临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法，本发明属于生物干细胞医学医药领域，特别公开发明了从人类脂肪来源获取的间充质干细胞ADSCs体外分离及规模化培养扩增及保存的方法。通过高拟体外细胞外基质附着锁定目标脂肪间充质干细胞，以及贴附培养，利用优选的培养基组合，梯度仿体内生态环境无血清驯化培养体系获得临床治疗级别的脂肪间充质干细胞的方法。本发明获得干细胞符合国际细胞协会(ISCT)标准具有高纯度、干细胞增殖扩增、传代活性强、以及冻存保护细胞活性技术，该技术应用是干细胞治疗领域核心基础，满足了干细胞临床药物设计开发与医疗机构开展干细胞疗法回输安全有效应用的需求。
【专利说明】
临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养 方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物干细胞技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内贴附 环境分离筛选，脂肪干细胞的培养、扩增技术。本发明属于生物干细胞医学医药领域，特别 公开发明了从人类脂肪来源获取的间充质干细胞ADSCs体外分离及规模化培养扩增及保存 的方法。通过高拟体外细胞外基质附着锁定目标脂肪间充质干细胞，以及贴附培养，利用优 选的培养基组合，梯度无血清驯化培养体系获得临床治疗级别的脂肪间充质干细胞的方 法。获得干细胞符合国际细胞协会（ISCT)标准具有高纯度、干细胞增殖扩增、传代活性强、 以及冻存保护细胞活性技术，该技术应用是干细胞治疗领域核心基础，满足了干细胞临床 药物设计开发与医疗机构开展干细胞疗法回输安全有效应用的需求。
【背景技术】
[0002] 到目前为止，间充质干细胞是成人干细胞具有多向分化潜能的热点细胞，是一种 大多数成人器官中发现的具有骨形成能力和造血功能的细胞群体，可以从骨髓、脐血、脂肪 中提取，在特定的培养条件下，间充质干细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和 肌细胞等。
[0003] 间充质干细胞是目前组织工程的主要种子细胞。经历了多年多学者的研究后，虽 然组织工程已经获得了很大进展，然而，但由于目前缺乏理想筛选方法，间充质干细胞不易 获取、体外扩增困难等限制，使其在临床级别回输的应用受到限制。因此，寻找一种易于获 得、免疫原性低、易于体外扩增的临床治疗级别的种子细胞是目前组织工程迫切需要解决 的问题之一。
[0004] Zuk等从脂肪组织分离出一类具有多向分化潜能的干细胞，并在体外培养特殊体 系中成功地分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞与肌细胞等，这种可分化的干细胞被认可 为脂肪来源的间充质细胞，即脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来 从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，脂肪干细胞具有分化多胚层全 能性特征，其中包括中胚层，内胚层和外胚层分化细胞的能力，能分泌许多潜在的有利的生 长因子和细胞活素以细胞为基础的促进创面愈合的治疗方法快速发展。脂肪源性干细胞是 一群多功能间充质干细胞，可以分化为其他的细胞系在脂肪组织的非脂肪（间质)碎片中存 在大量的脂肪源性细胞，且易于分离获取。
[0005] 作为各种组织缺损的辅助治疗方法，脂肪源性干细胞被推荐应用。在创面愈合过 程中，血管再生是一个重要的步骤新生血管的形成是支持肉芽组织形成和角化细胞存活扩 增愈合创伤的的必要条件。因此认为，脂肪源性干细胞是通过快速促血管再生从而促进创 面的愈合。另外，脂肪源性干细胞还显示出通过细胞分化以及分泌促进胶原合成和真皮成 纤维细胞迀移的长因子来促进创面的愈合
[0006] LiuS等人将脂肪源性干细胞与细胞外基质支架成分联合应用于动物的皮肤软组 织创面，发现脂肪源性干细胞以促进支架的血管化能力。NieC等人的结果提示脂肪源性细 胞对创面愈合的促进作用与脂肪源性干细胞促进上皮化和肉芽组织的形成有关，并且脂肪 源性干细胞有潜在的表皮细胞分化能力研究结果还提示脂肪源性干细胞的远位分化能力 是多功能脂肪干细胞对创面的微环境的一个反应。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括 直接分化为血管内皮细胞和分泌血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。即是说，脂肪 源性干细胞通过细胞分化和血管再生促进创面的愈合。等人将脂肪源性干细胞与血小板源 性生长因子，即一种众所周知的参与正常创面愈合过程的因子，联合用于创面的治疗。研究 结果显示二者的联合应用有协同作用，即可能通过提高生长因子的水平而促进了创面的愈 合。
[0007] 理论上讲，细胞疗法前景广阔，因为多功能干细胞或祖细胞通过对创面缺失组织 的再生和持续提供许多有利因子而促进创面的愈合。尽管如此，关于脂肪源性干细胞对创 面愈合的机制的研究仍有待于进一步探索。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分 化为血管内皮细胞和分泌生血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。
