一种脂肪干细胞的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种脂肪干细胞的提取方法，包括以下步骤：抽取人体脂肪到离心管中，加生理盐水混匀后离心，将沉积层弃掉；再次加入生理盐水混匀后离心，将沉积层弃掉；然后向离心管中加EDTA?胰蛋白酶和I型胶原酶，混匀后放入恒温摇床中消化；取出离心管，加入无血清培养基终止消化，混匀，离心，将脂肪层和中间层弃掉；再加生理盐水，混匀后离心，弃掉上清液；加入培养基混匀，然后转移到细胞培养皿中；待繁殖、传代后，回收，检验，合格即得。本发明提出的一种脂肪干细胞的提取方法，提取过程中无需机械破碎，操作简单，成本低，所得脂肪干细胞纯度高，数量高，繁殖传代快且存活率高，可广泛应用于整形美容行业。
【专利说明】
一种脂肪干细胞的提取方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物细胞技术领域，尤其涉及一种脂肪干细胞的提取方法。
【背景技术】
[0002]干细胞是具有自我复制和多向分化的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”。干细胞是指尚未分化的细胞，存在于早期胚胎、胎盘及其附属物、骨髓、外周血和成年组织中，它能够被培养成肌肉、骨骼和神经等200多种人体细胞、组织和器官。干细胞技术最显著的作用就是:能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织和器官。
[0003]脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，脂肪干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一，如何实现从干细胞到脂肪细胞的分化，是构建工程脂肪组织不可回避的问题。基于上述问题，本发明提出了一种脂肪干细胞的提取方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种脂肪干细胞的提取方法。
[0005]—种脂肪干细胞的提取方法，包括以下步骤:
51、抽取人体脂肪，分装到50ml离心管中，每支离心管分装18?20ml脂肪，然后向每支离心管中加生理盐水至40?45ml ；
52、用吸管将步骤SI中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以500?1500r/min的转速离心4?8min，然后静置3?5min ；
53、将吸管伸入经步骤S2静置后的离心管底部，将沉积层吸取弃掉，然后再加入生理盐水至40?45ml ；
54、将步骤S3中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以500?1500r/min的转速离心4?8min，静置3?5min，再用吸管伸入离心管底部，将沉积层吸取弃掉；
55、将步骤S4中剩余的脂肪调整到每支离心管12?16ml，然后向离心管中加EDTA-胰蛋白酶8?16ml，再加I型胶原酶2?4ml，吹吸均勾后放入恒温摇床中消化0.8?Ih ；
56、取出步骤S5中的离心管，向每支离心管中加1?15ml的无血清培养基终止消化，吹吸混勾，以1500?2500r/min离心3?6min，静置3?5min后，将脂肪层和中间层弃掉，留下底部细胞层；
57、向步骤S6中得到的底部细胞层中加生理盐水至40?45ml，吹吸混匀，以1500?2500r/min离心3?6min，静置3?5min后，弃掉上清液；
58、将步骤S7中所得的细胞加入10?15ml的培养基混匀，然后转移到细胞培养皿中，静置70?75h后换液；
S9、步骤S8中的细胞繁殖至一定数量时进行传代，待细胞传至第5代，且第5代细胞达到规定数量时回收，进行检验，检验合格后提供给客户进行回输或面部注射。
[0006]优选的，所述步骤SI中抽取的脂肪为人体腹部、臀部或大腿脂肪。
[0007]优选的，所述步骤S5中加入的EDTA-胰蛋白酶和I型胶原酶的重量比为4:1。
[0008]优选的，所述步骤S5中恒温摇床的转速为150?250r/min。
[0009]优选的，所述步骤S5中恒温摇床的温度为37°C。
[0010]优选的，所述步骤S9中的检查内容包括:无菌检验、支原体检验、内毒素检查。
[0011]本发明提出的一种脂肪干细胞的提取方法，取材于人体脂肪细胞较多的腹部、臀部或大腿，不仅能使脂肪充分发挥其作用，还能使人体曲线更完美，提取过程中无需机械破碎，所得脂肪干细胞纯度高，数量高，繁殖传代快且存活率高，可广泛应用于整形美容行业，本发明提出的提取方法，操作简单，成本低，值得推广。
【具体实施方式】
[0012]下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
[0013]实施例一
本发明提出的一种脂肪干细胞的提取方法，包括以下步骤:
51、抽取人体腹部脂肪，分装到50ml离心管中，每支离心管分装19ml脂肪，然后向每支离心管中加生理盐水至43ml ；
52、用吸管将步骤SI中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以1200r/min的转速离心5min，然后静置5min ；
53、将吸管伸入经步骤S2静置后的离心管底部，将沉积层吸取弃掉，然后再加入生理盐水至43ml ；
54、将步骤S3中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以1200r/min的转速离心5min，静置5min，再用吸管伸入离心管底部，将沉积层吸取弃掉；
