抗PD‑L2蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗pd-l2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pd-l2单克隆抗体和应用。

背景技术：

程序性细胞死亡因子1配体2(processeddeath-1ligand2，pd-l2)又称为b7-dc，是由pdcd1lg2基因编码的一个含274个氨基酸残基组成的i型跨膜糖蛋白，包括胞外区、疏水跨膜区和尾部胞浆区，其与pd-l1的氨基酸同源性可达40％，但两者也具有一定的差异。pd-l2蛋白的体内组织分布具有局限性，只在巨噬细胞、树突状细胞和一些b细胞亚类的膜表面表达，但近年来有研究表明，在特定微环境刺激下，pd-l2在其他多种免疫细胞和非免疫细胞中均可被诱导表达，如肺癌、乳腺癌、胸腺瘤等肿瘤细胞中高表达。

pd-l2在免疫调节中扮演着更关键的角色。肿瘤细胞表达的pd-l2与表达在活化t细胞上的负性共刺激分子pd-1结合，可抑制t细胞增殖，并促进活化t细胞的凋亡。近年来，大量的研究表明pd-l2可以作为一种重要的分子标志物在各种肿瘤中的靶向治疗和预后诊断中发挥着重要的作用。

目前临床上通常用免疫组织化学(immunohistochemistry,ihc)实验检测肿瘤组织内肿瘤细胞中pd-l2的表达状况，其实验方法的核心为特异性结合pd-l2的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对pd-l2蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗pd-l2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pd-l2单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与pd-l2蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

抗pd-l2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为cgmccno：13285。

本发明所述抗pd-l2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：

(1)单克隆抗体的筛选与制备：通过购买origene公司pd-l2重组蛋白(货号tp324141)作为免疫原，免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗pd-l2特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得pd-l2单克隆抗体。通过免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗pd-l2单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为umab223，亚型鉴定为igg1，并于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno：13285。

同时，本发明还提供一种抗pd-l2蛋白单克隆抗体，由保藏编号为cgmccno：13285的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗pd-l2蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得pd-l2单克隆抗体。

本发明所述保藏编号为cgmccno：13285的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的抗pd-l2蛋白单克隆抗体为igg1型，效价较高。所述单克隆抗体的免疫组化检测结果显示，其能够特异性识别肺癌组织、胸腺瘤组织和前列腺增生组织中的pd-l2蛋白。

同时，采用origene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明，本发明所述单克隆抗体能特异性识别pd-l2蛋白，而与近10000种其他蛋白无交叉反应。

因此，本发明还提供了保藏编号为cgmccno：13285的杂交瘤细胞在制备抗pd-l2蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗pd-l2蛋白单克隆抗体在制备检测pd-l2蛋白的免疫检测产品中的应用。

作为优选，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。

本发明还提供一种免疫组化检测的试剂盒，包括保藏编号为cgmccno：13285的杂交瘤细胞分泌产生的抗pd-l2蛋白单克隆抗体。所述免疫检测试剂盒可检测肿瘤组织及其微环境中pd-l2的表达状况。

此外，本发明还提供保藏编号为cgmccno：13285的杂交瘤细胞分泌产生的抗pd-l2蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤组织及其微环境中淋巴细胞的试剂盒中的应用。

作为优选，所述肿瘤包括肺癌和胸腺瘤。

本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗pd-l2蛋白单克隆抗体，且与pd-l2蛋白特异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了pd-l2蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织及其微环境中pd-l2的检测。

生物保藏信息说明

用于保藏的杂交瘤细胞株umab223的分类命名为：鼠抗人程序死亡因子1配体2(pd-l2)单克隆杂交瘤细胞株；

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：cgmcc；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年11月22日；

保藏编号：cgmccno.13285。

附图说明

图1所示为实施例1中所购买的pd-l2蛋白sds-page结果图；

图2所示实施例2肺癌组织免疫组化检测结果图(一抗为umab223分泌产生的pd-l2单抗，1:500)；

图3所示实施例2胸腺瘤组织免疫组化检测结果图(一抗为umab223分泌产生的pd-l2单抗，1:500)；

图4所示实施例2前列腺增生组织免疫组化检测结果图(一抗为umab223分泌产生的pd-l2单抗，1:500)；

图5所示实施例3过表达pd-l2质粒的293t活细胞的流式细胞术检测结果图(一抗为umab223分泌产生的pd-l2单抗，1:50)；

图6所示实施例4origene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为umab223分泌产生的pd-l2单抗,1:100；二抗为alexa647-标记的驴抗鼠igg，1:500)。

具体实施方式：

本发明公开了抗pd-l2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pd-l2单克隆抗体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面就本发明提供的抗pd-l2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pd-l2单克隆抗体和应用做进一步说明。

