一种高效促使脂肪干细胞增殖的方法及其试剂盒与流程

本发明涉及一种高效促使脂肪干细胞增殖的方法以及通过所述方法获得的高效促使脂肪干细胞增殖的试剂盒。特别地，本发明涉及采用明胶包被的细胞培养板或培养皿和明胶包被的细胞培养瓶，在重组人表皮生长因子、重组人血小板衍生生长因子、重组人碱性成纤维生长因子、胰岛素、转铁蛋白和胎牛血清等联合培养下，从脂肪中高效促使脂肪干细胞增殖生长。本发明获得的脂肪干细胞可用于医学美容，包括皮肤除皱、祛斑和丰胸等领域。

背景技术：

由于生物技术的快速发展，医学美容和化妆品均应用到生物技术进行开发产品，特别是近年来，将细胞技术应用美容行业中，并成为大家所逐渐认可的领域。如从皮肤中培养的成纤维细胞和脂肪中获取的脂肪干细胞等，都已经在医学美容上进行临床研究和应用，对皮肤皱纹、斑痕和丰胸等直接注射，使得这些细胞能在皮肤中分化生长，对皮肤起着填充和修复功能。脂肪干细胞是目前研究热点的一种成体干细胞，该细胞增殖能力比较好，体外培养能保持稳定的生长增殖活性，且具有多项分化潜能，也已被应用到美容治疗中。但通常脂肪干细胞在体外培养增殖时，生长速度慢，达到10⁸以上细胞数需要20天以上的时间，且还不能满足多次美容所需。很多美容者第二次美容可能需要进行再次抽脂，但这种痛楚非常痛苦，一般人难以接受。即便使用了局部麻醉，但是过后疼痛还是难以忍受。

综上所述，目前常用的脂肪干细胞培养方法获得脂肪干细胞数有限，脂肪干细胞增殖生长缓慢，经过传代培养3代需要30天以上，得到的脂肪干细胞数量低于10⁸。而且脂肪干细胞传代扩增不能超过5代，否则脂肪干细胞易出现分化和凋亡，细胞增殖和修复的功能明显也下降，具有干细胞特征的细胞显著减少，不能保证美容后脂肪干细胞的活性。本发明采用明胶包被的细胞培养板或培养皿和明胶包被的细胞培养瓶，在重组人表皮生长因子、重组人血小板衍生生长因子、重组人碱性成纤维生长因子、胰岛素、转铁蛋白和胎牛血清等联合培养下，促使脂肪干细胞高效增殖，可以获得大量的脂肪干细胞，满足美容者多次多疗程的进行美容，将对皮肤产生最佳的除皱、祛斑和丰胸等美容作用。

技术实现要素：

为了高效促使脂肪干细胞增殖，获得大量高活性的脂肪干细胞将有助于提高医学美容的效果。本发明根据脂肪干细胞机体内存活和生长条件，明胶包的细胞培养板或培养皿和明胶包被的细胞培养瓶，在重组人表皮生长因子、重组人血小板衍生生长因子、重组人碱性成纤维生长因子、胰岛素、转铁蛋白和胎牛血清等联合培养下，促使脂肪干细胞高效增殖，可以获得大量的活性脂肪干细胞。这样一来，制备的脂肪干细胞可以多次多疗程进行医学美容，减少因而脂肪干细胞不足需要的再次抽脂，以及减少再次抽脂带来的痛楚。

明胶具有维持经胰蛋白酶消化的人干细胞的未分化状态。生长在明胶上的干细胞表达多能性标志物，多向分化形成能力同时维持正常核型。前期研究中我们发现对在明胶上培养了10代的人脂肪干细胞进行检测，结果显示这些细胞仍然表达高水平的cd90、cd73和cd105。同时，与基质胶上和正常培养瓶中生长的人脂肪干细胞相比，明胶上生长的人脂肪干细胞能够形成相似大小和数量的碱性磷酸酶阳性集落，因而具有良好的干细胞特性。

