动物用的脂肪组织衍生干细胞的制作方法
【专利摘要】本发明涉及动物用的脂肪组织衍生干细胞。本发明提供用于制造和使用脂肪衍生干细胞来治疗非人类哺乳动物的各种医学病状的组合物和方法。特定来说，本发明提供可用于在非人类哺乳动物中修复骨折和治疗“干眼”病状、急性肾衰竭和慢性肾衰竭的方法和组合物。
【专利说明】动物用的脂肪组织衍生干细胞
[0001]相关申请案的交叉参考
[0002]本申请案是2011年2月14日申请的美国申请案12/997，067的部分延续案，所述美国申请案是2009年6月8日申请的国际申请案第PCT/US2009/046587号的国家阶段，所述国际申请案根据35U.S.C.§ 119(e)主张2008年6月11日申请的美国临时申请案第61/060, 701号和2009年4月9日申请的美国临时申请案第61/168，148号的权益，所述每一专利的内容都是全文以引用方式并入本文中。
【技术领域】
[0003]本发明提供用于制造和使用脂肪衍生干细胞来治疗非人类哺乳动物的各种医学病状的组合物和方法，所述医学病状包括骨折、“干眼病状”、慢性肾衰竭和急性肾衰竭。
【背景技术】
[0004]脂肪组织含有已从其分离出多潜能细胞的基质血管成份(SVF)。这些细胞有多种名称:经加工脂肪抽吸物(PLA)细胞、脂肪组织衍生间叶干细胞、多潜能脂肪衍生干(MADS)细胞、脂肪组织衍生干细胞、脂肪组织衍生基质细胞(ADSC、ATSC)、脂肪组织衍生成人干(ADAS)细胞、脂肪组织衍生成人基质(ADAS)细胞和脂肪组织衍生细胞(ADC)。
[0005]ADSC具有与骨髓干细胞(BMSC)类似的表型和基因表达谱。除了能自我更新和长期生长以外，ADSC还能分化成不同细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、神经元和上皮细胞。因此，ADSC不仅逐渐被公认为真正的成人干细胞，且对于未来的临床应用来说还被认为优于其它类型的成人干细胞。骨髓因供区发病而仅可以有效数量获得，而脂肪组织通常可大量获得，尤其是在这个肥胖者越来越多的社会中。另外，无性系研究已确认，骨髓中的BMSC数目为约25，000分之一到100，000分之一，而在经加工脂肪抽吸物中ADSC的平均频率是有核细胞的约2%。因此，Ig脂肪的ADSC产率为约5000个细胞，而BMSC产率为每毫升骨髓100-1000个细胞。
[0006]先前人们已尝试将ADSC用于治疗目的。例如，参见W02005/035742。然而，这些尝试主要集中于ADSC在动物环境中的自体使用。对于动物诊所，自体治疗计划对于兽医和宠物主人二者来说都耗时过久。业内需要用于以有效且不引起所移植细胞排斥的方式治疗非人类哺乳动物(例如宠物和农场动物)的组合物和方法。本文所述的本发明提供这些优势且还提供其它益处。
[0007]本文中所揭示的所有专利、专利申请案、参考文献和其它出版物都是全文以引用方式并入本文中。
【发明内容】
[0008]本发明提供用于制造和使用脂肪组织衍生干细胞(ADSC)的组合物和方法。在一个方面中，本发明提供用于治疗非人类哺乳动物的各种医学病状的方法。在一个方面中，本发明提供用于治疗非人类哺乳动物的尿失禁的方法，所述方法包含向非人类哺乳动物投与有效量的脂肪组织衍生干细胞(ADSC)。非人类哺乳动物也可具有继发症状，其中所述继发症状为膀胱感染或尿液灼伤或膀胱感染和尿液灼伤二者。
[0009]在本发明的另一个方面中，本发明提供用于治疗非人类哺乳动物的炎性疾病的方法，所述方法包含向非人类哺乳动物投与有效量的脂肪组织衍生干细胞(ADSC)。在一个实施例中，所述炎性疾病为关节炎。在另一个实施例中，所述关节炎为骨关节炎。
[0010]在本发明的另一个方面中，本发明提供减轻有需要的非人类哺乳动物的疼痛的方法，所述方法包含向非人类哺乳动物投与有效量的脂肪组织衍生干细胞(ADSC)。
[0011]在本发明的另一个方面中，本发明提供用于治疗有需要的非人类哺乳动物的糖尿病的方法，所述方法包含向非人类哺乳动物投与有效量的脂肪组织衍生干细胞(ADSC)。
[0012]在本发明的另一个方面中，本发明提供用于治疗有需要的非人类哺乳动物的医学病状的方法，所述方法包含向非人类哺乳动物投与有效量的脂肪组织衍生干细胞(ADSC)，其中所述医学病状为一种或一种以上选自由以下组成的群组的病状:尿失禁、骨关节炎、退行性脊髓病、糖尿病、组织再生、伤口愈合、结瘢、软组织缺损、大便失禁、扩张型心肌病、髋关节发育不全、股骨头无血管坏死、韧带损伤、肌腱损伤、脊髓损伤、动脉粥样硬化相关梗塞、关节炎、肌营养不良、骨折、“干眼”病状、慢性肾衰竭和急性肾衰竭。
[0013]本发明提供对上述任一个方面的方法中所论述病状的治疗或缓解，其中ADSC对于非人类哺乳动物来说是异种的。在一个方面中，所述治疗为异种移植，且因ADSC治疗所致的排斥或炎症极弱。在上述任一方法中和本文中，非人类哺乳动物可为以下非限制性实例中的任一者:狗、猫、马、兔、猪、猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、狮、熊、猎豹和美洲驼。
[0014]在另一个方面中，本发明提供用于治疗医学病状的非人类ADSC库，其中所述ADSC对于ADSC的接受者来说是异种的，且其中所述医学病状为一种或一种以上选自由以下组成的群组的病状:尿失禁、骨关节炎、退行性脊髓病、糖尿病、组织再生、伤口愈合、结瘢、软组织缺损、大便失禁、扩张型心肌病、髋关节发育不全、股骨头无血管坏死、韧带损伤、肌腱损伤、脊髓损伤、动脉粥样硬化相关梗塞、关节炎、肌营养不良、骨折、“干眼”病状、慢性肾衰竭和急性肾衰竭。
[0015]在另一个方面中，本发明提供用于治疗医学病状的非人类ADSC库，其中所述ADSC对于ADSC的接受者来说是同种的，且其中所述医学病状为一种或一种以上选自由以下组成的群组的病状:尿失禁、骨关节炎、退行性脊髓病、糖尿病、组织再生、伤口愈合、结瘢、软组织缺损、大便失禁、扩张型心肌病、髋关节发育不全、股骨头无血管坏死、韧带损伤、肌腱损伤、脊髓损伤、动脉粥样硬化相关梗塞、关节炎、肌营养不良、骨折、“干眼”病状、慢性肾衰竭和急性肾衰竭。任选地，以上任一 ADSC库可包含羧甲基纤维素(CMC)。
[0016]在另一个方面中，本发明提供组合物，其包含用于移植的经纯化非人类ADSC群和CMC。在一个方面中，移植为异种移植，其中所述异种移植不会造成对组合物的任何显著排斥。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1绘示关于生成产生胰岛素的细胞的实验结果。用GFP(对照)、Pdxl或Pdx1-PV-16 (PV-16)转导人类ADSC。相差显微术显示，经Pdxl和PV-16转导的细胞在细胞质和培养基中具有胰岛素样颗粒。免疫荧光显微术显示，经Pdxl和PV-16转导的细胞的胰岛素染色呈阳性。使用DAPI核染色来定位细胞。
[0018]图2绘示验证Pdxl和胰岛素表达的实验结果。用GFP(对照)、Pdxl或Pdx 1-PV-16 (PV-16)转导人类和大鼠ADSC。通过西方墨点(western blotting,以β-肌动蛋白充当对照，图Α)和RT-PCR(图B)检查Pdxl在这些细胞中的表达。通过ELISA进一步检查人类ADSC的静态胰岛素产生(在具有23mM葡萄糖的DMEM中，图C)。
[0019]图3绘示检查胰腺基因表达的实验结果。人类和大鼠ADSC未经转导(C)或经GFP或Pdxl转导。通过RT-PCR检查这些细胞和大鼠尿道平滑肌细胞(RUSMC)中Pdxl、胰岛素、胰高血糖素和NeuroD的表达(以b_肌动蛋白充当对照，图A)。人类和大鼠细胞的统计分析结果分别展示于图B(n=3)和图C(n=5)中。星号指示Pdxl转导细胞与未经转导细胞之间有显著差异(P〈0.05)。
[0020]图4绘示关于响应葡萄糖浓度产生胰岛素的实验结果。在含有所示浓度的葡萄糖的缓冲液中培育Pdxl转导细胞。I小时后，通过ELISA评价缓冲液中胰岛素的量。星号指示与OmM葡萄糖下的胰岛素产生相比有显著差异(P〈0.05)。
[0021]图5显示血糖水平(图A)和体重(图B)的变化的实验结果。将30只大鼠随机等分成3组。第一组(对照)接受腹膜内注射的20mM柠檬酸盐缓冲液。第二组和第三组二者接受腹膜内注射的60mg STZ (存于20mM柠檬酸盐缓冲液中)/千克体重。I周后，第二组(盐水)接受盐水治疗，而第三组(IPADSC)接受IPADSC治疗。每周监测所有大鼠的体重和禁食血糖水平。星号指示IPADSC治疗与盐水治疗大鼠之间有显著差异(P〈0.05)。
[0022]图6绘示大鼠的毛皮外观和白内障程度的变化。
[0023]图7显示关于葡萄糖耐量的实验结果。在治疗后第7周结束时，禁食7小时的大鼠接受腹膜内注射的Img葡萄糖/克体重。然后经2小时以30分钟间隔监测从尾部静脉获得的样品中的血糖水平。星号指示IPADSC治疗与盐水治疗大鼠之间有显著差异(P〈0.05)。
[0024]图8显示移植细胞的识别。在治疗后第7周结束时，将大鼠处死并采集其肾用于组织学检查。使用HE染色检查囊下空间中移植细胞的存在。使用免疫荧光(IF)染色识别表达胰岛素的细胞。20X照片中加方框的区域是注射部位并在各别100X照片中放大。100X照片中加方框的区域在各别400X照片中进一步放大。注意IPADSC治疗肾的囊下空间中的组织样结构。在盐水治疗肾中未见到所述结构。IF照片取自3个IPADSC治疗肾。注意胰岛素阳性细胞的存在。
[0025]图9绘示剂量效应。将EdU以O、10、20和50 μ M添加到ADSC0通过核的DAPI染色(如果使用彩色照片，则其将为蓝色)来识别细胞定位。通过阿列克萨594(Alexa594)来检测EdU(如果使用彩色照片，则其将为红色)。结果显示，约50%的细胞经EdU标记(A，X 200)，不管 EdU 浓度如何(B, Ρ>0.05)。
[0026]图10显示时程研究的结果。用10 μ M EdU标记ADSC，且然后在I天、4天、7天、14天和21天时拆分。结果显示，阳性标记细胞中的EdU信号随时间而减小(Α，X 100 ；Β,Ρ〈0.01)。较高放大率(1000Χ)的第21天细胞显示于图C中。
[0027]图11显示通过在组织阵列中使用EdU活体内标记DNA的结果。向新生大鼠腹膜内注射50yg存于PBS中的EdU/g体重。7h后采集主要组织用于制备组织阵列(表3)，然后对其进行HE染色(A)或EdU染色⑶。EdU染色的组织阵列以20 X放大率显示于图C中。EdU标记的皮肤试样(图C的6A)以200X放大率显示于图D中。通过核的DAPI染色(如果使用彩色照片，则其将为蓝色)来识别细胞定位。通过阿列克萨594检测EdU(如果使用彩色照片，则其将为红色)。
[0028]图12显示追踪所移植ADSC的结果。利用10 μ M EdU将大鼠ADSC标记12小时，且然后自体注射到膀胱颈中(Α)。在4周后，通过对EdU(如果使用彩色照片，则其将为红色)、α -平滑肌肌动蛋白(SMA，如果使用彩色照片，则其将为绿色)和核(如果使用彩色照片，则其将为蓝色)的染色来检查组织切片。可在膀胱颈中观察到EdU标记细胞(B，X 20)。大部分EdU标记细胞定位于结缔组织中。少数EdU标记细胞似乎已分化成平滑肌细胞(C，X 200)。
[0029]图13显示关于ADSC治疗动物中的较高排尿压力的实验结果。
[0030]图14显示EdU和SMA的共定位的结果。如果观察彩色影像，则红色信号为EdU，绿色信号为ASMA，且蓝色信号为DAPI。上图中每一图像中的加方框区域都显示于下图中的相应图像中(X400)。