实施例1:抗pd-l2单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备筛选

购买于origene公司的全长pd-l2重组蛋白(货号tp324141，以下简称为pd-l2抗原，如图1所示)用于对b6/c57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的pd-l2抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，mc定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用纯化的pd-l2重组蛋白进行elisa测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定elisa值，挑取od280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为umab223。

4、细胞上清单抗的制备与纯化：将细胞株umab223用含15％血清的dmem培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×10⁷个时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2l转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×10⁵个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×10⁶个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株umab223产生的单抗亚型为igg1，采用proteing进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100ul/管，浓度为1mg/ml)、保存在4-8℃。

实施例2：umab223分泌产生的单克隆抗体为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、分别取肺癌、胸腺瘤和前列腺增生组织块进行石蜡包埋，使用sakura组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(1mmedta,ph8的10mmtris-hcl缓冲液)高压锅高压热修复2.5min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(pbs+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入pd-l2单抗(umab223分泌产生)，稀释比：1:50，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。pbst(0.02％tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加聚合物hrp染色试剂盒中试剂pv8000(中杉金桥，货号pv-8000)，37℃孵育15分钟。使用pbs洗涤3次，每次5min。

8、应用dab溶液(中杉金桥，货号zli-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图2、图3和图4。

(2)、实验结果：

由图2结果可见，pd-l2蛋白在肺癌组织的肿瘤细胞呈特异性细胞膜和细胞质表达，如图箭头所示肿瘤细胞。

由图3结果可见，pd-l2蛋白在胸腺瘤组织中的肿瘤细胞上呈特异性细胞膜和细胞质表达，如图箭头所示肿瘤细胞。

由图4结果可见，pd-l2蛋白在前列腺增生组织腺上皮细胞呈特异性细胞膜表达，如图箭头所示腺上皮细胞。

结果表明本发明umab223产生的单克隆抗体能够特异性识别肺癌、胸腺瘤组织和前列腺增生组织中的pd-l2蛋白。

实施例3：umab223分泌产生的单克隆抗体的流式细胞术检测

(1)、实验方法：

1、准备细胞：准备人hek293细胞系(购买自atcc)培养于含5％co2的37℃细胞培养箱中。

2、转染细胞：将购自origene的pd-l2真核表达质粒rc224141(货号rc224141)转染293t细胞后，培养于含5％co2的37℃细胞培养箱中。

3、收获细胞：细胞消化后水平离心机800-1000rpm/5min离心,pbs洗细胞2次，800rpm离心；活细胞沉淀用pbs定容到400ul-ep管，制备细胞悬液。

4、孵育抗体：将pd-l2鼠单抗umab223(工作浓度为10ug/ml)以及阴性对照抗体分别上述两种细胞悬液于冰浴中共孵育1小时。

5、孵育二抗：将上述的细胞-抗体混合液用pbs洗涤3次，800rpm/5min；然后加入驴抗鼠alexa488标记二抗(jackson,catlogno.715-545-151)200ul/孔，冰浴1小时。

6、洗涤后流式细胞仪分析：用pbs洗涤3次，800rpm/5min,之后加含pi(1000x)的缓冲液250ul/孔混悬，将细胞悬液经过流式细胞仪分析。

7、根据阴性，阳性，空白对照来进行结果分析和判定，见图5。

(2)、实验结果：

由图5结果可见，pd-l2鼠单抗umab223能通过流式细胞术检测过表达pd-l2的293t活细胞表面的pd-l2蛋白(红色线)，图中蓝色线代表阴性对照抗体信号。

实施例4：umab223分泌产生的单克隆抗体的特异性蛋白芯片检测

origene高密度蛋白芯片上包含10000个hek293t细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用origene蛋白(origenecatpa100001)芯片进行umab223分泌产生的单克隆抗体鉴定实验的方法：

1、将一张蛋白芯片放在50ml离心管中，使用40ml去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mlpbst平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50ml离心管中加入40ml5％脱脂牛奶(用pbst进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗umab223，稀释比列为1：100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μl一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片nc膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片nc膜，直至整张nc膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50ml离心管中，使用pbst漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mlpbst(0.1％tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗alexa647-标记的驴抗鼠igg，稀释比例为1：500。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用pbst洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据bsa-cy3以及bsa-cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液id，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，ncbi录入号(accessionnumber)，蛋白id，蛋白大小等信息。结果见图6。

图6结果显示，umab223能与蛋白芯片上的pd-l2蛋白点特异性结合，而在蛋白芯片上的其他所有蛋白与umab223分泌产生的单克隆抗体无结合信号，表明本发明所述单抗与其他近10000种蛋白无交叉反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。