55、将步骤S4中剩余的脂肪调整到每支离心管14ml，然后向离心管中加EDTA-胰蛋白酶8ml，再加I型胶原酶2ml，吹吸均匀后放入37°C的恒温摇床中消化0.8h，恒温摇床的转速为220r/min；
56、取出步骤S5中的离心管，向每支离心管中加12ml的无血清培养基终止消化，吹吸混勾，以2200r/min离心4min，静置5min后，将脂肪层和中间层弃掉，留下底部细胞层；
57、向步骤S6中得到的底部细胞层中加生理盐水至43ml，吹吸混匀，以2200r/min离心4min，静置5min后，弃掉上清液；
58、将步骤S7中所得的细胞加入13ml的培养基混匀，然后转移到细胞培养皿中，静置7 Ih后换液；
59、步骤S8中的细胞繁殖至一定数量时进行传代，待细胞传至第5代，且第5代细胞达到规定数量时回收，进行无菌检验、支原体检验、内毒素检验，检验合格后提供给客户进行回输或面部注射。
[0014]实施例二
本发明提出的一种脂肪干细胞的提取方法，包括以下步骤: 51、抽取人体臀部脂肪，分装到50ml离心管中，每支离心管分装18ml脂肪，然后向每支离心管中加生理盐水至40ml ；
52、用吸管将步骤SI中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以800r/min的转速离心7min，然后静置4min ；
53、将吸管伸入经步骤S2静置后的离心管底部，将沉积层吸取弃掉，然后再加入生理盐水至40ml ；
54、将步骤S3中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以800r/min的转速离心7min，静置4min，再用吸管伸入离心管底部，将沉积层吸取弃掉；
55、将步骤S4中剩余的脂肪调整到每支离心管12ml，然后向离心管中加EDTA-胰蛋白酶16ml，再加〗型胶原酶4ml，吹吸均匀后放入37°C的恒温摇床中消化lh，恒温摇床的转速为180r/min；
56、取出步骤S5中的离心管，向每支离心管中加1ml的无血清培养基终止消化，吹吸混勾，以2500r/min离心3min，静置5min后，将脂肪层和中间层弃掉，留下底部细胞层；
57、向步骤S6中得到的底部细胞层中加生理盐水至40ml，吹吸混匀，以2500r/min离心3min，静置5min后，弃掉上清液；
58、将步骤S7中所得的细胞加入12ml的培养基混匀，然后转移到细胞培养皿中，静置75h后换液；
59、步骤S8中的细胞繁殖至一定数量时进行传代，待细胞传至第5代，且第5代细胞达到规定数量时回收，进行无菌检验、支原体检验、内毒素检验，检验合格后提供给客户进行回输或面部注射。
[0015]实施例三
本发明提出的一种脂肪干细胞的提取方法，包括以下步骤:
51、抽取人体大腿脂肪，分装到50ml离心管中，每支离心管分装20ml脂肪，然后向每支离心管中加生理盐水至45ml ；
52、用吸管将步骤SI中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以lOOOr/min的转速离心6min，然后静置4min ；
53、将吸管伸入经步骤S2静置后的离心管底部，将沉积层吸取弃掉，然后再加入生理盐水至45ml ；
54、将步骤S3中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以1000r/min的转速离心6min，静置4min，再用吸管伸入离心管底部，将沉积层吸取弃掉；
55、将步骤S4中剩余的脂肪调整到每支离心管15ml，然后向离心管中加EDTA-胰蛋白酶12ml，再加I型胶原酶3ml，吹吸均匀后放入37°C的恒温摇床中消化0.9h，恒温摇床的转速为200r/min；
56、取出步骤S5中的离心管，向每支离心管中加13ml的无血清培养基终止消化，吹吸混勾，以1800r/min离心5min，静置3min后，将脂肪层和中间层弃掉，留下底部细胞层；
57、向步骤S6中得到的底部细胞层中加生理盐水至45ml，吹吸混匀，以1800r/min离心5min，静置3min后，弃掉上清液；
58、将步骤S7中所得的细胞加入15ml的培养基混匀，然后转移到细胞培养皿中，静置73h后换液； S9、步骤S8中的细胞繁殖至一定数量时进行传代，待细胞传至第5代，且第5代细胞达到规定数量时回收，进行无菌检验、支原体检验、内毒素检验，检验合格后提供给客户进行回输或面部注射。
[0016]实施例四
本发明提出的一种脂肪干细胞的提取方法，包括以下步骤:
51、抽取人体腹部脂肪，分装到50ml离心管中，每支离心管分装18ml脂肪，然后向每支离心管中加生理盐水至42ml ；
52、用吸管将步骤SI中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以500r/min的转速离心8min，然后静置3min ；
53、将吸管伸入经步骤S2静置后的离心管底部，将沉积层吸取弃掉，然后再加入生理盐水至42ml ；
54、将步骤S3中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以500r/min的转速离心8min，静置3min，再用吸管伸入离心管底部，将沉积层吸取弃掉；
55、将步骤S4中剩余的脂肪调整到每支离心管16ml，然后向离心管中加EDTA-胰蛋白酶8ml，再加I型胶原酶2ml，吹吸均匀后放入37°C的恒温摇床中消化0.8h，恒温摇床的转速为250r/min；
56、取出步骤S5中的离心管，向每支离心管中加15ml的无血清培养基终止消化，吹吸混勾，以2000r/min离心4min，静置4min后，将脂肪层和中间层弃掉，留下底部细胞层；