[0031]图15绘示尿道中的弹性纤维。左图:对照。右图:已移植ADSC(X400)。
[0032]图16显示关于ADSC治疗动物中的较高排尿压力的实验结果。
[0033]图17显示关于EdU和SMA的共定位的实验。如果观察彩色影像，则红色信号为EdU，绿色信号为ASMA，且蓝色信号为DAPI。(a~c)定位于粘膜下层中的EdU阳性细胞。(d~h)定位于肌肉中的EdU阳性细胞(X200)。(A)粘膜下层中的EdU阳性细胞(X400)。(B)肌肉中的EdU阳性细胞(X400)。
[0034]图18显示关于ADSC在阴茎中的内皮分化的实验结果。用BrdU标记ADSC并注射到大鼠的海绵体中。在4周后，通过免疫荧光显微术检查组织。抗BrdU和RECA-1抗体分别识别所注射的ADSC(如果使用彩色照片，则其将为绿色)和内皮细胞(如果使用彩色照片，则其将为红色)。重叠影像(BrdU/RECA)显示，一些ADSC(如果使用彩色照片，则其将为黄色)的RECA-1染色也呈阳性。另一使用相差影像的重叠影像(合并)显示ADSC定位到窦内皮。约5%的BrdU+细胞为RECA+，如通过计数剖面中10个随机选择的区域来测定。
[0035]图19显示DMEM和EGM2中的细胞形态和生长速率的比较。将两个大鼠ADSC系RADSC-1和RADSC-2以相同密度(300，000个细胞/培养皿)接种到IOOmm培养皿中并在DMEM或EGM2中生长3天。RADSC-1的细胞形态显示于图A中。两个细胞系的生长速率显示于图B中。
[0036]图20显示识别在EGM2中生长的细胞中的内皮标记的表达的实验结果。使RADSC-1和RADSC-2在DMEM(未经诱导)或EGM2 (经诱导)中生长。然后针对内皮标记CD31、vffF和eNOS对其染色。如果观察彩色影像，则绿色指示⑶31、vWF或eNOS的表达；蓝色指示细胞核。初始放大率为200X。还分析细胞的基质胶管形成(管)和LDL摄取。红色指示LDL的存在，其呈与红色荧光染料DiI偶联的形式。两个细胞系的结果类似；仅显示RADSC-1的结果。人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)充当阳性对照。将实验重复3次。
[0037]图21显示一些图解说明内皮分化的可逆性和可再诱导性的结果。使RADSC-1和RADSC-2在DMEM中生长6天到10天 (第一轮DMEM);分析一半细胞的内皮标记。将另一半细胞转换到EGM2，生长6天(第一轮EGM2)，且分析一半细胞的内皮标记。将另一半细胞转换到DMEM，生长10天(第二轮DMEM)，且分析一半细胞的内皮标记。最后，将另一半细胞转换到EGM2，生长6天(第二轮EGM2)，且分析内皮标记。两个细胞系的结果类似；仅显示RADSC-1的结果。如果观察彩色影像，则绿色指示⑶31、vWF或eNOS的表达；且蓝色指示细胞核。初始放大率为200X。红色指示LDL的存在，其呈与红色荧光染料DiI偶联的形式。将实验重复3次。
[0038]图22显示关于通过“减法”识别内皮诱导因子的实验结果。使RADSC-1细胞在完全或部分补充的EGM2中生长且然后分析LDL摄取。通过所省略因子来指示每一部分补充的EGM2 ;例如，“-FGF”表示无FGF2的EGM2。将实验重复3次。
[0039]图23显示关于通过“加法”识别内皮诱导因子的实验结果。使RADSC-1细胞在EGM2、EBM2或补充有所示因子的EBM2中生长，且然后分析LDL摄取。将实验重复3次。
[0040]图24显示关于FGF2诱导内皮标记表达的实验结果。使RADSC-1细胞在DMEM、EGM2或补充有FGF2和维生素C的EBM2中生长。然后针对内皮标记CD31、vffF和eNOS对其染色。如果观察彩色影像，则绿色指示⑶31、vWF或eNOS的表达；且蓝色指示细胞核。初始放大率为200X。还分析细胞的基质胶管形成(管)。将实验重复3次。
[0041]图25显示关于FGFR抑制剂对内皮分化的效应的实验结果。使RADSC-1细胞在存在或不存在FGFR抑制剂HH73074的情形下EGM2或在补充有FGF2和维生素C的EBM2中生长。然后分析细胞的LDL摄取。如果观察彩色影像，则红色指示LDL的存在，其呈与红色荧光染料DiI偶联的形式。由于已知HH73074对VEGF受体具有弱抑制作用，因此出于排除VEGF信号传导的参与的目的，还使RADSC-1细胞在补充VEGF/维生素C的EBM2中生长。将实验重复3次。
[0042]图26显示用猪ADSC治疗犬骨折的结果。图A提供在移除5个螺钉中的2个后I周时犬的断裂桡骨和尺骨的X射线(第O天)，所述螺钉已用于将动力加压板附接到断裂桡骨。X射线已揭露，在所述板下的骨折部位处，桡骨发生严重脱钙作用且变薄(骨质减少)。在当天(“第O天”)，以0.5mL的体积向所述板的内侧和外侧皮下投与5 X IO6个猪ADSC，且向动物经静脉内投与另外I X IO6个猪ADSC。在投与猪ADSC后17天(图B)和26天(图C)进行的后续X射线揭露，桡骨的脱钙作用逆转且骨折部位愈合。
【具体实施方式】
[0043]本发明提供用于治疗非人类哺乳动物的各种病状和缓解非人类哺乳动物的与各种病状相关的不适和/或疼痛的组合物和方法。
[0044]除非另外定义，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解相同的含义。
[0045]如果此部分中所述的定义与以引用方式并入本文中的专利、已公开专利申请案和其它公开案中所述定义相反或者不一致，则以此部分中所述定义为准，而不以以引用方式并入本文中的定义为准。
[0046]1.一般技术
[0047]除非另外指示，否则本发明的实践将利用干细胞生物学、细胞培养、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术为所属领域技术人员所熟知。所述技术全面解释于文献中，例如分子克隆:实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual),第三版(萨姆布鲁克(Sambrook)等人,2001)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press);寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(P.哈德维(P.Herdewi jn)编辑 ，2004);动物细胞培养(Animal Cell Culture) (R.1.弗拉施尼(R.1.Freshney))编辑，1987);酶学方法(Methods in Enzymology)(学术出版社(Academic Press)公司)；实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.韦尔(D.M.WeiiO和C.C.布莱克韦尔(C.C.Blackwell)编辑)；哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells) (J.M.米勒(J.M.Miller)和M.P.卡洛斯(M.P.Calos)编辑，1987);分子生物学的现行规范(Current Protocolsin Molecular Biology) (F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，1987) ;PCR:聚合酶链式反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)(穆里斯(Mullis)等人编辑，1994)；免疫学现行规范(Current Protocols in Immunology) (J.E.科林根(J.Ε.Coligan)等人编辑，1991)精编分子生物学规范(Short Protocols in MolecularBiology)(威利父子公司(Wiley and Sons)，1999)，胚胎干细胞:实用方法(Embryonic Stem Cells:APractical Approach)(诺特里安尼(Notaranni)等人编辑，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press) 2006);干细胞生物学纲要(Essentials of Stem Cell Biology) (R.兰扎(R.Lanza)编辑，爱思维尔学术出版社(Elsevier Academic Press) 2006);干细胞分析(分子生物学方法)(Stem Cell Assays (Methods in Molecular Biology))(莫翰 C.维姆利(Mohan C.Vemuri)编辑，胡马纳出版社(Humana Press);第一版(2007年8月10日)；间叶干细胞:方法和规范(分子生物学方法)(Mesenchymal Stem Cells:Methods andProtocols (Methods in Molecular Biology))(达尔文 J.普克夫(Darwin J.Prockop)、唐纳德G.菲尼(Donald G.Phinney)、布鲁斯A.邦内尔(Bruce A.Bunnell)编辑，第一版(2008年3 月 7 日))；干细胞手册(Handbook of Stem Cells)(罗伯特兰扎(Robert Lanza)等人编辑，学术出版社(2004年9月14日)；干细胞培养(Stem Cell Culture)，第86卷:细胞生物学方法(Methods in Cell Biology)(杰尼P.马瑟(Jennie P.Mather)编辑，学术出版社，第一版(2008年5月15日))；实用造血干细胞移植(Practical HematopoieticStem Cell Transplantation)(安德鲁 J.坎特(Andrew J.Cant)等人编辑，威利-布莱克韦尔(Wiley-Blackwell)，第一版(2007 年 I 月 22 日));造血干细胞规范(HematopoieticStem Cell Protocols)(凯文D.邦廷(Kevin D.Bunting)编辑，胡马纳出版社，第2版(2008年I月31日));骨髓和干细胞移植(分子医学方法)(Bone Marrow and Stem CellTransplantation (Methods in Molecular Medicine))(麦特贝克(Meral Beksac)编辑，胡马纳出版社；第一版(2007年5月3日))；用于心血管修复的干细胞疗法和组织工程:从基石出石开究到临床应用(Stem Cell Therapy and Tissue Engineeringfor CardiovascularRepair:From Basic Research to Clinical Applications)(纳t匕勒迪布(Nabil Dib)等人编辑，施普林格(Springer)，第一版(2005年11月16日))；血液和骨髓干细胞移植:原理、实践和护理见解(Blood And Marrow Stem Cell Transplantation:Principles，Practice，And Nursing Insights)(金施密特-波克尼(Kim Schmit-Pokorny)(作者)和苏珊艾宗(Susan Ezzone)(编辑)，琼斯与巴特利出版公司(Jones&Bartlett Publishers);第三版(2006 年 5 月 22 日))；造血干细胞规范(Hematopoietic Stem Cell Protocols)(克里斯多夫A.克鲁格(Christopher A.Klug)和克雷格T.乔丹(Craig T.Jordan)编辑，胡马纳出版社；第一版(2001年12月15日))；和临床骨髓和血液干细胞移植(Clinical BoneMarrow and Blood Stem Cell Transplantation)(凯瑞艾金森(Kerry Atkinson)等人编辑，剑桥大学出版社(Cambridge University Press);第三版(2003年12月8日))。