重组人表皮生长因子、重组人血小板衍生生长因子、重组人碱性成纤维生长因子、胰岛素和转铁蛋白等细胞因子对脂肪干细胞的增殖、迁移、聚集和分化等方面都有促进作用。我们在流式仪检测的结果中发现这些细胞因子可以具有协同地促进脂肪干细胞由静止态进入增殖态的作用，同时保持脂肪干细胞处于未分化状态，具有多向分化能力和自我更新的干细胞特征。

脂肪干细胞具有多种生物学功能，可分化为多种细胞，如成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、成纤维细胞和表皮细胞等，因而在皮肤中脂肪干细胞可以修复坏死的成纤维细胞和表皮细胞，参与皮肤的新陈代谢；同时可分泌多种细胞因子，如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)、碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)、表皮生长因子(epithelialgrowthfactor，egf)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfacror，hgf)、类胰岛素生长因子(insulin-likegrowthfactors，igf-1)和血小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor，pdgf)和神经生长因子(nervegrowthfactor，ngf)等，能促使成纤维细胞和表皮细胞活化和扩增，产生胶原蛋白、透明质酸和弹性蛋白等，参与皮肤皱纹、瘢痕、疤痕和斑痕等的修复、再生、填充、祛斑与抗氧化等的作用，以及胸部达到丰胸的效果。

本发明提供了一种高效促使脂肪干细胞增殖的方法以及通过所述方法获得的高效促使脂肪干细胞增殖的试剂盒。特别地，本发明涉及采用明胶包被板和细胞培养瓶，在重组人表皮生长因子、重组人血小板衍生生长因子、重组人碱性成纤维生长因子、胰岛素、转铁蛋白和胎牛血清等联合培养下，从脂肪中高效促使脂肪干细胞增殖生长。

本发明制备的脂肪干细胞可从美容者大腿或腹部抽脂获得的自体脂肪，洗涤消化后得到有核细胞，经体外原代培养和传代培养后获得大量脂肪干细胞，可放置在4℃保存运输，也可用40％脂肪干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，保存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。

本发明所述的明胶包被的细胞培养板、培养皿或细胞培养瓶，为使用1-20％(质量体积比)明胶在4℃冰箱过夜或37℃孵育1小时后4℃冰箱过夜，在细胞培养容器中进行包被。包被后吸除明胶液，在生物安全柜或超净台中通风干燥，干燥后保存在4℃冰箱备用。

本发明从50ml脂肪中在15天内可培养获取10⁹以上的脂肪干细胞。本发明制备得到的脂肪干细胞经流式细胞仪检测，高表达cd90+为≥90％、cd73+为≥90％和cd105+为≥90％，低表达cd34+为≤5％、hla-dr+为≤5％和cd14+为≤5％；；更优选，自体脂肪干细胞高表达cd90+为99.08％、cd105+为99.12％和cd73+为99.39％，低表达cd34+为0.12％、hla-dr+为0.51％和cd14+为0.24％。

本发明制备的脂肪干细胞高表达细胞因子，即脂肪干细胞培养上清中分泌的vegf大于500pg/ml、bfgf大于500pg/ml、egf大于1500pg/ml、igf-1大于10ng/ml和pdgf大于1000pg/ml。

本发明还提供了一种高效促使脂肪干细胞增殖的试剂盒，其特征在于，其由如下成分组成：

1)1000ml细胞培养基；

2)1块明胶包被的细胞培养板或培养皿；

3)8个明胶包被的细胞培养瓶；

4)5-50ng/ml重组人表皮生长因子；

5)5-50ng/ml重组人血小板衍生生长因子；

6)5-50ng/m重组人碱性成纤维生长因子；

7)10-100ng/ml胰岛素；

8)10-100ng/ml转铁蛋白；

9)2-10％胎牛血清；

10)100ml胰酶；

11)使用说明书；

该试剂盒产品的培养基、明胶包被的细胞培养板或培养皿和明胶包被的细胞培养瓶保存在4℃条件下，保质期为1年；细胞因子、胎牛血清和胰酶均保存在-80℃条件下，保质期为1年。