[0008] ADSCs的应用前景在各疾病动物模型上的应用上用来干预治疗糖尿病、肝脏损伤 修复、膀肌重建、2型糖尿病阳疹、心肌梗死、脑梗、认知功能障碍、中风、椎间盘修复、胶质母 细胞瘤治疗、骨缺损、创伤后血管新生、风湿性关节炎、唇愕裂、心力衰竭、结肠炎?尿失禁 等。西班牙学者Peran等首次将ADSCs转变为心肌细胞，既重新编程了成熟的干细胞，又能改 善心脏病的治疗。也有学者将ADSCs与纤维蛋白胶复合后注射到心肌梗塞大鼠的左心室壁 上，ADSCs在临床组织工程治疗心肌梗塞上会有很大的前景。ADSCs作为种子细胞放于网状 支架中，成功地修复了狗的颅骨损伤，为临床治疗颅骨损伤。荷兰埃拉斯莫斯大学的杜克斯 博士的科研小组应用心脏病人腹部脂肪的ADSCs注射进他们的心脏以后，减少了心脏的损 伤、同时也增加了血流，干细胞注射进心脏以后经过6个月，病人心脏接受带氧血液的能力 提高，心脏左心室送出的血液也增加了3.5倍，SPELT显像证明接受ADSCs注射的病人心栗的 能力增加了 5.7%，核磁扫描也显示患者的平均心肌疤痕面积由原来的31.6%下降到 15.4%，这一研究成果发布在2010年美国心脏协会科学年会上。ADSCs在组织修复过程中可 以调节周围组织中的生长激素和细胞因子等防治细胞凋亡，Kim等试验证明ADSCs可以分泌 各种皮肤生长因子如纤维细胞生长因子（（Basic fibroblastgrowth factor，bFGF)等来促 进成纤维细胞繁殖，并具有抗光老化、抗氧化、抗皱、抗紫外福射等作用。Garcia-Olmo等研 究小组用ADSCs来治疗病人复杂性肛屡已经进入到II期临床实验。Yoshimura等用人的 ADSCs移植入15名乳房萎缩、大小不一或需要隆胸的患者乳房中，左右乳房大小均衡对称， 乳房X光检测，被修复的乳房自然柔软完全无钙化，无囊肿现象，无明显的注射疤痕。最近的 临床研究显示，肌内注射ADSCs对糖尿病足和闭塞性动脉硬化症也有一定的疗效。在注射 ADSCs的6个月后，从临床上看，患者的静息疼痛得到了缓解，无痛行走的距离明显延长，而 且并未发现任何并发症。Vanikar等试验ADSCs诱导成胰岛样细胞回输糖尿病患者，术后随 访23个月，发现患者的外源性胰岛素用量下降，患者的平均体重增加了而且患者无不适或 副反应。
[0009] 有学者研究发现脂肪组织参与创伤修复，当脂肪细胞受到创伤刺激后，基因表达 发生应激性分泌TNF-a、IL-1、IL-6、细胞间粘附因子、趋化因子，急性反映蛋白，受体等炎症 基质的基因表达都会增加，这些因子调控都是我们了解脂肪细胞参与修复的内在治疗机 制，这种调节体系是值得我们思考的精密调控。获得的科研成果是丰富创伤修复的理论基 础。临床应用伤及真皮下组织脂肪层的深度皮损创伤，脂肪回输治疗均可以达到加速创面 修复的理想治疗效果，国外研究学者也应用脂肪细胞，胶原蛋白与弹性蛋白应用组织工程 技术制备含有脂肪细胞的人工皮肤，临床应用发现可减少全层皮肤缺损的组织修复造成的 创面收缩，这一现象提示我们脂肪组织中存在具有修复作用的因子与细胞。
[0010] 前脂肪细胞分化特征是细胞形态的改变-从成纤维细胞样变成圆形，和与脂肪代 谢相关的基因诱导表达。这种形态转变与纤维链接蛋白、层黏连蛋白、胶原、白肌动蛋白、微 管蛋白、蛋白聚糖、细胞外骨架越来越多的学者关注其质与量环境改变密切相关，这种环境 也就是细胞外基质（extracellular matrix，ECM)广泛存在于细胞间隙的基本填充成分，是 细胞新陈代谢、生长、繁殖、分化、表达、传递、互惠所依赖的及其重要场所。早期研究学者认 为.外基质只是一种组织内、细胞外的单纯的支持结构。Hauschka和Konigsberg在1966年研 究发现填充组织间隙的胶原与促进成肌细胞转化肌管的现象。并在两年之后，得以证明学 者们才对这种稳定外物质微环境有了新的认识和思考。
[0011] Hay在11年后报道了 ECM对胚胎发育过程具有重要的诱导作用。ECM影响细胞行为 的现象得以关注并进行广泛的研究但是并没有成型的理论基础，并佐证ECM与细胞的密切 关系。直到1982年有学者提出证明并建立ECM与细胞骨架和核基质之间"动态互惠"的模型。 在这个模型中，ECM分子与细胞表面受体互相作用，然后把信号通过细胞膜传导进入细胞浆 中，引起从细胞骨架到细胞核的一系列变化，引起某些特定基因的表达。
[0012] 并证明这些基因的表达产物又可以逆向来对ECM发生作用，近几年许多研究证实 了这个模型的合理性，并且证明细胞和ECM相互作用直接参与了细胞的黏附、生长、游走、分 化和程序性老化死亡(凋亡）的过程;外基质参与调节细胞因子、生长因子的活性;还能够直 接激活、启动细胞内信号传导机制。由于这种对细胞的调节和对信号的传导作用。因此，启 迪研究者们必须充分了解细胞外基质的化学的、物理的、生物学性质和功能及其在组织的 形成和修复中的作用，才能更好地应用这些生物材料构建成为组织接受，乃至模拟组织完 善再生的"生物构架"。我们建立的高拟细胞外基质材料利用的恰是反向理论，指导我们深 入开展对ECM的认识，同时也反作用得到我们可利用的干细胞，这种研究模式促进学科前行 及发展。