[0048]II.定义
[0049]“脂肪衍生干细胞”、“脂肪组织衍生干细胞”和ADSC在本文中可互换使用且是指源于脂肪组织且能自我更新的多潜能基质细胞或干细胞。“脂肪”意指任一脂肪组织。脂肪组织可为褐色或白色脂肪组织，来源于皮下、网膜/内脏、乳房、性腺或其它脂肪组织部位。优选地，脂肪为皮下白色脂肪组织。所述细胞可包含原代细胞培养物或永生细胞系。脂肪组织可来自任一具有脂肪组织的非人类哺乳动物。脂肪组织可来源于待治疗的非人类哺乳动物(即自体组织)或个体的无性系，或来源于非人类哺乳动物的不同物种(即异种)，或来源于非人类哺乳动物的相同物种但不是待治疗的非人类哺乳动物(即同种)。这些细胞表达细胞表面蛋白的独特组合，其可包括(但不限于)干细胞标记CD34和CD90、四跨膜蛋白CD9、CALLA (⑶10)、氨肽酶N(⑶13)、整合素I (⑶29)、透明质酸受体(⑶44)、整合素.α.4和5(CD49d、CD49e)、ICAM-1 (CD54)、衰变加速因子(CD55)、互补保护素(CD59)、内皮因子(CD105)、VCAM-1 (CD106)、Muc_l, 8 (CD146)和 ALCAM (CDl66)(格罗恩索斯(Gronthos)等人，细胞生理学杂志(J.Cell Physiol.) (2001年)10月;189 (I): 5463)。在一个方面中，来源于猪的ADSC通常对于⑶90、⑶44、⑶29呈阳性且通常对于⑶31、⑶45和⑶11呈阴性。例如，参见瓦琳娜(Valina)等人，欧洲心脏杂志(European Heart Journal) 28:2667-77 (2007),其揭示所培养的猪 ADSC 对于 CD90 (97.3+0.62%)、CD44(98.27+0.38%)和 CD29(98.2+0.87%)呈阳性且对于 CD31 (0.03+0.05%)、CD45 (0.45+0.41%)和 CDll (0.17+0.17%)呈阴性。
[0050]本文所用术语多潜能(multipotent或pluripotent) ADSC的“制剂”或“经纯化制剂”是指含一种或一种以上细胞的制剂，其经操作以提供实质上不含其它组份的细胞制剂。在一些方面中，细胞制剂中以重量或数目计至少约60%不含产生细胞时存在的其它组份。在多个方面中，细胞以重量或数目计为至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少约99%纯。经纯化细胞制剂可通过(例如)从天然来源纯化(例如，提取)、荧光激活细胞分选或所属领域技术人员已知的其它技术来获得。可通过任一适当方法(例如荧光激活细胞分选(FACS))或通过目测检查来分析纯度。
[0051]用于阐述干细胞的纯度的“纯度”并非是指组合物中仅存在干细胞，而是指示干细胞已经操作以使得已将其从其天然组织环境中移除且指示其与所得群体中存在的其它细胞的关系。
[0052]本文所用术语“多潜能”(“multipotent”或“pluripotent”)是指ADSC分化成以下三个胚层的细胞的潜能:内胚层(例如，内部胃粘膜、胃肠道、肺)、中胚层(例如，肌肉、骨、血液、泌尿生殖器)或外胚层(例如，表皮组织和神经系统)。多潜能干细胞可产生任一胎儿或成人细胞类型。其由于没有促成胚外组织(例如，活体内胎盘或活体外滋胚层)的潜能而无法单独发育成胎儿或成人动物。
[0053]“非人类哺乳动物”包括(但不限于)农场动物、运动动物、宠物、非人类灵长类动物、小鼠和大鼠。农场动物可包括(但不限于)猪、牛、马、山羊和绵羊。宠物包括(但不限于)狗、猫、兔和雪貂。此定义范围内的其它动物包括(但不限于)猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、狮、熊、猎豹和美洲驼。非人类哺乳动物在本文中也可称为“个体”。
[0054]“治疗”(“treatment”或“treating”)意指获得有益或所需结果(包括临床结果，包括动物诊所或医院的结果)的方法。出于本发明的目的，有益或所需结果包括(但不限于)缓解与病状相关的症状、降低与病状相关的症状的程度、预防与病状相关的症状恶化或延迟疾病或病状发展。在一些方面中，用一种或一种以上本文所揭示细胞治疗不伴随任何副作用或伴随的副作用少于与目前可用疗法相关者。
[0055]“接受治疗”包括初始治疗和/或连续治疗。本文所用“治疗”是获得有益或所需结果(优选地包括来自动物诊所或医院中的治疗的临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括(但不限于)稳定或改良罹患各种医学病状的非人类哺乳动物的健康相关生活质量。
[0056]本文所用“延迟”疾病或病状的发展意指推迟、阻碍、减缓、阻止、稳定和/或搁延疾病或病状的发展。根据疾病史和/或所治疗的个体，此延迟的时间长度有所不同。如所属领域技术人员所了解，足够或显著延迟实际上可由于个体未出现疾病或病状而涵盖预防。例如，在与不使用所述方法相比时，所述方法可降低给定时段内发展疾病的概率和/或降低给定时段内的疾病程度。在一些方面中，所述比较是基于使用统计显著数目的个体的临床研究。疾病发展可使用标准临床技术来检测。发展也可是指起初可能无法检测的疾病进展且包括发生、复发和发作。
[0057]“减轻”疼痛(例如，与炎性疾病、例如一类关节炎相关的疼痛)或一种或一种以上疼痛症状意指降低经本发明ADSC组合物治疗的非人类哺乳动物的疼痛的一种或一种以上不合意临床表现的程度。
[0058]“有效量”(当在治疗或预防背景中或在减轻疼痛或缓解特定病状的症状的背景中使用时)是足以实现有益或所需结果(包括临床结果)的量。有效量可以一次或一次以上投与来投与。出于本发明的目的，ADSC的有效量是细胞可减轻非人类哺乳动物中所治疗病状的一种或一种以上症状的某一量。例如，已投与ADSC的非人类哺乳动物的跛行的减轻是非人类动物的关节炎的一种症状，且观察到此特定症状的此减轻可意味着已给予所述非人类哺乳动物有效量的ADSC。在一个方面中，进一步培养ADSC以诱导其沿特定途径分化。在另一个方面中，以不发生分化的方式培养ADSC。
[0059]本文所用“有需要的”包括患有病状或疾病或“具有所述病状或疾病的风险”的非人类哺乳动物。本文所用“具有风险”的非人类哺乳动物是具有发展病状的风险的非人类哺乳动物。“具有风险”的非人类哺乳动物可能患有或可能未患有可检测疾病或病状，且可能在本文所述治疗方法之前已显示或可能未显示可检测疾病。“具有风险”表示，非人类哺乳动物具有一种或一种以上所谓风险因子，所述风险因子是与疾病或病状的发展相关联的可测量参数且为业内已知。具有一种或一种以上所述风险因子的非人类哺乳动物发展疾病或病状的概率高于不具有所述风险因子的个体。所述风险因子包括(但不限于)年龄、性另|J、饮食、先前疾病史、前体疾病的存在、遗传(即遗传性(hereditary))因素、繁殖方案和因素以及环境暴露。
[0060]“医药上可接受的载剂”意指基于所属领域技术人员的知识，在与活性成份组合时允许所述成份保持生物活性且并不引起不可接受的免疫反应(例如，严重过敏或过敏性休克)的任一材料。实例包括(但不限于)任一标准医药载剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)和各种类型的润湿剂。用于气溶胶或非经肠投与的实例性稀释剂为磷酸盐缓冲盐水或生理盐水(0.9%)。用于细胞输注的实例性载剂为CMC。包含所述载剂的组合物是通过熟知的常规方法来调配(例如，参见雷明顿氏药学科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences),第 18 版，Α.根那罗(A.Gennaro)编辑，迈克出版(Mack Publishing)公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，1990 ;和雷明顿，药学科学与实践(Remington, The Science and Practice of Pharmacy),第 20 版.迈克出版，2000,其各自是全文以引用方式并入本文中，特别关于调配物)。
[0061]一般在提及“组合物”(“the composition”或“compositions”)时包括且适用于本发明组合物。本发明还提供包含本文所述组份的医药组合物。
[0062]除非另外指明，否则本文所用单数形式“一(a、an)”和“所述”包括复数含义。例如，“一种” ADSC包括一种或一种以上脂肪组织衍生干细胞。
[0063]本文中在提及“关于”某值或参数时包括(且阐述)与所述值或参数本身有关的各方面。例如，提及“关于X”的阐述包括对“X”的阐述。
[0064]应理解，本文中所述本发明的各个方面包括“包含”各个方面、“由其组成”和“基本上由其组成”。
[0065]II1.脂肪衍生干细胞(ADSC)和其分离
[0066]脂肪组织提供多潜能基质细胞的来源。脂肪组织在许多个体(例如，非人类哺乳动物)中可容易获得且含量丰富。许多文献中有记载，脂肪细胞是可补充细胞群。即使在通过抽脂或其它程序进行手术移除后，个体中的脂肪细胞随时间重现也很常见。这表明，月旨肪组织含有能自我更新的基质干细胞。