优选地添加了全部的细胞因子，即5-50ng/ml重组人表皮生长因子、5-50ng/ml重组人血小板衍生生长因子、5-50ng/m重组人碱性成纤维生长因子、10-100ng/ml胰岛素、10-100ng/ml转铁蛋白和2-10％胎牛血清。

通过本发明的方法，培养得到的脂肪干细胞可以制备成制剂，用于皮肤皱纹、瘢痕、疤痕以及胸部进行注射美容，对皮肤皱纹、瘢痕、疤痕和斑痕等产生修复、再生、填充、祛斑与抗氧化等的作用，以及胸部达到丰胸的效果。

附图说明

图1表示由实施例1所制备的人脂肪干细胞增殖活性分析。

图2表示由实施例1所制备的脂肪干细胞表型检测的细胞流式图。

图3表示由实施例1所制备的脂肪干细胞培养上清细胞因子分泌水平图。

具体实施方式

本发明提供了一种高效促使脂肪干细胞增殖的方法以及通过所述方法获得的高效促使脂肪干细胞增殖的试剂盒。特别地，本发明涉及采用明胶包被的细胞培养板或培养皿和明胶包被的细胞培养瓶，在重组人表皮生长因子、重组人血小板衍生生长因子、重组人碱性成纤维生长因子、胰岛素、转铁蛋白和胎牛血清等联合培养下，从脂肪中高效促使脂肪干细胞增殖生长，从而制备成自体的脂肪干细胞制剂。

所述脂肪干细胞从大腿或腹部抽脂获得脂肪组织体外纯化培养得到。具体实施步骤如下：由腹部或大腿上抽脂获得脂肪组织50ml，用生理盐水反复冲洗5次，尽量吸除脂肪中油及血细胞；

使用1∶1的0.25％(质量体积比)胰酶和0.1％(质量体积比)i型胶原酶20-50ml，在37℃培养箱中消化60分钟，每隔15分钟用漩涡振荡仪振荡2分钟；消化后1500rpm离心10分钟，吸弃上层油脂后加入生理盐水重悬，用100μm细胞筛过滤；细胞悬液1000rpm离心10分钟，细胞沉淀用生理盐水重悬洗涤2次后加入细胞培养液(含5-50ng/ml重组人表皮生长因子、5-50ng/ml重组人血小板衍生生长因子、5-50ng/m重组人碱性成纤维生长因子、10-100ng/ml胰岛素、10-100ng/ml转铁蛋白和2-10％胎牛血清)重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×10⁶细胞/ml加入到明胶包被的细胞培养板或培养皿中培养，于37℃，5％co2培养箱中培养24-72小时；

培养24-72小时后用5ml移液管吸弃培养液，加入细胞培养液(含5-50ng/ml重组人表皮生长因子、5-50ng/ml重组人血小板衍生生长因子、5-50ng/ml重组人碱性成纤维生长因子、10-100ng/ml胰岛素、10-100ng/ml转铁蛋白和2-10％胎牛血清)进行换液，细胞培养板或培养皿继续放置37℃，5％co2培养箱中继续培养；