57、向步骤S6中得到的底部细胞层中加生理盐水至42ml，吹吸混匀，以2000r/min离心4min，静置4min后，弃掉上清液；
58、将步骤S7中所得的细胞加入14ml的培养基混匀，然后转移到细胞培养皿中，静置70h后换液；
59、步骤S8中的细胞繁殖至一定数量时进行传代，待细胞传至第5代，且第5代细胞达到规定数量时回收，进行无菌检验、支原体检验、内毒素检验，检验合格后提供给客户进行回输或面部注射。
[0017]实施例五
本发明提出的一种脂肪干细胞的提取方法，包括以下步骤:
51、抽取人体臀部脂肪，分装到50ml离心管中，每支离心管分装19ml脂肪，然后向每支离心管中加生理盐水至44ml ；
52、用吸管将步骤SI中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以1500r/min的转速离心4min，然后静置5min ；
53、将吸管伸入经步骤S2静置后的离心管底部，将沉积层吸取弃掉，然后再加入生理盐水至44ml ；
54、将步骤S3中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以1500r/min的转速离心4min，静置5min，再用吸管伸入离心管底部，将沉积层吸取弃掉；
55、将步骤S4中剩余的脂肪调整到每支离心管13ml，然后向离心管中加EDTA-胰蛋白酶12ml，再加I型胶原酶3ml，吹吸均匀后放入37°C的恒温摇床中消化lh，恒温摇床的转速为150r/min；
56、取出步骤S5中的离心管，向每支离心管中加14ml的无血清培养基终止消化，吹吸混勾，以1500r/min离心6min，静置3min后，将脂肪层和中间层弃掉，留下底部细胞层；
57、向步骤S6中得到的底部细胞层中加生理盐水至44ml，吹吸混匀，以1500r/min离心6min，静置3min后，弃掉上清液；
58、将步骤S7中所得的细胞加入1ml的培养基混匀，然后转移到细胞培养皿中，静置72h后换液；
59、步骤S8中的细胞繁殖至一定数量时进行传代，待细胞传至第5代，且第5代细胞达到规定数量时回收，进行无菌检验、支原体检验、内毒素检验，检验合格后提供给客户进行回输或面部注射。
[0018]本发明提出的一种脂肪干细胞的提取方法，取材于人体脂肪细胞较多的腹部、臀部或大腿，不仅能使脂肪充分发挥其作用，还能使人体曲线更完美，提取过程中无需机械破碎，所得脂肪干细胞纯度高，数量高，繁殖传代快且存活率高，可广泛应用于整形美容行业，本发明提出的提取方法，操作简单，成本低，值得推广。
[0019]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: 51、抽取人体脂肪，分装到50ml离心管中，每支离心管分装18?20ml脂肪，然后向每支离心管中加生理盐水至40?45ml ； 52、用吸管将步骤SI中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以500?1500r/min的转速离心4?8min，然后静置3?5min ； 53、将吸管伸入经步骤S2静置后的离心管底部，将沉积层吸取弃掉，然后再加入生理盐水至40?45ml ； 54、将步骤S3中离心管里的脂肪和生理盐水吹吸混匀，以500?1500r/min的转速离心4?8min，静置3?5min，再用吸管伸入离心管底部，将沉积层吸取弃掉； 55、将步骤S4中剩余的脂肪调整到每支离心管12?16ml，然后向离心管中加EDTA-胰蛋白酶8?16ml，再加I型胶原酶2?4ml，吹吸均勾后放入恒温摇床中消化0.8?Ih ； 56、取出步骤S5中的离心管，向每支离心管中加10?15ml的无血清培养基终止消化，吹吸混勾，以1500?2500r/min离心3?6min，静置3?5min后，将脂肪层和中间层弃掉，留下底部细胞层； 57、向步骤S6中得到的底部细胞层中加生理盐水至40?45ml，吹吸混匀，以1500?2500r/min离心3?6min，静置3?5min后，弃掉上清液； 58、将步骤S7中所得的细胞加入10?15ml的培养基混匀，然后转移到细胞培养皿中，静置70?75h后换液； 59、步骤S8中的细胞繁殖至一定数量时进行传代，待细胞传至第5代，且第5代细胞达到规定数量时回收，进行检验，检验合格后提供给客户进行回输或面部注射。2.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，所述步骤SI中抽取的脂肪为人体腹部、臀部或大腿脂肪。3.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，所述步骤S5中加入的Η)ΤΑ-胰蛋白酶和I型胶原酶的重量比为4:1。4.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，所述步骤S5中恒温摇床的转速为150?250r/min。5.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，所述步骤S5中恒温摇床的温度为37 °C。6.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，所述步骤S9中的检查内容包括:无菌检验、支原体检验、内毒素检查。
【文档编号】C12N5/0775GK106047805SQ201610694409
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月22日
【发明人】于登伟, 于佃才, 李子合
【申请人】湖州赛托森生物科技发展有限公司