[0067]先前已阐述用于人类脂肪组织衍生干细胞的普通分离、扩增和分化的方法(祖克(Zuk)等人，组织工程(Tissue Engineering) (2001)7:211-228 ;伯里斯(Burris)等人，分子内分泌学(Mot Endocrinol) 1999, 13:4107 ;埃里克森(Erickson)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochemical & Biophysical ResearchCommunications) 2002, 290:7639 ;格罗恩索斯等人，细胞生理学杂志2001年10月；189(1):5463 ;霍尔沃森(Halvorsen)等人，代谢(Metabolism) 2001, 50:407413 ；霍尔沃森等人，组织工程2001年12月；7(6):72941 ;哈普(Harp)等人，生物化学与生物物理学研究通讯2001,281:907912 ;萨拉丁(Saladin)等人，1999细胞生长与分化(Cell Growth & Diff) 10:4348 ;森(Sen)等人，细胞生物化学杂志(Journal ofCellular Biochemistry)2001, 81:312319 ；周(Zhou)等人，生物技术(BiotechnolTechniq) 1999，13:513517)。脂肪组织衍生干细胞是根据已知技术通过胶原酶消化和差速离心从切碎的人类脂肪组织获得(霍尔沃森等人，代谢2001，50:407413 ;霍内(Hauner)等人，临床研究杂志(J Clin Invest) 1989，84:16631670 ;罗德贝尔(Rodbell)等人，生物化学杂志(J Biol Chem) 1966，241:130139)。这些技术同样适用于非人类哺乳动物脂肪组织衍生干细胞的分离、扩增和分化。例如，参见弗杜希P.(Fotuhi P.)等人，欧洲心脏病学研究杂志(Europace)，9 (12): 1218-21 (2007);麦当娜 R.(Madonna R.)等人,干细胞(Stem Cell), 26(1):202-11(2008);黄1\ (Huang T.)等人，脊髓医学杂志(J SpinalCord Med), 30增刊.l:S35-40(2007);黑姆里希K.(Hemmrich K.)等人，外科研究杂志(J Surg Res.), 144(1):82-8(2008)』CQ(Qu CQ)等人，动物体外细胞发育生物学(InVitro Cell Dev Biol Anim.)，43 (2): 95-100 (2007) dK.H.(Wang K.H.)等人，生物技术应用生物化学(Biotechnol.Appl.Biochem.) (2008);威廉姆斯 K.J.(Williams K.J.),细胞，组织，器官(Cells Tissues Organs)，(2008);和瓦琳娜C等人，欧洲心脏杂志，28(21):2667-77(2007)。
[0068]ADSC可从各种非人类哺乳动物分离，包括(但不限于)猪、牛、犬、马和猫。在一个方面中，可分离出ADSC并用于治疗和/或预防目的的个体为猪。所饲养的猪通常用于提供用于异种移植的部分(例如，用于人类心脏的瓣膜)的目的。因此，猪ADSC可用于异种移植到其它非人类动物中。在另一个方面中，本发明提供从私人拥有的宠物获得的ADSC，所述宠物的获取可由食品与药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)来管理。来自这些宠物的ADSC可用于异种移植、同种移植或同源移植。
[0069]在一个方面中，本发明提供基于ADSC的治疗的接受者的异种ADSC。可使用的ADSC类型的非限制性实例为牛、马、羊和猪。在另一个方面中，本发明提供基于ADSC的治疗的接受者的同种ADSC。在另一个方面中，本发明提供基于ADSC的治疗的接受者的同源ADSC。在另一个方面中，本发明提供基于ADSC的治疗的接受者的自体ADSC。
[0070]来自非人类哺乳动物的ADSC可以所属领域技术人员已知的任一方式分离。在本发明的一个方面中，ADSC可根据以下非限制性方法来分离。首先，用含有1%青霉素和链霉素的PBS冲洗经分离脂肪组织(即脂肪组织或抽脂脂肪)，将其切碎成小块，然后以5:lv/v的胶原酶溶液:脂肪的比率与含有0.075%胶原酶IA型的溶液(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州)混合。在37°C和剧烈振荡下培育I小时后，然后在室温下以220Xg将产物离心10分钟。形成三个层:上部脂质层、中间胶原酶层和底部细胞沉淀。收集中间层并藉助200 μ m过滤器过滤，接着进行离心。在第二轮中使用穿流(flow-thru)中的再循环胶原酶IA型来再次消化新鲜脂肪组织，使用高于第一轮的比率(7:1，以体积计)。底部细胞沉淀含有干细胞。
[0071]可在进一步纯化、分化、向个体投与或用于任一其它用途之前保存或存储ADSC或包含ADSC的脂肪组织。尽管已报道脂肪组织可在室温下存储24小时并在4°C下存储I天到3天，但脂肪组织中的活细胞在存储期间急剧减少。因此，在一个方面中，本发明提供使用脂肪组织保存溶液(ATPS)保存ADSC或脂肪组织的活力的方法，其中所述ATPS含有超氧化物歧化酶(SOD)作为其必需成份。在一个方面中，从哺乳动物红细胞分离超氧化物歧化酶。所属领域技术人员可从市售来源(例如西格玛奥德里奇，其还出售从牛RBC或肝分离的S0D)容易地获取S0D。
[0072]在一个非限制性方面中，ATPS是由 200mg/ml KH2PO4、200mg/L KCl,2.16g/LNa2HP04.7H20、8g/L NaCl、30，000 单位/L SOD 和 5g/L 牛血清白蛋白(BSA)组成。为保存非人类哺乳动物脂肪衍生干细胞，可将IX IO6个脂肪衍生干细胞与Iml ATPS混合并存储在4°C下。所属领域技术人员将认识到，可将ATPS所包含的试剂浓度改变到适当程度，而显著影响ATPS的所需性质。
[0073]众所周知，来源于脂肪组织消化的基质血管成份是由许多类型的细胞组成，例如干细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和其它终末分化细胞。“淘选”是用于从不同细胞类型的混合物富集特定细胞群的免疫选择方法，其已阐述于各种细胞培养教科书和所属领域技术人员已知的参考文献中。这种方法是基于与细胞培养皿结合的抗体的选择能力。将多种细胞类型的混合物在经抗体涂覆的板上培养并允许结合较短时期。然后可从培养皿轻轻地洗脱非附着细胞(所述不结合抗 体者)，从而使得可采集已结合细胞。这种方法有助于研发其它新技术，例如密度梯度分离和利用特定细胞类型的独特表面结合性质的方法。例如，磁珠粒技术的研发允许反复洗涤珠粒结合细胞，从而显著改良潜在分离纯度。各公司所用的顺磁珠粒的大小和组成显著不同且定期进行进一步精制/改良。
[0074]因此，在本发明的一个方面中，使用可一起用于检测⑶34、⑶90和SSEAI细胞标记的存在的抗体组合来选择脂肪衍生干细胞。除了这些标记以外可使用其它抗体，例如在颁予塞尔(Sayre)等人的已公开美国专利申请案第2006/0147430号中揭示的所述标记。在识别阳性细胞之后，可培养所述细胞，对其进行进一步研究，或在一种或一种以上本文所揭示的治疗方法中投与个体。
[0075]IV.组合物
[0076]本发明还提供可用于实践本发明的治疗方法的治疗组合物。在一些实施例中，所用ADSC对于接受者来说是异种的。本发明还提供可用作治疗(治疗性或预防性)各种非人类哺乳动物的“万能供体”、从而降低移植排斥的可能性的ADSC库。
[0077]在本发明的一个方面中，治疗组合物以混合物形式包括医药上可接受的赋形剂(载剂)或介质和本发明的ADSC (包括从其衍生的细胞或组织)，所述ADSC是单独的或与一种或一种以上生物活性剂组合，且其强度可有效通过各种方式投与经历细胞或组织损失或缺陷的个体。
[0078]在另一个方面中，本发明提供用于多种方法中的治疗组合物，其包含或基于本发明的ADSC (包括从其衍生的谱系未定的细胞群、谱系定型的细胞群或组织)以及医药上可接受的载剂或介质。应理解，本发明还涵盖治疗组合物，其包含作用于或调节本发明ADSC和/或从其衍生的细胞或组织的生物活性剂以及医药上可接受的载剂或介质。
[0079]基于细胞或组织的治疗组合物的制备在业内众所周知。所述组合物可调配于医药上可接受的介质中。细胞可呈溶液形式或包埋于基质中。具有生物活性剂(例如，生长因子)作为活性成份的治疗组合物的制备在业内众所周知。通常将活性治疗成份与医药上可接受且与所述活性成份相容的赋形剂或介质混合。另外，如果需要，组合物可含有增强活性成分有效性的少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂。
[0080]可将生物活性剂以经中和的医药上可接受的盐形式调配到治疗组合物中。医药上可接受的盐包括酸加成盐(用肽或抗体分子的游离氨基来形成)，且其是用无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸和诸如此类)来形成。从游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)和诸如此类)。
[0081]ADSC 的投与
[0082]本发明的治疗组合物是以与剂量调配物相容的方式并以治疗有效量来投与。待投与的量取决于(例如)待治疗的个体和虚弱情况。然而，本发明治疗组合物的适宜剂量可在以下范围内:约0.05 X IO6个到100.0 X IO6个脂肪衍生干细胞/10毫米治疗部位，优选地约0.10 X IO6个到50.0 X IO6个脂肪衍生干细胞/10毫米治疗部位，且更优选地约0.5 X IO6个到5.0X IO6个脂肪衍生干细胞/10毫米治疗部位。初始投与和后继投与的适宜方案也是可变的，但可包括初始投与和之后以一个或一个以上所需或所指示间隔(例如数周、数月或数年)通过后续注射或其它投与来投与重复剂量。[0083]所属领域技术人员可容易地确定用于特定目的的适当细胞浓度。实例性剂量是在每天每治疗部位约0.05X IO6个到100.0X IO6个细胞的范围内。在一个非限制性实例中，将约5 X IO6个ADSC注射到非人类关节(例如，僵硬关节)中来治疗骨关节炎。治疗组合物的精确投与时间表取决于兽医的判断和所需结果，且因此在某种程度上为每一个体所特有的。
[0084]本发明的ADSC或分化细胞可通过优选地经由递送装置(例如管，例如导管)注射到个体的标靶部位中来投与。在一个方面中，所述管另外含有针(例如注射器)，借助其可将细胞引入个体的所需位置中。向个体投与细胞的具体非限制性实例也可包括通过皮下注射、肌内注射、关节内或静脉内注射来投与。如果经静脉内投与，则可制备细胞的可注射液体悬浮液并通过连续滴注或以浓注形式来投与。在另一个方面中，如果待治疗的医学病状为扩张型心肌病，则所属领域技术人员(例如，兽医)可使用到达冠状动脉中的基于导管的注射或以使ADSC捕捉于毛细血管床中以使其可分布到周围组织的方式来递送ADSC。
[0085]还可将细胞以不同形式插入递送装置(例如注射器)中。例如，可将细胞悬浮于此一递送装置所含溶液中。本文所用术语“溶液”包括本发明细胞于其中保留活力的医药上可接受的载剂或稀释剂。所述载剂和稀释剂的使用为业内所熟知。溶液优选为无菌的且其流动性达到易于用注射器抽注的程度。优选地，溶液在制造和存储条件下稳定且在保存时藉助使用(例如)对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞和诸如此类来抵抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。本发明的溶液可通过将如本文所述的ADSC或分化细胞纳入医药上可接受的载剂或稀释剂和视需要上文所列举的其它成份中且随后过滤灭囷来制备。
[0086]细胞可全身性(例如经静脉内)或局部地(例如，在超声心动图指导下直接投与到心肌缺损处，或在手术期间在可视化情况下直接施加)投与。对于所述注射，细胞可存在于可注射液体悬浮液制剂中或存在于可以液体形式注射且在受损组织部位变为半固体的生物相容性介质中。可使用常规心内注射器或可控内窥镜递送装置，只要针腔或孔的直径足以使剪切力不会损伤所递送细胞即可(例如30号或更大)。
[0087]细胞可以准许其移植到打算组织部位并重构功能缺陷区域或使其再生的任一方式来投与。可纳入或包埋ADSC的载体基质包括具有生物相容性、接受者相容性且降解成对接受者无害的产物的基质。这些基质在活体内为ADSC和分化细胞提供支持和保护。