当脂肪干细胞生长融合达到80％以上时进行消化扩瓶，将培养液吸除，取1×pbs(ph值为7.4)洗涤一次后加入0.5ml0.25％胰酶到培养瓶中，消化2-3分钟后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入生理盐水，用5ml移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用生理盐水洗涤一次，加入到同一个15ml离心管中，1000转每分钟离心10分钟收集脂肪干细胞；离心后用1ml新鲜培养液重悬，计数，用5ml移液管加入10ml新鲜的细胞培养液(含5-50ng/ml重组人表皮生长因子、5-50ng/ml重组人血小板衍生生长因子、5-50ng/m重组人碱性成纤维生长因子、10-100ng/ml胰岛素、10-100ng/ml转铁蛋白和2-10％胎牛血清)，加入到1瓶胶原包被的培养瓶中继续在37℃，5％co2培养箱中培养，每隔2天换一次新鲜培养液；待脂肪干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集脂肪干细胞，连续传代3代培养，获得10⁹以上的脂肪干细胞，用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得大量脂肪干细胞，放置4℃条件下保存备用。

本发明所述的明胶包被的细胞培养板、培养皿或细胞培养瓶，为使用1-20％(质量体积比)明胶在4℃冰箱过夜或37℃孵育1小时后4℃冰箱过夜，在细胞培养容器中进行包被。包被后吸除明胶液，在生物安全柜或超净台中通风干燥，干燥后保存在4℃冰箱备用。

培养板、培养皿和培养瓶为商业上可购买到的，培养板可为24孔板、12孔板和6孔板；培养皿可为35mm、60mm和90mm的培养皿；培养瓶可为25cm²、75cm²、175cm²和225cm²的培养瓶；更优选地为培养板可为6孔板；培养皿可为60mm的培养皿；培养瓶可为175cm²的培养瓶；

本发明所述的细胞培养液为商业上可购买到的，包括dmem高糖培养基、α-mem培养、egm-2培养基和dmem/f12(1∶1)培养基等，更优选地使用α-mem培养和egm-2培养基。

取苔盼兰染色计数后的3×10⁶脂肪干细胞，分三组，第一组分别添加到有20μlfitc标记鼠抗人cd90单抗、20μlpe标记鼠抗人cd105单抗和20μlpercp标记鼠抗人cd34单抗；第二组分别添加到有20μlfitc标记鼠抗人cd73单抗、20μlpe标记鼠抗人hla-dr单抗和20μlpercp标记鼠抗人cd14单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μlfitc标记鼠igg1、20μlpe标记鼠igg1和20μlpercp标记鼠igg1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1ml的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5ml的1×pbs重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用fc500流式细胞仪检测；脂肪干细胞高表达cd90+为≥90％、cd105+为≥90％和cd73+为≥90％，低表达cd34+为≤5％、hla-dr+为≤5％和cd14+为≤5％。

制备得到的脂肪干细胞可在40％脂肪干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。脂肪干细胞复苏后，仍高表达cd90、cd73和cd105，低表达cd34、hla-dr和cd14，具有脂肪干细胞表型特征。

本发明制备的脂肪干细胞高表达细胞因子，脂肪干细胞培养上清通过酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)检测分泌细胞因子浓度，vegf大于500pg/ml、bfgf大于500pg/ml、egf大于1500pg/ml、igf-1大于10ng/ml和pdgf大于1000pg/ml。

本发明还提供了一种高效促使脂肪干细胞增殖的试剂盒，其特征在于，其由如下成分组成：

1)1000ml细胞培养基；

2)1块明胶包被的细胞培养板或培养皿；

3)8个明胶包被的细胞培养瓶；

4)5-50ng/ml重组人表皮生长因子；

5)5-50ng/ml重组人血小板衍生生长因子；

6)5-50ng/m重组人碱性成纤维生长因子；

7)10-100ng/ml胰岛素；

8)10-100ng/ml转铁蛋白；

9)2-10％胎牛血清；

10)100ml胰酶；

11)使用说明书；

该试剂盒产品的培养基、明胶包被的细胞培养板或培养皿和明胶包被的细胞培养瓶保存在4℃条件下，保质期为1年；细胞因子、胎牛血清和胰酶均保存在-80℃条件下，保质期为1年。

优选地添加了全部的细胞因子，即5-50ng/ml重组人表皮生长因子、5-50ng/ml重组人血小板衍生生长因子、5-50ng/m重组人碱性成纤维生长因子、10-100ng/ml胰岛素、10-100ng/ml转铁蛋白和2-10％胎牛血清。