[0013] 综上所述，脂肪干细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，体外筛选培养的人脂肪 来源的间充质干细胞得以在国内外方法特异性发展。而干细胞生物学性能，可以做到增进 功能、避免潜在有害基因及对干细胞控制分化时间与控制不同分化方向等，在基础科研、临 床治疗、干细胞治疗研究方向、皮肤再生损伤修复、高拟组织工程皮肤的构建方面等均有历 史时期不可取代的指导意义。
[0014] 三、组织工程皮肤背景介绍
[0015] 再生组织工程细胞建立系工作始于本世纪(Harrison 1907，Carrel 1912)，指导 引领着生物学，临床医学材料等各大衔接领域，称为重要的基础科学之一。组织构建和细胞 体外培养是至关重要的课题。从供体捐献者活体取组织，模拟体内生理环境等系列特定体 外微环境体系，进行孵化培养、使得组织细胞健康生长。
[0016] 组织工程皮肤建立早期应用于修复烧伤和溃疡以及其它皮肤损伤领域，麻省总医 院的John F.Burke与MIT的Yannas I.V.合作，制备首次人工皮肤替代物。但是这种组织皮 肤替代物并不与细胞生物学相关，隶属于组织工程皮肤支架材料学范畴。随着细胞生物学 的基础学科发展，人们开始整合两大学科，共同协作解决创伤皮肤修复构建，真正的含活性 细胞组织工程皮肤在哈福大学Honward Green与MIT的Eugenen Bellhe合作完成。早期定制 皮肤移植救治取得了生物学医学界瞩目关注。
[0017] 20世纪80年代初期支架材料被roA许可上市，由胶原网格组成的复合皮肤移植材 料被创造出来，内层为牛胶原和硫酸软骨素构成，外层为硅胶树脂，创面移植后内层与创面 接触被缓慢降解，数周后硅树脂层移除，清创后覆盖自体移植皮肤，覆盖物被临床所接受。
[0018] MIT的科学家Bellhe把材料学和生物学完美结合创造了组织工程皮肤并建立了世 界上第一家组织工程再生公司（Organogenesis Inc)，是科学界商人的典范。这家活性组织 工程皮肤先驱引领公司仍然是在人工皮肤市场占有率最高的组织工程公司之一。
[0019] 1997年通过美国FDA批准上市的第一个组织工程产品由Advanced Bionhealing公 司生产的TransCyte。用于烧伤创面修复治疗。该产品属于胶原支架材料种植灭活性的纤维 细胞，成为商业化的第一个"异体无活性细胞组织工程真皮疗法"。Dermagraf t和Integra以 及Organogenesis Inc制造的Apligraf也获得FDA批准，利用新生儿包皮经生物学体外培养 活性细胞，制备的组织工程皮肤，用于溃疡皮肤和大面积烧伤再生治疗。该产品是严格按照 以上具有类皮肤组织工程人工皮肤，含活性4~8传代细胞种植，是具有完整表皮真皮细胞 构建在组织工程支架上的可降解全层人工皮肤。并且部分剔除减少朗格汉斯细胞，降低了 受体的免疫排斥反应，无活性的死亡细胞经过创面组织液及相关体液因子代谢的作用被分 解可用于创面修复的小分子片段基础营养愈合物质被创面吸收利用。这种产品制成后置 于一 70°C保存，37°C迅速复苏，复苏后有50%的活性细胞具有活性，活性维持5天通过快递 邮寄到指定的医疗部门。这些产品的市场准入引领了崭新的再生医学组织工程皮肤时代。
[0020] 基于国内国际组织工程人工皮肤现状，建立组织工程脂肪干细胞一高拟体内细胞 外基质，基质附着体外筛选方法设计首例含有临床治疗级脂肪干细胞组织工程人工皮肤产 业化产品。
[0021] 获得脂肪来源的间充质干细胞还可以应用临床相关疾病细胞治疗的回输治疗，以 及美容整形注射用填充。
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【发明内容】
[0048] 一、高拟体内细胞外基质种类：
[0049] 1.1其特征在于:针对本发明技术的发展现状，本发明的目的是提供一种高拟体内 真皮层作为细胞外基质为筛选贴附，成体脂肪干细胞筛选分离和体外培养的方法，并使获 得的高纯度脂肪干细胞。
[0050] 1.2其特征在于:针对本发明技术的发展现状，本发明的目的是提供一种高拟体内 全层皮肤并包括皮下组织层(皮下脂肪组织层)作为为细胞外基质为筛选贴附，成体或皮肤 脂肪来源的间充质干细胞筛选分离和体外培养的方法，并使获得高纯度脂肪干细胞。
[0051] 发明属生物成体(胎儿)干细胞细胞技术领域，方法特征包括：同体真皮脱细胞真 皮底物预备;同体脂肪干细胞的分离;利用高拟体内附着基质脂肪干细胞的筛选及培养。
[0052] 同体全层皮肤及皮下组织层脱细胞底物预备；同体脂肪干细胞的分离;利用高拟 体内附着基质脂肪干细胞的筛选及培养。
[0053]目前用该法在体外已稳定培养传代超过25(代），经检测发现扩增25代前的脂肪干 细胞仍具有正常的染色体组型，无异常改变.经体内外实验证实该细胞无细胞毒，具有强的 增殖能力，并可以形成分化，脂肪干细胞在科研、教学及临床的应用起到不可估量的作用， 同时孕育着巨大学术方向与社会效益和经济效益。通过此种方法的理论基础推进我国脂肪 干细胞的学术基础建立。
[0054]二、高拟体内细胞基质外构成：
[0055] 经分析含有多种胶原并包含IV型、其中I型胶原含量最大（I与m型胶原的比例为 10:1)，同时还保留了完整的基底膜结构(包括表皮层、真皮层、皮下组织层）。