[0088]天然和/或合成生物可降解基质是所述基质的实例。天然生物可降解基质包括血浆凝块(例如来源于哺乳动物)、胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白基质。用于细胞移植基质的适宜合成材料必须具有生物相容性以避免迁移和免疫学并发症；且应能广泛支持细胞生长和分化细胞功能。其必须也可再吸收，从而允许全天然组织来替代。基质应可构造成各种形状且应具有足够强度以防止在植入后瓦解。各种研究指示，由聚羟乙酸制成的生物可降解聚酯聚合物满足所有这些准则，如瓦蔡蒂(Vacanti)等人，小儿外科杂志(J.Ped Surg.),23:3-9(1988);西玛(Cima)等人，生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng.) 38:14 5 (1991);瓦蔡蒂等人，整形与改造外科学(Plast.Reconstr.Surg)，88:753-9 (1991)所述。其它合成生物可降解载体基质包括合成聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。合成聚合物的其它实例和将细胞纳入或包埋到这些基质中的方法也为业内已知。例如，参见美国专利第4，298，002号和第5，308，701号。[0089]细胞与聚合物的附接可通过用诸如以下等化合物涂覆聚合物来增强:基膜组份、琼脂、琼脂糖、明胶、阿拉伯胶(gum arabic)、胶原I型、II型、III型、IV型和V型、纤连蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、其混合物和细胞培养领域技术人员已知的其它材料。用于基质中的所有聚合物都必须满足为细胞的后续生长和增殖提供足够支持所需的机械和生物化
学参数。
[0090]生物可降解聚合物基质的一个优势在于，可将血管生成性化合物和其它生物活性化合物直接纳入载体基质中，以便其在活体内可随着载体基质降解而缓慢释放。随着细胞-聚合物结构血管化和结构降解，ADSC可根据其固有特性来分化。可将包括以下的因子纳入基质中或连同基质一起提供:营养素、生长因子、分化或去分化(即，使分化细胞丧失分化特性并获得诸如增殖等特性和更一般的功能)诱导剂、分泌产物、免疫调节剂、炎症抑制剂、消退因子、增强或允许淋巴网络或神经纤维向内生长的生物活性剂、透明质酸和所属领域技术人员已知且可从诸如合作研究(Collaborative Research)、西格玛化学(SigmaChemical)公司等供应商购得并具有关于有效量构成的说明书的药物、诸如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)等血管生长因子。类似地，可合成含有诸如附接肽RGD (Arg-Gly-Asp)等肽的聚合物用于形成基质(例如，参见美国专利第4，988，621号、第4，792，525号、第5，965，997号、第4，879，237号和第 4，789，734 号)。
[0091]在另一个实例中，细胞可在凝胶基质(例如，明胶海绵(Gelfoam)，厄普约翰(Upjohn)公司)中移植，所述凝胶基质聚合以形成可生长ADSC或分化细胞的基质。已研发各种囊封技术(例如莱西(Lacy)等人，科学(Science) 254:1782-84(1991);沙利文(Sullivan)等人，科学 252:718-712 (1991) ；W091/10470 ;W091/10425 ;美国专利第5，837，234号；美国专利第5，011，472号；美国专利第4，892，538号)。
[0092]PLGA或聚(乳酸-共-羟乙酸)是食品与药物管理局(FDA)批准的共聚物，其由于其生物可降解性和生物相容性而在多种治疗装置中使用。PLGA是藉助两种不同单体、即羟乙酸和乳酸的环状二聚体(1，4-二恶烷-2，5-二酮)的无规开环共聚合来合成。用于制备此聚合物的常用催化剂包括2-乙基己酸锡(II)、环烷氧锡(II)或异丙醇铝。在聚合期间，连续单体单元(羟乙酸或乳酸)在PLGA中通过酯键连接在一起，从而产生非线性脂肪族聚酯产物。由于PLGA在体内经历水解而产生初始单体乳酸和羟乙酸，因此其已成功用作生物可降解聚合物。所述两种单体是体内各种代谢途径的副产物。由于身体能有效分解所述两个单体，因此没有与使用PLGA进行药物递送或生物材料应用相关的全身毒性。与PLGA/羧甲基纤维素(CMC)混合的ADSC保留在注射区域的趋势大于与盐水混合的ADSC。
[0093]V.经遗传修饰的细胞
[0094]另外 ，ADSC可经改造以含有表达生长因子、激素和细胞因子的基因。例如，ADSC可经改造以表达有益基因，例如(但不限于)VEGF、BDNF, IGF、TGF、NGF和其它神经滋养和血管滋养生长因子。注射经特别改造的ADSC可帮助某些组织再生；例如，BDNF之于神经。ADSC还可经改造以表达β细胞特异性基因Pdx-1，其使得ADSC能分泌胰岛素。可将所述细胞移植到个体中以治疗其糖尿病。在另一个方面中，ADSC可经改造以产生肌营养不良蛋白且然后植入个体中以治疗肌营养不良。在另一个方面中，表达软骨细胞的至少一个基因型或表型特性的ADSC经遗传修饰以表达外源基因或抑制内源基因的表达并将其植入动物中。本发明提供在植入之前遗传修饰所述细胞和群体的方法。应理解，即便没有遗传修饰的帮助，ADSC可能也能沿谱系向器官特异性细胞(例如，软骨细胞)进一步分化。
[0095]可将包含启动子和所关注序列的核酸构筑体以非复制型DNA(或RNA)分子形式引入接受者的原核或真核细胞中，所述分子可为线性分子或更优选地闭合共价环状分子。由于所述分子在没有复制起点时不能自主复制，因此基因的表达可藉助所引入序列的短暂表达来进行。或者，可藉助将所引入DNA序列整合到宿主染色体中来进行永久表达。
[0096]在一个方面中，利用能将所需基因序列整合到宿主细胞染色体中的载体。已将所引入DNA稳定地整合到染色体中的细胞可通过另外引入一个或一个以上允许选择含有所需核酸序列的宿主细胞的标记来选择。标记(如果需要)可向营养缺陷宿主提供原养，提供杀生物剂抗性(例如对抗生素或诸如铜等重金属的抗性)或诸如此类。可将可选择标记基因序列直接连接到待表达的DNA基因序列或通过共转染引入同一细胞中。优选地，可量化标记的表达。
[0097]在优选方面中，可将所引入核酸分子纳入接受者宿主中能自主复制的质粒或病毒载体中。众多种载体中的任一者可用于此目的。在选择特定质粒或病毒载体时的重要因素包括:1)从不含所述载体的接受者细胞中识别并选择出含有所述载体的所述接受者细胞的便捷性；2)特定宿主中需要的载体的拷贝数；和3)是否需要能使所述载体在不同物种的宿主细胞之间穿梭。
[0098]优选真核载体包括(例如)痘苗病毒、SV40、反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和所属领域技术人员熟悉的各种基于质粒的市售哺乳动物表达载体。
[0099]在已制备含有构筑体的载体或核酸分子用于表达后，可通过以下多种适宜方式中的任一者将DNA构筑体引入适当宿主细胞中:即转化、转染、病毒感染、偶联、原生质融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射和诸如此类。在引入载体后，使接受者细胞在选择性培养基中生长，所述选择性培养基针对含有载体的细胞的生长进行选择。经克隆基因分子的表达导致异源蛋白的产生。
[0100]将所引入DNA “维持”在细胞中应理解为，在所讨论细胞继续生长并增殖时，所引入DNA在基本上所有所述细胞中继续存在。也就是说，在多轮细胞分裂后，所引入DNA不会从大部分细胞中稀释。相反，其在细胞增殖期间复制，且在几乎每一个子细胞中都保留所引入DNA的至少一个拷贝。可以两种方式中的任一者将所引入DNA维持在细胞中。第一，可将其直接整合到细胞的基因组中。发生这种情况的频率极低。第二，其可以染色体外元件或游离体的形式存在。为了使游离体在细胞增殖期间不被稀释，可在所引入DNA和在需要标记基因表达的条件下生长的细胞中包括可选择标记基因。甚至在已将所引入DNA整合于基因组中的情形下，也可包括可选择标记基因以防止从染色体切除所述DNA。
[0101]经遗传修饰的细胞可短暂表达所关注基因或组成型表达所关注基因。所述表达可位于细胞内或细胞表面上。在本发明的一个方面中，本发明的ADSC经遗传修饰以短暂表达一种或一种以上有益于治疗特定医学病状或减轻疼痛的细胞因子。例如，可将已经遗传修饰以表达抗炎性细胞因子(例如，IL-2)的ADSC移植到发生炎症的位置(例如，关节炎关节)中。然后由于ADSC除了表达有益的抗炎性细胞因子外还可变成软骨细胞，所以所述移植向个体提供双重益处。短暂表达可延续数分钟、数小时、数天或甚至数周的时段。在本发明的一些实施例中，有益细胞因子的短暂表达为I周、2周或3周。在本发明的其它实施例中，有益细胞因子的短暂表达为症状减少或甚至消失所需的时间长度。症状的减少或消失可由治疗个体的所属领域技术人员(例如兽医)来确定。
[0102]然后可通过各种方法在转基因可在活体内表达的条件下将经遗传改变的细胞引入个体中。作为非限制性实例，转基因可编码产生细胞外基质蛋白，其中转基因优选地编码产生胶原。然后可将含有细胞外基质蛋白的转基因的细胞引入动物中。或者，可腹膜内注射含有转基因的细胞或将其注射到一些其它适宜的器官储积部位中。
[0103]V1.ADSC 库
[0104]本发明还提供来源于多种非人类哺乳动物物种的ADSC存储库。可使用的ADSC类型的非限制性实例为牛、马、羊和猪。ADSC库允许存放和/或存储已从多种非人类哺乳动物分离的ADSC。ADSC库允许所属领域技术人员(例如，兽医)便捷迅速地治疗动物。ADSC库也允许所属领域技术人员用其确定为适当的自体、同种、异种或同源ADSC治疗动物。在一个方面中，提供可通过FDA的移植(包括异种移植)条例的猪-衍生ADSC库用于治疗性以及预防性动物治疗。在另一个方面中，提供来源于未经FDA批准的来源的猪-衍生ADSC库用于治疗性以及预防性动物治疗。在另一个方面中，ADSC库对于治疗接受者来说是异种的。在另一个方面中，ADSC库充当动物治疗的接受者的万能供体。
[0105]VI1.具有来源于非人类哺乳动物的ADSC的试剂盒
[0106]本发明还提供包括来源于任一非人类哺乳动物的ADSC的组合物和适宜包装的制造物件和试剂盒。在一个方面中，组合物包含100%(在提及纯度时)的ADSC。“纯度”并非是指组合物中仅存在干细胞，而是指示干细胞已经操作以使得已将其从其天然组织环境移除。关于其它方面，组合物包含 99.9%,99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91% 或90%纯度的ADSC。在其它方面中，组合物包含85%、80%、75%或70%纯度的ADSC。包含来自非人类哺乳动物的ADSC的试剂盒可用于存储和/或装运。在一些方面中，本发明包括具有以下的试剂盒:(i) 一种或一种以上来源于一种或一种以上非人类哺乳动物的多潜能ADSC或可移植ADSC和(ii)使用所述试剂盒治疗需要所述治疗的非人类哺乳动物的病状的说明书。在多个方面中，本发明的特征为具有以下的试剂盒:(i) 一种或一种以上来源于一种或一种以上非人类哺乳动物的多潜能ADSC或可移植ADSC和(ii)使用所述试剂盒进行研究或药物筛选用途的说明书。 在另一个方面中，将ADSC组合物与羧甲基纤维素(CMC)组合。