本发明提供了脂肪干细胞可以制备成制剂，用于皮肤皱纹、瘢痕、疤痕以及胸部进行注射美容，根据皱纹深浅和瘢痕与疤痕大小，注射的脂肪干细胞数有所不同，全脸使用的脂肪干细胞数一般为5-50×10⁶，1疗程为4次，间隔1周，可达到更佳的美容效果。根据胸部大小，注射的脂肪干细胞数也有所不同胸部，丰胸使用的脂肪干细胞数一般为每个乳房100×10⁶以上，1疗程为2次，间隔2周，可达到更好的丰胸效果。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1人脂肪干细胞的制备

美容志愿者从腹部或大腿上抽脂获得脂肪组织50ml(与其签署知情同意书)，用50ml生理盐水反复冲洗5次，尽量吸除脂肪中油及血细胞。使用1∶1的0.25％(质量体积比)胰酶(北京索莱宝公司)和0.1％(质量体积比)i型胶原酶(美国sigma公司)50ml，在37℃培养箱中消化60分钟，每隔15分钟用漩涡振荡仪振荡2分钟；消化后1500rpm离心10分钟，吸弃上层油脂后加入生理盐水重悬，用100μm细胞筛(美国bd公司)过滤；细胞悬液1000rpm离心10分钟，细胞沉淀用生理盐水重悬洗涤2次后加入egm-2培养基(美国lonza公司)(含10ng/mlegf，美国r&d公司；5ng/mlpdgf，美国r&d公司；10ng/mlbfgf，美国r&d公司；10/ml胰岛素，美国sigma公司；5ng/ml转铁蛋白，美国r&d公司；和5％胎牛血清，美国life公司)重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×10⁶细胞/ml加入到明胶包被的细胞培养板或培养皿中培养，于37℃，5％co2培养箱中培养24-72小时；

培养24-72小时后用5ml移液管吸弃培养液，加入细胞培养液(含10ng/mlegf、5ng/mlpdgf、10ng/mlbfgf、10/ml胰岛素、5ng/ml转铁蛋白和5％胎牛血清)进行换液，细胞培养板或培养皿继续放置37℃，5％co2培养箱中继续培养；

当脂肪干细胞生长融合达到80％以上时进行消化扩瓶，吸弃培养液，取1×pbs(ph值为7.4)洗涤一次后加入0.5ml0.25％胰酶到培养瓶中，消化2-3分钟后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入生理盐水，用5ml移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用生理盐水洗涤一次，加入到同一个15ml离心管中，1000转每分钟离心10分钟收集脂肪干细胞；离心后用1ml新鲜培养液重悬，计数，用5ml移液管加入10ml新鲜的细胞培养液(含10ng/mlegf、5ng/mlpdgf、10ng/mlbfgf、10/ml胰岛素、5ng/ml转铁蛋白和5％胎牛血清)，加入到1瓶胶原包被的培养瓶中继续在37℃，5％co2培养箱中培养，每隔2天换一次新鲜培养液；待脂肪干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集脂肪干细胞，连续传代3代培养，获得10⁹以上的脂肪干细胞，用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得大量脂肪干细胞，放置4℃条件下保存备用。

实施例2明胶包被板和细胞培养瓶的制备

称取5g明胶，用100ml1×pbs(ph＝7.4)在37℃水浴中溶解，并用0.45μm滤器过滤除菌，即配置成5％明胶液。6孔板每孔加入500μl明胶液、90mm加入2ml明胶液以及175cm²培养瓶加入4ml明胶液，在4℃冰箱过夜或37℃孵育1小时后4℃冰箱过夜，在细胞培养容器中进行包被。包被后吸除明胶液，在生物安全柜或超净台中通风干燥，干燥后密封好保存在4℃冰箱备用。

实施例3人脂肪干细胞增殖活性分析

取实施例1中制备的脂肪干细胞以及通过对比例制备的脂肪干细胞进行增殖活性分析。对比例依据strassburgs等2016年11月在细胞生物化学杂志上发表的脂肪干细胞体外支持淋巴管生成参数文章进行培养获得脂肪干细胞(strassburgs，torio-padronn，finkenzellerg，frankenschmidta，starkgb.adipose-derivedstemcellssupportlymphangiogenicparametersinvitro.jcellbiochem.2016nov；117(11)：2620-9.)