[0056] 三、高拟体内细胞外基质底物孔隙率与黏附表面特征：
[0057]高拟底物电镜观察，测定表皮黏附的底物组织再生的基底膜孔隙直径为32~145y m，促进黏附真皮组织再生底物基底膜多孔孔隙直径为72~191wii。促进黏附皮下组织层再 生底物基底膜多孔孔隙直径为25~400wii。这种孔隙率所构建的空间黏附表面均有有利于 干细胞黏附附着生长、增殖、分化。
[0058] 通过以上制备方法，有效的保留了细胞外基质的微观构架和完整的基底膜结构， 其主要成分包括各型胶原、弹性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基质成分，可为脂肪干 细胞快速粘附、增殖扩展提供有力的支持。因此，高拟底物是目前最理想的细胞筛选的解决 方案。
[0059] 四、细胞高拟体内细胞外基质制备具体实施步骤与方法：
[0060] 一、包括以下两个步骤种方法：
[0061]步骤一 ：1.1皮肤消毒处理过程:取供体皮肤包括以下（胚胎皮肤、成体包皮外板、 头皮、腋下皮肤、及躯干皮肤含皮下组织层均可)剥离含表皮层与皮下组织层结构、保留真 皮层、剪切成组织块浸泡在生理盐水稀释含〇 . 05~0.1 %苯扎溴铵溶液中10~15min，消毒 处理，用无菌生理盐水反复冲洗残余苯扎溴铵。
[0062] 1.2皮肤消毒处理过程:取供体皮肤包括以下（胚胎皮肤、成体包皮外板、头皮、腋 下皮肤、及躯干皮肤含皮下组织层均可)含表皮层、真皮层、皮下组织层结构的器官组织，剪 切成组织块浸泡在生理盐水稀释含0.05~0.1 %苯扎溴铵溶液中10~15min，消毒处理，用 无菌生理盐水反复冲洗残余苯扎溴铵。
[0063] 步骤二：低温一30~一 100°C冷冻干燥，真空度达到10~130pa，脱去组织块90~ 95%以上水分，取出密封与真空包装，经辐照15~80KGY剂量灭菌。终品可以长期保存。启动 只需浸泡37°C，PBS液或下面所述营养液复苏15~30min即可应用，浸泡延长至10~12h效果 更佳。使用后并且应用去细胞漂洗液(见下方法中相应提及适合的脱细胞液)脱细胞处理、 再经过上述过程永生反复使用的特点。
[0064] 1:步骤二【具体实施方式】：
[0066]上述所提及的脱细胞液制备如下所述：
[0067]二、方法：
[0068] 实例方法1:组织器官经处理后加入0.1~0.5%蛋白酶冰浴冷消48~12h。
[0069]用含0.25 %戊二醛磷酸缓冲溶液调节PH在7.20~7.40之间用交联液冲洗组织块3 ~6次，最后放入交联液中交联4~6h，结束后用超纯水(或注射用水)反复冲洗8~10次去除 残留戊二醛，即可进行冷冻干燥脱水封装。
[0070] 1.1:实例方法1【具体实施方式】：
[0072] 方法一特点：交联剂可有效的使结缔组织蛋白不可溶性交联构架，增强底物的抗 降解性，保持底物完整，蛋白酶处理底物可使其柔韧性增强。
[0073] 皮肤表皮层内含四层结构，各层细胞量为10~30%，其中生发层称为基底细胞层 是细胞最为活跃的附着分裂分化场所，有9~15层之多；颗粒层结构含有大量间隙层状物， 角化层多呈网状编织状，立体复杂的三维空间互穿行结构，真皮层空间架构，与皮下组织层 空间架构，体外支架材料很难模拟模仿。故此类底物基质是最适合细胞粘附增殖生长分化 所需的理想微环境场所。
[0074] 实例方法2:酶一非离子表面活性剂一络合剂联合法
[0075] 0.1~0.25%018?&86中性蛋白酶与0.01~0.02%￡0了厶联合消化，中性蛋白酶作用 于基底膜，选择性地分解纤维连接素与IV型胶原(4°C下作用48h)，然后应用非离子型表面 活性剂使细胞溶解破坏TritonX -100(聚乙二醇辛基苯基醚）（0.1~0.8%溶液，室温下作 用48~24h)与生物膜中的磷脂等脂质结合形成复合物溶解于溶液中，同时TritonX -100中 的亲油基端也能和细胞外膜蛋白结合破坏生物膜，从而达到脱弃细胞作用。
[0076] 消化后可选择性剥离表皮真皮皮下组织层器官，经方法1进行戊二醛交联步骤，即 可进行冷冻干燥脱水封装。
[0077] 2.1:实例方法2【具体实施方式】：
[0080]实例方法3:络合剂加盐-阴离子表面活性剂法
[0081 ] 利用高渗氯化钠溶液（（0.01~0.02% EDTA含0.1~lmo 1/L氯化钠溶液，37 °C下作 用24~12h))使锚状细丝与表皮基底细胞的半桥粒分离开来，从而完整去除细胞，再用破膜 剂十二烷基磺酸钠(0.1~〇.8%SDS溶液，室温下作用60~30min)将细胞成分从组织中去 除。
[0082]以上步骤可选择性剥离表皮层、真皮层、皮下组织层，保留全层经方法1进行戊二 醛交联步骤，即可进行冷冻干燥脱水封装。
[0083] 3.1:实例方法3【具体实施方式】：
[0085] 实例方法4:用0 ? 1~0 ? 6 %胰蛋白酶和0 ? 01~0 ? 1 % EDTA体积比（1: 2)混合液联合 消化组织块，37°C，快速消化60~lOmin，反复漂洗脱细胞，最后放入交联液中交联4~6h，结 束后用超纯水(或注射用水)反复冲洗8~10次去除残留戊二醛，即可进行冷冻干燥脱水封 装。
[0086] 4.1:实例方法4【具体实施方式】：
[0089] 以上方法均可组合制备出高拟体内细胞外基质所述：1.1、1.2、进行筛选脂肪干细 胞。