[0107]本文所述组合物的适宜包装为业内已知，且包括(例如)小瓶(例如，密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如，密封麦拉(Mylar)袋或塑料袋)和诸如此类。这些制造物件可进一步经灭菌和/或密封。本发明还提供包含本文所述组合物的单位剂型。可将这些单位剂型以单一或多个单位剂量存储在适宜包装中且还可进一步经灭菌和密封。本发明试剂盒中所供应的说明书通常为标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸页)上的书面说明书，但也可接受机读说明书(例如，载于磁性或光学存储盘上的说明书)。关于使用来源于非人类哺乳动物的ADSC的说明书通常包括关于用于打算治疗或工业应用的剂量、投药时间表和投与路径的信息。试剂盒可进一步包含对选择适宜治疗的个体的方法的描述。
[0108]容器可为单位剂量、散装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，也可提供含有足够剂量的ADSC以在诸如以下等延长时段内为个体提供有效治疗的试剂盒:约I周、约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月或更长时段中的任一者。试剂盒还可包括多个单位剂量的细胞和使用说明书，并以足够数量包装以供在动物诊所(例如动物医院)、动物医院中的药房和动物诊所和/或动物医院的供应商店中存储和使用。
[0109]另外，套组可含有包含对于治疗接受者为异种、同种或同源的ADSC的组合物。
[0110]VII1.ADSC的治疗和投与方法
[0111]可投与ADSC以治疗多种哺乳动物病状，包括(但不限于)尿失禁、骨关节炎、退行性脊髓病、糖尿病、组织再生、伤口愈合、结瘢、软组织缺损、大便失禁、扩张型心肌病、髋关节发育不全、股骨头无血管坏死、韧带损伤、肌腱损伤、脊髓损伤、动脉粥样硬化相关梗塞、关节炎和肌营养不良。ADSC的另一用途是阻抑免疫反应以预防移植物抗宿主(GVH)疾病。ADSC可用于组织再生，或用于其可分泌的各种因子和/或酶，或用于其在分化后对周围环境的效应。
[0112]可将脂肪衍生干细胞或分化细胞移植到接受者中，其中所述细胞将增殖并分化以形成新细胞和组织，从而提供通常由所述组织提供的生理过程。本文所用术语“移植”是指仅转移细胞或转移包埋于载体基质中的细胞。细胞可为自体、同源、同种或异种细胞。本文所用术语“组织”是指联合执行特定功能的类似专门化细胞的聚集体。组织打算涵盖所有类型的生物组织，包括硬组织和软组织二者。软组织是指连接、支持或包围身体的其它结构和器官的组织。软组织包括肌肉、肌腱(将肌肉连接到骨的纤维带)、纤维组织、脂肪、血管、神经和滑膜组织(关节周围的组织)。硬组织包括结缔组织(例如，诸如骨组织或骨等硬形式)以及其它肌肉或骨骼组织。
[0113]在本发明的另一个方面中，将ADSC与医药上可接受的载剂或赋形剂一起投与。本文所述医药上可接受的赋形剂(例如，媒剂、佐剂、载剂或稀释剂)为所属领域技术人员所熟知且公众可容易获得。优选地，医药上可接受的载剂或赋形剂为在化学上对治疗组合物为惰性者和在使用条件下无有害副作用或毒性者。
[0114]赋形剂或载剂的选择部分取决于特定治疗组合物以及投与所述组合物使用的特定方法。因此，本发明医药组合物有众多种适宜调配物。本文所述调配物仅为实例性且决不具有限制性。
[0115]通常，生理上可接受的载剂是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载剂的实例包括(但不限于)盐水、溶剂、分散介质、细胞培养基、水性缓冲剂(例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸)；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA ;糖醇，例如甘露醇或山梨醇；盐形成抗衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如吐温(TWEEN，TM)、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克(PLUR0NICS，TM)。
[0116]A.尿失禁的ADSC治疗
[0117]ADSC可用于治疗各种非人类哺乳动物的尿失禁。尿失禁(UI)是使人虚弱且迄今难以治愈的病状。在一个方面中，Π定义为无意漏尿并影响约20%切除卵巢(卵巢子宫切除术)的雌性狗，但在少于1%的完整雌性狗中出现且极少在雄性犬中报道，不管其性腺状态如何。
[0118]罹患UI的狗具有一些常见的继发性问题，例如膀胱感染和尿液灼伤。膀胱感染是由细菌引起的，所述细菌沿尿道向上迁移并穿过患有Π的狗的较松弛尿道口进入膀胱。皮肤的尿液灼伤是因长期接触漏出的尿液(其具有高度腐蚀性)所致。在雌性狗中，Π可在自切除卵巢后I周起的任一时间发生且与通常导致动物安乐死的严重管理问题相关。人们相信切除卵巢的雌性狗的UI是因神经、血管或激素变化而非因手术期间持续的下泌尿道的机械损伤而发生。
[0119]目前，主要用苯丙醇胺(PPA)来治疗犬UI。PPA是α-肾上腺素能激动剂并刺激分泌去甲肾上腺素(增加尿道括约肌肌肉紧张度的激素物质)。在1999年，由于PPA会增加出血性中风(脑中出血或血液流入脑周围组织中)的风险，所以联邦食品与药物管理局禁止将其用于人类。
[0120]已在人类医学中成功证明了 UI的干细胞疗法。现在，将干细胞从个体的骨骼肌分离并注射到尿道括约肌中，从而导致肌肉细胞再生和尿道收缩性增强。然而，由于缺乏所述干细胞且肌肉生检大小受限，因此此程序需要持久培养所分离干细胞。另外，这些细胞注定仅变成肌肉细胞且因此不能复原尿道中的其它细胞类型(例如神经和血管)。相比之下，ADSC可大量获得并可分化成众多种细胞类型(包括神经元细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞)，从而提供优于其它类型的疗法的优势。
[0121]因此，可使用ADSC来治疗UI。在一个方面中，将所使用的ADSC描述为万能供体。可将用作万能供体 的ADSC存储在动物诊所或动物医院以便于迅速治疗。将有效量的ADSC注射到针对Π进行治疗的个体的尿道括约肌区域中。有效量根据动物大小在每个动物一百万个到一千万个细胞或五百万/IOkg的范围内。可通过使用允许可视化和注射二者的尿检查仪来完成精确注射。所属领域技术人员(例如，兽医)可与个体的体重成比例地调整悬浮液的体积和细胞数。
[0122]在治疗程序后，个体的所有者应每天留心监测个体以观察以下特性:监测注射部位的反应体征，例如发红、疼痛和发热；监测动物的过敏性反应和尿道堵塞体征；动物中的任何其它不寻常体征，例如持续恶心、疲劳、嗜睡、食欲下降和排尿困难。如果观察到任一所述特性，则个体的所有者应立即通知兽医，以便兽医可采取适当措施来改善个体的健康状态。兽医可在治疗后定期实施评估，例如，在治疗后10天到15天、25天到30天和55天到60天。
[0123]B.骨关节炎(OA)的ADSC治疗
[0124]ADSC可用于治疗各种非人类哺乳动物的骨关节炎(OA)。OA是狗的慢性疼痛的最常见病因，且在美国在任何时候都有20%以上或一千万只到一千二百万只狗患有慢性疼痛。OA的特性在于关节软骨退化，伴随基质损失、纤维性颤动和形成裂缝，且可导致软骨表面的完全损失。软骨细胞(即关节软骨的唯一细胞)经由分泌大分子组份(胶原、糖胺聚糖和透明质酸)和调节细胞外基质更新来维持细胞外基质的稳态合成和降解。在OA中，破坏性和促炎性媒介物相对于合成代谢和修补性物质过量产生，从而导致关节软骨被逐渐破坏。
[0125]现在，干细胞疗法已在临床环境中应用于人类、马和狗。在马中，使用脂肪组织衍生干细胞(ADSC)治疗肌腱损伤、韧带损伤、骨关节炎(OA)和骨软骨缺陷已达成高成功率(约70%)。在狗中，OA的ADSC治疗似乎同样有效。是干细胞疗法的潜在目标的其它犬疾病包括肌腱和韧带损伤、髋关节发育不全、股骨头无血管坏死、扩张型心肌病、脊髓损伤、退行性脊髓病、尿失禁(UI)和肌营养不良。
[0126]目前，主要用NASID来治疗0A。然而，许多科学研究和临床经验表明，NSAID并不彻底缓解疼痛。与药物疗法相比，诸如ADSC疗法等细胞疗法不依赖其作用的单一标靶受体或途径。细胞疗法通过分泌细胞因子和生长因子以及通过将内源细胞募集到受伤部位来起滋养作用，且其可促进细胞分化成常驻谱系。已知包括ADSC的间叶干细胞与其局部环境的细胞连通，阻抑免疫反应并抑制凋亡。最新研究也显示，骨髓干细胞(其具有与ADSC类似的再生能力)可将新线粒体递送到受损细胞，从而拯救有氧代谢。因此，ADSC疗法可减轻OA个体的疼痛并促进愈合，从而改良生活质量。
[0127]因此，ADSC可用于治疗0A。在一个方面中，将所使用的ADSC描述为万能供体。可将用作万能供体的ADSC存储在动物诊所或动物医院以便于迅速治疗。在一个方面中，本发明提供对罹患OA的非人类哺乳动物(例如狗)的治疗。尽管OA实际上可折磨任一关节，但其最常与后肢膝关节和髋关节相关。治疗可通过将ADSC悬浮液注射到所述关节中来实行。所属领域技术人员(例如，兽医)可熟练地按个体大小成比例地调整细胞悬浮液的体积和细胞数。作为非限制性实例，20kg狗的每个关节可接受存于0.5ml PBS中的五百万个ADSC。在治疗之后，劝告所有者每天牵绳遛狗30分钟。允许非人类哺乳动物继续服用在ADSC治疗前所服用的任何口服药物。在ADSC治疗前的任何关节内治疗都应中断。
[0128]在治疗后,动物评估将纳入病历、身体检查和跋足检查,所述跋足检查包括关节灵活性和操作时的疼痛记录。临床结果量度将基于动物矫形外科评估，所述评估使用基于标准化问卷的数值等级量表。可在狗通过关节内注射接受测试或对照制剂之前2天与14天之间记录所有者评估和动物评估二者的基线结果。可在狗的关节内注射后30天、60天和90天时到动物诊所进行跟踪访视。在每次访视时，可要求所有者完成作为从辛辛那提(Cincinnati)矫形外科失能指数改编的标准问卷的一部分的数字等级量表(I (最好)到5 (最差))，其包括对以下参数的评估:行走、跑、跳、突然转向、从躺下起来、从站立躺下、爬阶梯、下阶梯、蹲下排尿或排便、早晨僵硬、晚上僵硬、在光滑地板上行走困难和自主玩耍的意愿。
[0129]C.愈合伤口的ADSC治疗
[0130]也可出于加速伤口愈合和减少瘢痕形成的目的向非人类哺乳动物投与ADSC。此既适用于改良美容术(即，仅出于美容目的改良瘢痕愈合)也适用于辅助改良体内手术瘢痕(例如，手术吻合术部位处的过度结瘢可引发手术并发症，例如吻合术部位挛缩。在手术时或以延迟方式局部注射ADSC可改良手术组织部位愈合并降低由于过度结瘢所致的手术后并发症的发生率)。
[0131]因此，在本发明的一个方面中，在所需位置(例如沿手术伤口的缝合部位)皮下注射ADSC。在某些方面中，可引入载体材料(例如具有CMC的基质胶或微球体)的使用以进一步将ADSC定位到治疗部位。将ADSC引入伤口部位导致ADSC以模拟身体对伤口的天然反应的方式分化。例如，ADSC似乎自发分化成包含天然伤口愈合器官的其它细胞类型(例如成纤维细胞和炎性细胞)或新形成血管。
[0132]D.ADSC的预防用途
[0133]本发明的ADSC还用作预防以通过分别向髋部或股骨头投与有效量的ADSC来延迟髋关节发育不全和股骨头无血管坏死的发展。有效量根据动物大小在每个动物一百万个到一千万个细胞或五百万/IOkg的范围内，此可由所属领域技术人员(例如，兽医)容易地确定。
