x-4B/BL21诱导后；图5为His-4B纯化蛋白与His标签单抗的Westernblot分析结果；1.His-4B纯化蛋白；2蛋白质分子量标准；图6为本发明的单克隆抗体1B6与BTV4-VP2-A、BTV4-VP2-B以及BTV4-VP2-C的Westernblot分析结果。1.BTV4-VP2-A；2.BTV4-VP2-B；3：BTV4-VP2-C；4.蛋白质分子量标准。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明实施例中涉及的主要实验材料和来源：1、主要试剂和药品各种限制性内切酶、T4连接酶、反转录酶、Taq酶、DNAmarker均为宝生物工程(大连)有限公司产品；质粒小量抽提试剂盒购AXYGE公司；胶回收小量试剂盒购自中科瑞泰有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；邻苯二胺(OPD)购自SIGMA公司；胎牛血清均购自GIBCO公司；特级胎牛血清购自天津灏阳公司；1640基础培养基、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶、PEG3350、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、HAT(50×)培养基、HT(l00×)培养基、二氨基联苯胺(DAB)、邻苯二胺(OPD)、抗体亚类鉴定试剂盒购自SIGMA公司。2、实验动物4-6周龄BALB/C小鼠由辽宁长生生物技术有限公司提供。实施例14BTV-VP2-A、4BTV-VP2-B以及4BTV-VP2-C蛋白的原核表达及纯化1、引物设计根据Genbank中已登录的4型BTV的L2基因序列(登录号为132566356)。利用蛋白分析软件等对L2基因进行分析及预测，将4型的L2基因分为A、B、C3个节段：4A：1-1203bp；4B：976-1980bp；4C：1861-2871bp；设计PCR扩增引物，4A(P3-P6)、4B(P7-P10)、4C(P11-P14)的PCR扩增引物序列如下表1、表2所示，表1为针对pET-28a-c(+)载体的引物序列，表2为针对pMAL-c5x载体的引物序列：表1针对pET-28a-c(+)载体的引物序列表2针对pMAL-c5x载体的引物序列2、基因扩增以合成的BTV4L2基因为模板，利用特异性上、下游引物对P7-P8对4B节段进行PCR扩增。反应体系如下：混匀后PCR仪进行扩增，扩增条件为：预变性94℃5min后进入循环，循环参数为94℃1min，53℃40s，72℃1min，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。将获得的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。其他节段均按照上述体系及PCR扩增条件进行扩增，分别扩增的到用于pET-28a-c(+)载体以及pMAL-c5x载体构建的4A、4B、4C3个节段。3、4BTV-VP2蛋白原核表达重组载体的构建将PCR产物与l0×LoadingBuffer混匀，经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯照射下切取含有目的片段的凝胶，将其置于已称重的EP管中，计算出凝胶的重量，按照小量DNA胶回收试剂盒方法操作：每l00mg核酸胶中加入300μLBufferS1，置于56℃水浴锅中溶解，过程中每隔2-3min震荡颠倒混匀一次，当其完全融化时，按照150μL异丙醇/l00mg凝胶体积加入异丙醇并混匀，将所得液体加入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去滤液。加入700μL漂洗液于吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去滤液。再加入600μL漂洗液重复洗涤一次，12000rpm离心1min弃去滤液。重复上述规程，空离心2min。在吸附膜中央加入40μL预热的去离子水，静止吸附2min，12000rpm离心2min，收集洗脱液于新的离心管中。将纯化后的PCR产物与pMD18-Tsimple载体连接，并将其转入TG1中。将纯化后的目的基因4A、4B、4C分别与载体pET-28a-c(+)、pMAL-c5x进行连接。连接反应总体系为10μL：SolutionⅠ5μL，pMD18-Tsimple载体0.3μL，纯化回收的PCR产物4.7μL。混匀后放入连接仪中，16℃连接4h。4、转化与挑菌将连接后产物转化到大肠杆菌感受态细胞TG1中：从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上融化3min，将连接后产物10μL加入到TG1100μL中，混匀，冰上静置20min。42℃热击100s，冰浴5min。向其中加入LB液体恢复培养基700μL，37℃摇床振荡培养40min。取出200μL培养后菌液均匀涂布于含有Amp+的LB平板上，待菌液全部被培养基吸收后放入37℃培养箱内，倒置培养12h。5、重组表达质粒的酶切鉴定与测序用质粒小提试剂盒提取重组质粒。取1mL培养后的菌液于EP管中，12000rpm离心1min，将上清弃去，加入250μLBufferP1并充分震荡混匀使菌体沉淀悬浮充分；再加入250μLBufferP2，温和的上下颠倒混匀6-8次；加入350μLBufferP3，温和的上下颠倒混匀5-6次，12000rpm离心10min；将所得上清液加入到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去滤液。加入700μL漂洗液于吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去滤液。再加入500μL漂洗液重复洗涤一次，12000rpm离心1min，弃去滤液，空离心2min。将吸附柱放入一个新的EP管中，在吸附膜中央加入60μL预热的去离子水，静止吸附2min，12000rpm离心1min，收集质粒DNA洗脱液于新的离心管中。提取的质粒进行单双酶切鉴定，37℃水浴作用30min。