[0090] 上述方法制得略有差异，时间上成本上有异、但均可有效使得细胞成分被清除，基 质的结构完整性被保留，含有弹力素、硫酸角质素、层粘素、IV型胶原、纤维连接素、结合素、 HLA-DR的含量较多，基底膜结构成分均可以完整保留。
[0091] 对于附着性的种子脂肪干细胞提供了有利微环境，使其表达、生长、增殖、分化等 起到极其重要的作用，常规筛选方法不可替代高模拟附着状态三维空间架构，我们称之为 "细胞种植黑土壤环境"。
[0092]高拟体内细胞外基质筛选脂肪干细胞培养法 [0093]五、脂肪取材筛选：
[0094]脂肪干细胞的分离常规麻醉，将皮肤切口，用器械分裂皮下脂肪组织，生理盐水与 肾上腺素处理，降低出血量防止血细胞夹带污染，开展实施吸脂手术，获取吸出的脂肪(分 别取其脂肪组织约30g)用无菌(青霉素80~100u/ml和80~100μg/ml链霉素)PBS充分浸泡3 ~5min以PBS冲洗3次，尽量剔除筋膜血管及夹带的血细胞以及麻醉药，眼科剪将组织剪成 1.0~2.0_ 3组织块，并将其剪成碎成糊状。此步骤获得下一筛选培养所需的脂肪糊状组织 块。
[0095]脂肪取材筛选步骤中的脂肪糊状组织块 [0096]六、脂肪干细胞筛选培养步骤
[0097] 因为脂肪干细胞对基底膜有较强的粘附性，对细胞外基质的粘附速度要比其它类 型细胞快得多，贴壁生长习性所以利用该种特性进行培养筛选。
[0098] 七、脂肪干细胞筛选培养权利要求方法：
[0099] 1、培养液制备：
[0100] 配制培养液A:胎盘多肽注射液0.03ml/L、EGF5~25ng/ml、干细胞生长因子(SCF)2 ~llng/ml、转铁蛋白5~15μg/ml、谷氨酰胺1 ? 5mmol/L、维生素B4 0? 5~lmg/L、维生素Cl~ 4μg/ml、胰岛素5~8μg/ml、青霉素50~100u/ml、链霉素100u/m L、氢化可的松0.4μg/ml、商 用培养基-低糖DMEM/F12( 3:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4。
[0101 ] A. 1:配制培养液A【具体实施方式】
[0103]配制培养液B:胎盘多肽注射液0.2ml/L、人血清白蛋白（HSA)l~3g/L、
[0104]人血纤粘蛋白（FN) 1~4yg/L、人层粘连蛋白（LN)5~8yg/L、血小板衍生因
[0105] 子(PDGF)l ~10mg/L、EGF5 ~10ng/ml、干细胞生长因子（SCF)l ~3ng/ml、维生
[0106] 素B5~8mg/L、叶酸 1 ~10ng/ml、维生素E 0.05~lmg/L、维生素B4 0.5~lmg/L、
[0107] 黄体酬0? 01~0? (Myg/L、辅酶Q10 0? 1~2mM/L、胆固醇1~10mg/L、牛横
[0108] 酸0 ? 1~0 ? 4g/L、胰岛素5~6μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用
[0109] 培养基低糖DMEM与商用培养基F12( 1:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4。
[0110] B.1:配制培养液B【具体实施方式】
[0112] 配制培养液C:胎盘多肽注射液0.02~0.8ml/L、人血清白蛋白（HSA)3~6g/L、人血 纤粘蛋白（FN)5~15yg/L、人层粘连蛋白（LN)10~80yg/L、重组人胰岛素样生长因子-1 (IGF-l)l ~4mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)6 ~1111^/146?士?6?10~151^/1111、干细胞生长 因子（SCF)5~10ng/ml、维生素B25~8mg/L、叶酸1~8ng/ml、黄体酮0.01~0.06yg/L、维生 素E 0.05~1.25mg/L、维生素C 2~llmg/L、维生素B4 0.5~lmg/L、辅酶Q10 0.1 ~2mM/L、 胆固醇1~18mg/L、牛磺酸0 ? 1~0.6g/L、还原性谷胱甘肽2~5yg/L、油酸0 ? 5~7 ? 5mg/L、谷 氨酰胺〇. 5~2.5mmol/L、转铁蛋白6~20μg/ml、胰岛素5~7μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素 10011/11^、商用培养基低糖01^与商用培养基？12(1 :1)定容到5001111。？田空制在7.2~7.4。
[0113] C.1:配制培养液C【具体实施方式】
[0115] 说明：临床细胞治疗回输阶段细胞扩增。相应进行递减性驯化培养相应降低或剔 除以上所述配方中的有药理药效作用的添加物质。
[0116] 2、消化液配制法：
[0117] 消化液配制A:消化液配制A:含溶质0.1%中性蛋白酶和0.01%EDTA(体积比1:1)， 无Ca 2+、Mg2+、无菌PBS为溶剂，配制溶液。
[0118] 消化液配制B:含溶质0.2 %胰酶和0.075 % II型胶原酶(体积比1:1)，无胎盘多肽 注射液培养液A为溶剂，配制溶液。
[0119] 消化液配制C:含溶质0.15 %中性蛋白酶和0.2 % I型胶原酶(体积比1:1 )，无胎盘 多肽注射液培养液A为溶剂，配制溶液。
[0120] 3、筛选脂肪干细胞冻融保存液制备：