[0134]E.ADSC在骨折修复中的使用
[0135]本发明的ADSC用于促进骨断裂的修复，包含在断裂部位投与有效量的ADSC。在某些实施例中，ADSC的有效量可在约I X IO5个ADSC到约I X IO8个ADSC、约5 X IO5个ADSC至Ij约5X107个ADSC、约IXlO6个ADSC到约I X IO7个ADSC的范围内。在其它实施例中，ADSC是连同有效量的骨形态发生蛋白(BMP) —起投与。在特定实施例中，BMP为人类BMP2、人类BMP4、人类BMP7或人类BMP的混合物，所述混合物包含BMP2、人类BMP4、人类BMP7中的一者或一者以上。在特定实施例中，BMP或BMP混合物中的一者或一者以上是以重组方式产生。BMP的适宜水平提供于市售去矿质骨基质产品(例如，定制艾罗麦? ( AlloMatrix?Custom);瑞特医疗技术(Wright Medical Technology)公司，阿灵顿，田纳西州)中或可由所属领域技术人员独立确定。在所述实施例的特定方面中，同样经静脉内投与有效量的ADSC。在某些实施例中，经静脉内投与的ADSC的有效量在约IXlO5个ADSC到约IXlO8个ADSC、约 5 X IO5 个 ADSC 到约 5X107fADSCJ4 I X IO6 个 ADSC 到约 I X IO7 个 ADSC 的范围内。在所述实施例的其它方面中，根据动物大小来调整所投与ADSC和BMP的剂量。因此，在某些实施例中，所投与ADSC的有效量是在约I X IO5个ADSC/千克体重到约I X IO8个ADSC/千克体重、约5 X IO5个ADSC/千克体重到约5 X IO7个ADSC/千克体重、约I X IO6个ADSC/千克体重到约I X IO7个ADSC/千克体重的范围内。在其它特定实施例中，所治疗的动物是非人类动物且ADSC来自非人类动物。在具体实施例中，ADSC是猪ADSC。
[0136]F.ADSC在“干眼”病状治疗中的用途
[0137]非人类哺乳动物可因泪腺和/或睑腺的功能障碍导致泪液的产量降低且不足或所产生泪液的组成发生改变且有效性降低而产生“干眼”病状(例如，干性角膜结膜炎)。干眼症的病因尤其包括自体免疫疾病(例如，修格兰氏综合症(S.j(h_w^s syndrome)和/或类风湿性关节炎)、年龄和创伤。
[0138]本发明的ADSC用于促进患有干眼症的非人类哺乳动物的泪液产生复原，包含将有效量的ADSC投与到受折磨非人类哺乳动物眼睛的泪腺周围区域中。在某些实施例中，ADSC的有效量可在约I X IO5个ADSC到约I X IO8个ADSC、约5 X IO5个ADSC到约5 X IO7个ADSC、约I X IO6个ADSC到约I X IO7个ADSC的范围内。在具体实施例中，将存于0.2mL盐水中的I X IO6个ADSC注射到泪腺周围区域中。在另一个具体实施例中，将存于0.2mL盐水中的I X IO6个ADSC注射到待治疗非人类哺乳动物的睑腺区域中。视需要根据治疗动物的兽医的决定重复注射。在具体实施例中，视需要根据治疗动物的兽医的决定每周重复注射，持续(例如)数周。在所述实施例的特定方面中，同样经静脉内投与有效量的ADSC。在某些实施例中，经静脉内投与ADSC的有效量是在约I X IO5个ADSC到约I X IO8个ADSCJS5 X ?ο5 个 ADSC 到约 5 X IO7AadscJ^] ιχιο6 个 adsc 到约 Ixio7Aadsc 的范围内。在所述实施例的其它方面中，根据动物大小来调整所投与ADSC和BMP的剂量。因此，在某些实施例中，所投与ADSC的有效量是在约I X IO5个ADSC/千克体重到约I X IO8个ADSC/千克体重、约5 X IO5个ADSC/千克体重到约5 X IO7个ADSC/千克体重、约I X IO6个ADSC/千克体重到约I X IO7个ADSC/千克体重的范围内。在其它特定实施例中，所治疗的动物是非人类哺乳动物且ADSC来自非人类哺乳动物。在具体实施例中，ADSC是猪ADSC。在一个具体实施例中，所治疗的非人类哺乳动物是猫，而在另一个具体实施例中，所治疗的非人类哺乳动物是狗。
[0139]G.ADSC在慢性肾衰竭治疗中的使用
[0140]慢性肾病的特性在于肾功能在经延长时期(例如，数月或数年)内逐渐损失，其通常通过血清肌酸酐水平的增加和/或尿中蛋白质水平的增加来识别。慢性肾衰竭的发展通常与受折磨非人类哺乳动物中糖尿病、高血压和肾小球性肾炎的存在相关。
[0141]本发明的ADSC用于治疗(例如改善)患有慢性肾衰竭的非人类哺乳动物中慢性肾衰竭的症状，其中所述治疗包含向受折磨的非人类哺乳动物静脉内投与有效量的ADSC。在某些实施例中，ADSC的有效量可在约I X IO5个ADSC到约lX108fADSCj^J 5 X IO5个ADSC到约5 X IO7个ADSC、约I X IO6个ADSC到约I X IO7个ADSC的范围内。在具体实施例中，向受折磨哺乳动物经静脉内递送IX IO6个ADSC/千克体重。视需要根据治疗动物的兽医的决定重复投与。在具体实施例中，视需要根据治疗动物的兽医的决定每周重复投与，持续(例如)数周。在某些实施例中，经静脉内投与的ADSC的有效量是在约I X IO5个ADSC到约 I X IO8 个 ADSC、约 5 X IO5 个 ADSC 到约 5 X IO7 个 ADSC、约 I X IO6 个 ADSC 到约 I X IO7个ADSC的范围内。在所述实施例的其它方面中，根据动物大小来调整所投与ADSC和BMP的剂量。因此，在某些实施例中，所投与ADSC的有效量是在约IX IO5个ADSC/千克体重到约I X IO8个ADSC/千克体重、约5 X IO5个ADSC/千克体重到约5 X IO7个ADSC/千克体重、约I X IO6个ADSC/千克体重到约I X IO7个ADSC/千克体重的范围内。在其它特定实施例中，所治疗的动物是非人类哺乳动物且ADSC来自非人类哺乳动物。在具体实施例中，ADSC是猪ADSC。在另一个具体实施例中，所治疗的非人类哺乳动物是猫，而在另一个具体实施例中，所治疗的非人类哺乳动物是狗。
[0142]H.ASDC在急性肾衰竭治疗中的用途
[0143]急性肾衰竭的特性在于肾功能相对快速的损失。急性肾衰竭有许多病因，包括由任一原因导致的低血容量、暴露于对肾有害的物质中和泌尿道阻塞。急性肾衰竭可通过(例如)以下来识别:血液中的尿素氮和肌酸酐水平升高，以及受折磨非人类哺乳动物的肾不能产生足量尿液。
[0144]本发明的ADSC用于治疗(例如改善)患有急性肾衰竭的非人类哺乳动物中急性肾衰竭的症状，其中所述治疗包含将有效量的ADSC注射到患有急性肾衰竭的非人类哺乳动物的每个肾的肾皮质中。在某些实施例中，ADSC的有效量可在约IXlO5个ADSC到约I X IO8 个 ADSC、约 5 X IO5 个 ADSC 到约 5 X IO7 个 ADSC、约 I X IO6 个 ADSC 到约 I X IO7 个ADSC的范围内。在一个具体实施例中，向受折磨哺乳动物递送I X IO6个ADSC/千克体重。在一个具体实施例中，将存于盐水中的IX IO6个ADSC注射到受折磨非人类哺乳动物的每个肾的肾皮质中。视需要根据治疗动物的兽医的决定重复投与。在一个具体实施例中，视需要根据治疗动物的兽医的决定每周重复投与，持续(例如)数周。在某些实施例中，所投与ADSC的有效量是在约I X IO5个ADSC到约I X IO8个ADSC、约5 X IO5个ADSC到约5 X IO7个ADSCJ^ IXlO6个ADSC到约I X IO7个ADSC的范围内。在所述实施例的其它方面中，根据动物大小来调整所投与ADSC和BMP的剂量。因此，在某些实施例中，所投与ADSC的有效量是在约I X IO5个ADSC/千克体重到约I X IO8个ADSC/千克体重、约5 X IO5个ADSC/千克体重到约5 X IO7个ADSC/千克体重、约I X IO6个ADSC/千克体重到约I X IO7个ADSC/千克体重的范围内。在其它特定实施例中，所治疗的动物是非人类哺乳动物且ADSC来自非人类哺乳动物。在一个具体实施例中，ADSC是猪ADSC。在另一个具体实施例中，所治疗的非人类哺乳动物是猫，而在另一个具体实施例中，所治疗的非人类哺乳动物是狗。在再一个具体实施例中，在投与水凝胶(例如(但不限于)基于壳聚糖的水凝胶)之前、之后或与其同时投与ADSC。在此实施例的一个方面中，将ADSC分布于水凝胶(例如(但不限于)基于壳聚糖的水凝胶)内。
[0145]实例
[0146]所述实例打算仅例示本发明且因而不应视为以任何方式限制本发明，其还阐述并详述上文所论述的本发明的各个方面。
[0147]实例I用脂肪组织衍生干细胞对犬尿失禁的实验性治疗
[0148]材料和方法
[0149]动物选择
[0150]选择具有明显Π症状的雌性狗用于此研究。这些症状包括滴尿、自主控制损失和/或尿液灼伤皮肤炎。为确保个体的UI症状是由尿道缺陷所致，其必须展示对PPA治疗的反应性。每一所有者也通过签署同意书来同意进入此实验性研究，所述同意书指示(I)狗将经受在后腿中测试注射ADSC以确保没有免疫反应，(2)对狗的PPA治疗将取消若干天(最多I周)以使得可再次出现UI症状，(3)狗在经受ADSC治疗前至少3天必须展示UI症状再次出现，和⑷如果所有者不愿在取消PPA之后和/或在ADSC治疗之后照顾狗，则狗可能需要住院，直到症状改良为止。
[0151]治疗前检查
[0152]在治疗之前，对所有狗进行身体检查、常规临床化学和血液学评估以及尿分析，以确保个体整体上健康且无原发性泌尿道感染。另外，将检查后腿中的测试注射部位以确保无炎症。
[0153]治疗程序
[0154]在此研究中，UI的治疗程序是将一百万到一千万个猪ADSC注射到尿道的括约肌区域中。利用允许可视化和注射二者的尿检查仪来完成精确注射。悬浮液的体积和细胞数随个体体重成比例地变化。例如,20kg狗每次注射将接受存于0.2ml PBS中的二百万个ADSC。通常,使用五百万个细胞/10千克体重。
[0155]治疗后评估
[0156]所有者将每天通过观察以下特性来实施评估:监测注射部位的反应体征，例如发红、疼痛和发热；监测动物的过敏性反应和尿道堵塞的体征；动物中任何其它不寻常体征，例如持续恶心、疲劳、嗜睡、食欲下降和排尿困难。
[0157]兽医在治疗后10天到15天、25天到30天和55天到60天实施评估。
[0158]实例2使用ADSC治疗骨关节炎
[0159]治疗程序
[0160]尽管OA实际上可折磨任一关节，但其最常与后肢膝关节和髋关节相关。将ADSC注射到所述关节中与注射皮质类固醇类似，只是使用细胞悬浮液而非类固醇。细胞悬浮液的体积和细胞数随个体的大小成比例地变化。作为实例，20kg狗的每个关节将接受存于0.5mlPBS中的五百万个ADSC。在治疗之后，劝告所有者每天牵绳遛狗30分钟。允许狗继续服用在ADSC治疗前所服用的任何口服药物。在ADSC治疗前的任何关节内治疗都应中断。
[0161]治疗后评估
[0162]动物评估将纳入病历、身体检查和跛足检查，所述跛足检查包括关节灵活性和操作时的疼痛记录。临床结果量度将基于动物矫形外科评估，所述评估使用基于标准化问卷的数值等级量表。将在狗通过关节内注射接受测试或对照制剂之前2天与14天之间记录所有者评估和动物评估二者的基线结果。将需要在狗的关节内注射后30天、60天和90天时到动物诊所进行跟踪访视。在每次访视时，将要求所有者完成作为从辛辛那提矫形外科失能指数改编的标准问卷的一部分的数字等级量表(1(最好)到5(最差))，其包括对以下参数的评估:行走、跑、跳、突然转向、从躺下起来、从站立躺下、爬阶梯、下阶梯、蹲下排尿或排便、早晨僵硬、晚上僵硬、在光滑地板上行走的难度和自主玩耍的意愿。