单双酶切后产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1及图2所示。将酶切鉴定正确的阳性克隆质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，比对目的基因序列完全正确。将构建得到的重组表达质粒分别命名为pET-28a(+)-VP2-4A、pET-28a(+)-VP2-4B、pET-28a(+)-VP2-4C、pMAL-c5x-VP2-4A、pMAL-c5x-VP2-4B以及pMAL-c5x-VP2-4C。6、BTV4-VP2基因的原核表达与纯化按照4所述转化方法将阳性重组质粒pET-28a(+)-VP2-4A、pET-28a(+)-VP2-4B、pET-28a(+)-VP2-4C、pMAL-c5x-VP2-4A、pMAL-c5x-VP2-4B以及pMAL-c5x-VP2-4C分别转化到原核表达用BL21感受态细胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨节青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取LB平板培养基上的白色孤立菌落，接种于5mL含有氨节青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养过夜。表达诱导具体操作如下：取1mL重组菌菌液加入到100mL的LB培养基中37℃震荡培养至OD600nm约为0.5-1时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导4-5h。将表达产物进行SDS-PAGE电泳，通过切胶方法进行纯化。表达载体pET-28a与目的基因4B构建的重组菌经SDS-PAGE鉴定，诱导后的重组菌分别在46kD处出现特异性条带，与预期大小相符，且其表达形式为包涵体表达，结果如图3所示，His-4B纯化蛋白与His标签单抗的Westernblot分析结果如图5所示；表达载体pMAL-c5x与目的基因4B构建的重组菌经SDS-PAGE鉴定，诱导后的重组菌分别在80kD处出现特异性条带，与预期大小相符，且主要为可溶性表达，结果如图4所示。重组菌pMAL-c5x-VP2-4B/BL21大量诱导后，利用GST标签蛋白的亲和层析柱进行纯化。纯化后的蛋白使用微量分光光度计测定蛋白浓度，分装后-80℃低温冻存。将重组菌pET-28a(+)-VP2-4B/BL21进行大量诱导，提取包涵体。通过切胶、电洗脱的方式对蛋白进行纯化。纯化后的蛋白，用微量分光光度计检测蛋白的浓度，分装后与-80℃低温冻存。VP2-4A以及VP2-4C蛋白按照与VP2-4B蛋白相同的处理方法进行鉴定和纯化。实施例2单克隆抗体的制备1、小鼠免疫小鼠免疫以切胶纯化的pET-28a(+)-VP2-4B/BL21原核表达的重组BTV4-VP2-4B蛋白免疫4只4-6周龄雌性BALB/C小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔两周，免疫剂量为50μg/只，第一次用等量弗氏完全佐剂与蛋白乳化，第二次、第三次取等量弗氏不完全佐剂进行乳化，免疫途径为腹腔免疫。融合前加强免疫。2、细胞融合融合前1天准备饲养层细胞，按照常规方法取BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。眼球采血，分离血清保存，处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞8：1的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。3、阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆利用纯化后的pMAL-c5x-VP2-4B/BL21原核表达的带有MBP标签的BTV4-VP2-4B蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，至少亚克隆3次，将亚克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗BTV4-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其分泌的单克隆抗体命名为杂交瘤细胞株1B6，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号为：CCTCCNo.C2016107。实施例3单克隆抗体的鉴定1、单克隆抗体的亚类鉴定经抗体亚类鉴定试剂盒鉴定，抗BTV4VP2蛋白的单克隆抗体中，1B6的亚类为IgG1。2、Westernblot试验通过Westernblot试验对单克隆抗体的反应特异性进行鉴定。将pMAL-c5x-VP2-4B/BL21表达的重组4VP2-B蛋白转印至NC膜上，以阳性杂交瘤细胞株1B6培养上清液作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，ECL显色。试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体1B6能够与BTV4-VP2-B蛋白发生特异性反应，而与BTV4-VP2-A、BTV4-VP2-C不发生反应(如图6)。3、夹心ELISA法检测单克隆抗体1B6与BTV病毒的反应兔抗BTV血清包被的ELISA板，每孔100μL，37℃孵育2h。PBST洗三次，每次5min。每孔中加50μLBTV-4型病毒，37℃1h。洗板3次。1：5稀释1B6上清，每孔50μL。37℃1h；洗板3次。1：8000稀释羊抗鼠二抗(HRP)，每孔50μL。37℃1小时；洗板3次。TMB显色15分钟，加终止液，读值，结果如表3所示。表3夹心ELISA法检测单克隆抗体1B6与BTV病毒的反应1(BTV-4型病毒)2(BTV-8型病毒)1B60.59120.2564阳性对照1.71631.6333阴性对照0.12940.179试验结果证实，与BTV-4型病毒有一定的反应，并与BTV-8型病毒不发生反应。当前第1页1 2 3