[0121] 抗冻溶质组分包括：维生素B4 1~10μg/ml，维生素C 1~4μg/ml，聚乙二醇4ml、 (优选自体血清)人AB血清10~15 %、甘油20 %、甘露醇3ml、细胞松弛素2.7μg/ml、二甲基亚 砜(DMS0) 10%、硫酸软骨素3~6%，保存液以配制培养液ABC为溶剂制备抗冻溶液。PH控制 在7.3~7.4，0.22mi微孔滤过除菌。
[0122] 3.1:3筛选细胞冻融保存液制备【具体实施方式】：
[0124] 说明，其特征在于:该冷冻液可以通过冷冻长期保存脂肪干细胞活性
[0125] 5、脂肪干细胞筛选步骤方法：
[0126] 步骤1、取脂肪取材筛选步骤中的脂肪糊状组织块，用无菌(青霉素80~lOOu/ml和 80~100μg/ml链霉素）PBS充分浸泡3~5min，以PBS冲洗3次，以消化液A常温消化10~ 15min，组织块悬液离心(900r/min离心5~lOmin)，弃去消化液A，收集组织块与细胞沉淀， 在以消化液B或C(37°C，振荡120r/min条件下消化30min-60min)，用数倍含10%自体血清或 人AB血清培养液A洗涤终止消化，，1200g离心10min去除上清及悬浮的残存组织夜，后用培 养液A重悬细胞沉淀，然后室温下用6倍体积的（NH4CI 154mmol/L+KHC03 10mmol/L+EDTA 0.1mmol/L)红细胞裂解液孵育6~10min，1200g/min离心6min弃掉上清液(杂细胞悬浮的残 存组织及红细胞），获得高浓度脂肪组织细胞团，用适量的无菌含抗PBS液清洗3次，过直径 200wii的钢制筛网除去未完全消化的组织。再用适量培养液A重悬细胞，细胞计数以细胞密 度，4X10 4/ml〇
[0127] 步骤2、取高拟体内细胞外基质选1.2、也可选1.1，用含抗生素的PBS冲洗3次，再用 配制培养液A冲洗3次，于37°C，浸泡在培养液A中复苏10~12h备用。
[0128] 步骤3、脂肪干细胞的筛选及培养:取预备好的1.2放入100mm平皿加入配制培养液 B，加入细胞浓度4X 104/ml脂肪干细胞悬液，37°C，气相5%C02培养箱培养10~72h取出，取 出转移1.2，PBS或培养液B清洗3~6次，目标脂肪干细胞贴壁粘附于1.2上。换皿加入配制培 养液C培养，隔10~72h后更换全部培养基C，此后每2~3d换液一次继续扩增培养。
[0129] 步骤4、消化富集传代培养:上述脂肪干细胞经扩增后，当脂肪干细胞生长至80 % ~90 %融合时，加入消化液配制BSC消化1.2，37°C消化15~30min，用数倍含10%自体血清 或人AB血清培养液B终止消化;稍加吹打，过滤收集细胞悬液转移到离心管，600~1200r/ min离心4~6min，弃上清液，加入配制的培养液C，重悬细胞，以1~3 X 106/ml的密度转移传 代按照上述步骤培养，置37°C、气相5% C02培养箱培养，每2~3d换配制培养液C一次继续扩 增培养。
[0130] 6、脂肪干细胞生物学特性及免疫组织化学法检：
[0131] ADSCs细胞形态:倒置显微镜观察的细胞形态。接种高拟体内细胞外基质6~24h后 细胞多已贴壁，换液除去未贴壁细胞。培养2~3d后贴壁细胞开始分裂增殖，均呈长梭形或 多角形外观。7d后细胞融合单层达80%铺满这时进行消化传代。
[0132] 免疫组织化学表型:选取3代细胞应用流式细胞术检测研究发现ADSCs均阳性表达 CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49d、CD73、CD90、CD 105、CD166、和 HLA-ABC，并且阳性率均高达 96.1~97.6%以上。CD29是识别整合素亚单位的蛋白，广泛存在于除了红细胞外的各种组 织及细胞中。CD44是目前所发现的成体干细胞最广泛表达的分布在胞膜和胞浆标志物，该 阳性表达进一步证明干细胞的身份。CD90和⑶105为间充质干细胞的特异性表型。且均能够 高表达阳性印证所获取的脂肪干细胞具有较强的贴壁能力，细胞活性好。阴性表达⑶34、 〇)45、〇)19、〇)14、〇)31、〇)621、〇)951和111^-01?。〇)34和〇)45是造血细胞系分子标志物，说明 获得的干细胞具有成脂及成骨分化潜能。
[0133] 细胞活性均>98 %;
[0134] 干细胞生长曲线：3代人脂肪间充质干细胞的潜伏期一般为3d;第4~5d开始细胞 增殖明显加快，呈对数样增殖进入对数生长期，该期持续至5~6d;第9d左右细胞增殖速度 趋于平缓进入生长平台期。
[0135] 说明：鉴定以及本发明的培养体系结果表明本分离培养所获得的细胞为人脂肪干 细胞，细胞纯度较高。在提升目标脂肪干细胞纯度，可重复进行脂肪干细胞具体实施方法3 步骤获得更高纯度的脂肪干细胞。同时也可以选取1.1高拟体内细胞外基质，进行筛选。
[0136] 八、本发明的具有以下优点：
[0137] 最常规的一种培养脂肪干细胞的培养基就是添加有动物血清的培养基。然而，采 用这种培养基培养的脂肪干细胞，不仅因添加量问题出现生长过快或比较缓慢现象，超过 几代之后其分化成功能细胞的潜能大大降低，动物血清培养技术综合增殖能力、免疫调节 能力、分泌细胞因子的能力这三方面均会受到不可控方向变化。国外不同地域厂商来源的 动物源血清批次存在潜在的不重复性，也是影响了其细胞扩增规模化生产的技术瓶颈；另 一方面，相对于人是异源性，异种蛋白混入潜在细胞治疗不确定性，从而限制了其在临床上 的应用。因此，探索快速扩增脂肪干细胞而又不影响其潜能的培养条件及其培养基组成的 优化组合是非常重要的研究内容。