[0163] 实例3用ADSC治疗患有糖尿病的非人类哺乳动物
[0164]Pdxl是β细胞(产生胰岛素的细胞)发育中的关键调苄基因且PV-16是Pdxl的经改造形式(例如，参见唐(Tang)等人，实验室研究(Laboratory Investigation)86:829-841(2006)；曹(Cao)等人，糖尿病(Diabetes) 53:3168-3178 (2004);唐等人，实验室研究 86:83-93 (2006))。此实例阐述的结果显示，在用携带Pdx基因或PV-16的慢病毒转染之后，ADSC可转化成产生胰岛素的细胞。然后可将这些细胞注射到门静脉(如在岛细胞细胞移植中)以帮助糖尿病个体。此治疗需要约十亿个细胞。
[0165]用Lent1-Pdxl、Lent1-PV-16 或 Lent1-GFP (GFP,绿色突光蛋白)转染非人类ADSC，其中所述Lent1-GFP充当阴性对照。在转染后，在分化培养基中培养细胞。在21天后，经GFP转染的细胞的形态保持不变，而经Pdxl或PV-16转染的细胞的形态显著变化。另外，经Pdxl或PV-16转染的细胞似乎分泌粒状材料。通过RT-PCR来证实并测量转染细胞的PdxlmRNA表达。使用西方墨点来证实Pdxl蛋白质的表达。
[0166]还通过使用抗胰岛素抗体对细胞染色来分析转染细胞的胰岛素产生。
[0167]实例4使用再循环胶原酶分离ADSC的方法
[0168]用含有1%青霉素和链霉素的PBS冲洗从非人类哺乳动物分离的脂肪组织(即脂肪组织或抽脂脂肪)，将其切碎成小块，然后以5:lv/v的胶原酶溶液:脂肪比率与含有
0.075%胶原酶IA型的溶液(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州)混合。在37°C和剧烈振荡下培育I小时后，然后在室温下以220Xg将产物离心10分钟。形成三个层:上部脂质层、中间胶原酶层和底部细胞沉淀。收集中间层并藉助200 μ m过滤器过滤，接着进行离心。使用穿流中的再循环胶原酶IA型消化新鲜脂肪组织(也降低购买大量胶原酶的成本)，使用高于第一轮的比率(7:1，以体积计)。
[0169] 实例5用超氧化物歧化酶保存ADSC
[0170]此实例阐述新脂肪组织保存溶液(ATPS)，其含有从哺乳动物红细胞分离的超氧化物歧化酶以保存细胞活力。ATPS 是由 200mg/L KH2PO4、200mg/L KCl,2.16g/LNa2HP04 7H20、8g/L NaCl、30，000单位/L超氧化物歧化酶(SOD)和5g/L牛血清白蛋白(BSA)组成。
[0171]在4°C下使用ATPS将脂肪组织保存24hr和48hr。根据上文所述程序使用所保存的脂肪组织分离脂肪衍生干细胞。比较来自两个个体的得自ATPS所保存组织和刚采集的脂肪组织的脂肪衍生干细胞产率。与刚采集的脂肪组织相比，ADSC的产率在24小时为85%且在48小时为65%。此远高于不使用ATPS时获得的产率，如松本(Matsumoto)等人，整形与改造外科学.(2007) 120 (6): 1510-7所报道。
[0172]还测试ATPS对脂肪干细胞的保存。将IXlO6个非人类脂肪衍生干细胞与ImlATPS混合并存储在4°C下。在48小时后，执行细胞活力测试(锥虫蓝(trypan blue)方法)。结果指示，在用ATPS保存48小时后，少于5%的细胞受损。
[0173]实例6分离优选ADSC群的方法
[0174]特定细胞类型的有效且准确分离是许多研究项目的关键方面。使用抗体进行细胞分离并非新技术。“淘选”是用于从不同细胞类型的混合物富集特定细胞群的免疫选择方法，其已应用了很长时间。这种方法是基于与细胞培养皿结合的抗体的选择能力。将多种细胞类型的混合物在经抗体涂覆的板上培养并允许结合较短时期。然后可从培养皿轻轻地洗脱非附着细胞(所述不结合抗体者)，从而使得可采集已结合细胞。这种方法有助于研发其它新技术，例如密度梯度分离和利用特定细胞类型的独特表面结合性质的方法。磁珠技术的研发允许反复洗涤珠粒结合细胞，从而显著改良潜在分离纯度。各公司所用的顺磁珠粒的大小和组成显著不同且定期进行进一步精制/改良。
[0175]来源于脂肪组织消化的基质血管成份是由许多类型的细胞组成，例如干细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和其它终末分化细胞。磁细胞系统提供优良的磁珠粒标记细胞分选。
[0176]根据制造商的方案通过流式细胞术来分析刚分离的ADSC的细胞表面抗原的表达。将细胞与存于50 μ I洗涤缓冲液(含有1%FBS和0.l%Na3N的PBS)中的一级抗体(表I)在冰上一起培育30分钟，接着再与FITC偶联的二级抗体(山羊抗IgG) —起培育。然后用洗涤缓冲液将细胞冲洗两次，用存于PBS中的1%多聚甲醛固定，并通过荧光激活细胞分选机(FACS Vantage SE ;必帝(Becton Dickinson))来分析。利用FlowJo软件(树星(Tree Star)公司，阿什兰，俄勒冈州)分析结果。所分析细胞抗原为⑶13、⑶31、⑶34、⑶90、⑶105、⑶133、SSEA-1和端粒酶。表达水平呈现于表2中。
[0177]表1.此研究中所用抗体
[0178]
【权利要求】
1.一种脂肪组织衍生干细胞ADSC的用途，其用于制造用以治疗非人类哺乳动物的骨折的药剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述非人类哺乳动物选自由以下组成的群组:狗、猫、马、兔、猪、猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、狮、熊、猎豹和美洲驼。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述ADSC对于所述非人类哺乳动物来说是异种的。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药剂是用于提供在约1X1O5个ADSC/千克体重到约1 X1O8个ADSC/千克体重的范围内的ADSC。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述药剂是用于提供在约5X 1O6个ADSC/千克体重到约5 X 1O7个ADSC/千克体重的范围内的ADSC。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述药剂是用于提供在约1XlO6个ADSC/千克体重到约1 X1O7个ADSC/千克体重的范围内的ADSC。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述药剂是用于与骨形态发生蛋白一起投与。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述药剂是用于在所述骨折部位投与。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述药剂是以静脉内投与的方式投与ADSC。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述静脉内投与的ADSC是在约1X 1O5个ADSC/千克体重到约1 X 1O8个ADSC/千克体重的范围内。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述静脉内投与的ADSC是在约5X1O6个ADSC/千克体重到约5 X1O7个ADSC/千克体重的范围内。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述静脉内投与的ADSC是在约1X1O6个ADSC/千克体重到约1 X1O7个ADSC/千克体重的范围内。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述ADSC是猪ADSC。
14.一种脂肪组织衍生干细胞ADSC的用途，其用于制造用以治疗非人类哺乳动物的选自由以下组成的群组的病状的药剂:“干眼”病状、慢性肾衰竭、急性肾衰竭和其组合。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述非人类哺乳动物选自由以下组成的群组:狗、猫、马、兔、猪、猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、狮、熊、猎豹和美洲马它。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述ADSC对于所述非人类哺乳动物来说是异种的。
17.根据权利要求14所述的用途，其中所述药剂是用于提供在约1X1O5个ADSC/千克体重到约1 X 1O8个ADSC/千克体重的范围内的ADSC。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述药剂是用于提供在约5X 1O6个ADSC/千克体重到约5 X 1O7个ADSC/千克体重的范围内的ADSC。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述药剂是用于提供在约1XlO6个ADSC/千克体重到约1X 1O7个ADSC/千克体重的范围内的ADSC。
20.根据权利要求14所述的用途，其中所述药剂是用于静脉内投与。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述药剂是用于提供在约1XlO5个ADSC/千克体重到约1 X1O8个ADSC/千克体重的范围内的ADSC。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述药剂是用于提供在约5X1O6个ADSC/千克体重到约5 X 1O7个ADSC/千克体重的范围内的ADSC。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述药剂是用于提供在约IXlO6个ADSC/千克体重到约1 X1O7个ADSC/千克体重的范围内的ADSC。
24.根据权利要求14所述的用途，其中所述ADSC是猪ADSC。
25.根据权利要求14所述的用途，其中所述病状为“干眼”病状。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述药剂是用于投与到所述非人类哺乳动物的泪腺周围区域(perilacrimal area)中。
27.根据权利要求14所述的用途，其中所述病状为慢性肾衰竭。
28.根据权利要求14所述的用途，其中所述病状为急性肾衰竭。
【文档编号】A61P19/08GK103830275SQ201310239434
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年6月17日 优先权日:2012年11月21日
【发明者】林庆顺, 吕福泰, 林桂廷 申请人:瑟弗维股份有限公司