使用cck-8(上海碧云天公司)试剂盒检测，根据使用说明书分别在第1天、第2天、第3天、第4天和第5天检测细胞增殖活性。从图1中可以知道，本发明制备的脂肪干细胞与对比例制备相比，细胞增殖速度更快，两者之间并具有显著的差异(**p＝0.012)，表明本发明制备的脂肪干细胞具有更高的增殖活性。

实施例4人脂肪干细胞流式检测

取实施例1中制备的3×10⁶脂肪干细胞，分三组，第一组分别添加到有20μlfitc标记鼠抗人cd90单抗、20μlpe标记鼠抗人cd105单抗和20μlpercp标记鼠抗人cd34单抗；第二组分别添加到有20μlfitc标记鼠抗人cd73单抗、20μlpe标记鼠抗人hla-dr单抗和20μlpercp标记鼠抗人cd14单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μlfitc标记鼠igg1、20μlpe标记鼠igg1和20μlpercp标记鼠igg1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1ml的1×pbs(ph值为7.4)洗涤3次，最后用0.5ml的1×pbs重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用fc500流式细胞仪检测(美国贝克曼库尔特公司)。图2中结果表明所述人脂肪干细胞高表达cd90+为99.08％、cd105+为99.12％和cd73+为99.39％，低表达cd34+为0.12％、hla-dr+为0.51％和cd14+为0.24％，表明符合脂肪干细胞表型标志。

实施例5人脂肪干细胞细胞因子分泌检测

吸取实施例1中培养人脂肪干细胞到第5代的培养上清以及实施例3中对比例制备脂肪干细胞到第5代的培养上清，使用vegf、bfgf、egf、igf-1和pdgfelisa试剂盒(购自美国ebioscience公司)进行检测，根据elisa使用说明书，取50μl培养上清加入到酶标板中进行检测，通过酶标仪在450nm波长测量，620nm波长参考进行检测吸光度(od值)。通过标准品绘制出标准曲线，并检测出各上清中细胞因子的含量。

如图3中结果所示，本发明中脂肪干细胞培养上清细胞因子浓度均高于对比例，两者之间具有显著的差异，其中vegf为672.5pg/ml、bfgf为1767.8pg/ml、egf为780.3pg/ml、igf-1为10045.6pg/ml和pdgf为1324.1pg/ml，表明本发明制备的脂肪干细胞具有更高的细胞因子分泌能力。

实施例6高效促使脂肪干细胞增殖试剂盒的制备

根据实施例1-4，该产品主要由如下成分组成：

1)1000ml细胞培养基，为egm-2培养基；

2)1块明胶包被的细胞培养板或培养皿；

3)8个明胶包被的细胞培养瓶；

4)1ng/ml重组人表皮生长因子；

5)5ng/ml重组人血小板衍生生长因子；

6)10ng/m重组人碱性成纤维生长因子；

7)10ng/ml胰岛素；

8)5ng/ml转铁蛋白；

9)5％胎牛血清；

10)100ml胰酶；

11)使用说明书；

该试剂盒产品培养基保存在4℃条件下；明胶包被的细胞培养板或培养皿和明胶包被的细胞培养瓶生产方法按照上述方法制备，保存在4℃条件下，保质期为1年；细胞因子、胎牛血清和胰酶均保存在-80℃条件下，保质期为1年。