[0138] 多组合培养体系仿生脂肪干细胞体内环境的无血清培养方案与传统的含动物血 清培养基相比，本发明提供取得脂肪干细胞纯度高、贴壁性能强、获取细胞能够保持干细胞 幼稚形态、具有更好的细胞增殖速率和细胞干性，培养获得的细胞表现出优异的细胞性能 同时降低了培养成本，适应了临床细胞治疗安全性需求。
[0139] 本发明公开了脂肪干细胞的培养、筛选、扩增技术，这些瓶颈一直是生物学干细胞 领域研究的热点和难点，目前利用基底膜显著黏附特性进行分离纯化，采用三维培养扩增 手段来获得。
[0140] 该发明适合依赖扩增贴壁型细胞并提供三维高拟体内细胞外基质系统进行目标 细胞水平的筛选与分离。
[0141] 本发明属于高模拟体内贴附环境，体外培养成体(胚胎)脂肪干细胞的生物细胞新 型培养技术。其特征在于:细胞基质底物为供体脱细胞基质底物筛选最佳黏附场所筛选干 细胞的制备方法;相应脂肪干细胞高模拟底物所在环境黏附筛选培养目标干细胞。用该方 法取得的干细胞，具有高传代能力，高增殖能力，并可在体外环境下分化形成其他细胞，此 方法比传统意义上的干细胞筛选更具科研与教学临床应用意义深入研究干细胞生长增殖 分化提供了不可估量的科研学术价值，开创体外高拟体内贴壁附着培养的新纪元，此方法 提出为国内国际首创。
[0142] 通过这种高目标模式的筛选，结合组织工程免疫原性细胞如何安全获得免疫逃 逸，延长移植时间增加组织工程临床应用，促进创面愈合与皮肤疾病提供了绝对优势的解 决方案。
[0143] 1、组织工程皮肤；同体-高拟体内细胞外基质，基质附着体外筛选方法对种子脂肪 干细胞进行筛选与于体内的微环境一致性是目前任何方法不可取代的，并且制备简单可反 复使用;是构建世界首例含脂肪干细胞组织工程产品基础；
[0144] 2、特异性强，通过免疫组化检测、透射电镜观察及流式细胞仪检测，结果表明本发 明的脂肪干细胞纯度高；
[0145] 3、创伤修复中的应用、在基因研究方面、美容整形修复、口腔疾病、皮肤病领域；
[0146] 4、脂肪干细胞科研价值:脂肪干细胞谱系的研究，深入探讨研究脂肪干细胞黏附， 生长、增殖、分化、免疫表达等学科基础研究；
[0147] 5、该方法可为其它器官体外培养再生提供良好的科研理论基础；
[0148] 6、再生医学组织工程领域应用种子干细胞库。
[0149] 脂肪干细胞的丰富来源。成体干细胞作为细胞治疗的种子细胞，由于较少存在伦 理问题，为临床中用常规治疗方法难以治疗的疾病带来了新的希望，随着生物化学、材料化 学、分子生物学、细胞生物学等的发展，脂肪干细胞培养，诱导定向分化已成为确实可行有 研究前景的技术，相信对脂肪干细胞高拟体外基质共培养技术及机制的深入研究，将会模 拟建立更为真实的生物体微环境培养系，为应用于临床治疗级别细胞深入研究奠定有力基 础，为组织工程、再生医学以及各种人类疾病提供临床治疗级别的种子细胞。
【附图说明】
[0150] 图1是本发明皮肤细胞高拟体内细胞外基质的制备流程。
[0151] 图2是本发明的临床治疗级细胞治疗用ADSCs应用高拟体内细胞外基质筛选培养 方法流程。
【主权项】
1. 一种临床治级脂肪干细胞ADSCs制备方法，由以下步骤组成； (1 )ADSCs培养液组合；（2)筛选用高拟体内细胞外基质制备；（3)应用高拟体内细胞外 基质与ADSCs培养液组合筛选培养ADSCs，以及ADSCs长期冻融保存液制备。2. -种利用权利要求1所述的ADSCs培养液组合包括： 配制培养液A:胎盘多肽注射液0.03ml/L、EGF5~25ng/ml、干细胞生长因子（SCF)2~ llng/ml、转铁蛋白5~15μg/ml、谷氨酰胺1.5mmol/L、维生素 Μ 0 · 5~lmg/L、维生素 C1~4μ g/ml、胰岛素5~8μg/ml、青霉素50~100u/ml、链霉素100u/m L、氢化可的松0.4μg/ml、商用 培养基-低糖DMEM/F12( 3:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4; 配制培养液B:胎盘多肽注射液0.2ml/L、人血清白蛋白（HSA) 1~3g/L、人血纤粘蛋白 (FN)1~4yg/L、人层粘连蛋白（LN)5~8yg/L、血小板衍生因子（roGF)l~10mg/L、EGF5~ 10ng/ml、干细胞生长因子（SCF) 1~3ng/ml、维生素 B5~8mg/L、叶酸1~10ng/ml、维生素 E 0·05~lmg/L、维生素 B40·5~lmg/L、黄体酬0·01~0·04yg/L、辅酶Q10 0· 1~2mM/L、胆固醇 1~10mg/L、牛磺酸0 · 1~0.4g/L、胰岛素5~6μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用 培养基低糖DMEM与商用培养基F12( 1:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4; 配制培养液C:胎盘多肽注射液0.02~0.8ml/L、人血清白蛋白（HSA)3~6g/L、人血纤粘 蛋白（FN)5~15yg/L、人层粘连蛋白（LN)10~80yg/L、重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)1 ~4mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)6~1111^/146?士?6?10~151^/1111、干细胞生长因子(3〇卩） 5~10ng/ml、维生素 B25~8mg/L、叶酸1~8ng/ml、黄体酬0 · 01~0 · 06yg/L、维生素 E 0.05~ 1.25mg/L、维生素 C 2~llmg/L、维生素 B4 0.5~lmg/L、辅酶Q10 0.1~2mM/L、胆固醇1~ 18mg/L、牛磺酸0 · 1~0 · 6g/L、还原性谷胱甘肽2~5yg/L、油酸0 · 5~7 · 5mg/L、谷氨酰胺0 · 5 ~2.5mmol/L、转铁蛋白6~20μg/ml、胰岛素5~7μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商 用培养基低糖DMEM与商用培养基F12( 1:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4。3. -种利用权利要求1所述筛用高拟体内细胞外基质制备方法，包括 其中所述的高拟体内细胞外基质分为两种：1.1真皮层作为细胞外基质；1.2全层皮肤 并包括皮下组织层作为细胞外基质； 制备包括以下步骤:A)组织消毒处理;B)高拟体内细胞外基质脱细胞处理;C)将消毒或 经脱细胞处理的高拟体内细胞外基质进一步进行低温、脱水、辐照灭菌处理;其中所述步骤 B)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶一非离子表面活性剂一络合剂联合法、络合剂加盐_ 阴离子表面活性剂法或胰酶联合Η)ΤΑ交联液法。4. 如权利要求3所述的B)高拟体内细胞外基质脱细胞处理步骤，其特征在于，所述的高 拟体内细胞外基质的制备方法中的冷酶交联剂法是:加入〇. 1~〇. 5 %蛋白酶冰浴冷消48~ 12h，用含0.25 %戊二醛磷酸缓冲溶液，pH在7.20~7.40之间，交联4~6h，超纯水或注射用 水冲洗8~10次； 所述的制备方法中的酶一非离子表面活性剂一络合剂联合法是:0.1~0.25%中性蛋 白酶与0.01~0.02%EDTA，0.1~0.8%TritonX -100溶液，室温下作用48~24h; 所述的络合剂加盐-阴离子表面活性剂法是:〇. 01~〇. 〇2%EDTA含0.1~lmol/L氯化钠 溶液，37 °C下作用24~12h，后用0.1~0.8 % SDS溶液，室温下作用60~30min; 所述的胰酶联合EDTA交联液是:0.1~0.6 %胰蛋白酶和0.01~0.1 % EDTA，胰蛋白酶与 EDTA溶液按照体积比为1:2配比，37 °C快速消化60~1 Omin，交联液中交联4~6h，交联后用 超纯水或注射用水冲洗8~10次。5. 如权利要求3所述的C)步骤低温、脱水、辐照灭菌，其特征在于，低温一30~一 100°C 冷冻干燥，真空度达到10~130pa，脱去脐带组织高拟体内细胞外基质90~95 %以上水分， 取出密封与真空包装，经辐照15~80KGY剂量灭菌。6. -种利用权利要求1所述的应用高拟体内细胞外基质与ADSCs培养液组合筛选培养 ADSCs的方法，包括： a) 制备ADSCs悬液:取材，消化液A，B或C二步消化，用权利要求2所述的培养液A终止消 化，红细胞裂解液处理，过滤清洗，重悬细胞计数，后加入培养液A; b) ADSCs的筛选及培养:将高拟体内细胞外基质加入权利要求2所述的培养液B，加入步 骤a)制备的细胞悬液，培养，清洗，目标ADSCs贴壁粘附于高拟体内细胞外基质，加入权利要 求2所述的培养液C进行扩增培养； c) 消化富集传代培养：消化液B或C消化，含10 %人血清培养液B终止消化，离心后加入 权利要求2所述的培养液C进行扩增培养； d) ADSCs长期冻融保存液制备。7. -种利用权利要求6所述的消化液A、B、C，其特征在于，组分包括： 消化液配制A:消化液配制A:含溶质0.1 %中性蛋白酶和0.01 %EDTA(体积比1:1)，无 Ca2 +、Mg2+、无菌PBS为溶剂，配制溶液。 消化液配制B:含溶质0.2%胰酶和0.075% Π 型胶原酶(体积比1:1)，无胎盘多肽注射 液培养液A为溶剂，配制溶液。 消化液配制C:含溶质0.15%中性蛋白酶和0.2%1型胶原酶(体积比1:1)，无胎盘多肽 注射液培养液A为溶剂，配制溶液。8. -种利用权利要求1所述的ADSCs冻融保存液制备，其特征在于，抗冻溶质组分包括： 维生素 Μ 1~10μg/ml，维生素 C 1~4μg/ml，聚乙二醇4ml、（优选自体血清)人AB血清10~ 15%、甘油20%、甘露醇3ml、细胞松弛素2.7μg/ml、二甲基亚砜(DMSO)IO%、硫酸软骨素3~ 6%，保存配制液以权利要求2所诉无抗的培养液ABC为溶剂制备抗冻溶液。PH控制在7.3~ 7.4，0.22μηι微孔滤过除菌。
【文档编号】A01N1/02GK105820998SQ201610194945
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】王凌仪
【申请人】王凌仪