用于使用自体细胞系统从生殖系细胞离体产生有发育能力的卵的方法和组合物的制作方法

用于使用自体细胞系统从生殖系细胞离体产生有发育能力的卵的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本技术提供用于多潜能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞向卵母细胞、颗粒细胞和/或颗粒前体细胞，即，“人造颗粒细胞”定向分化的方法。所述人造颗粒细胞可用在用于卵泡或卵泡样结构和未成熟卵母细胞的生长和成熟的方法中。另外，所述人造颗粒细胞可用于在有需要的受试者中增加卵巢衍生的激素和生长因子的方法中。
【专利说明】用于使用自体细胞系统从生殖系细胞离体产生有发育能力的卵的方法和组合物
[0001]与相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年1月7日提交的美国临时申请号61 /887，569的优先权，所述临时申请的内容通过引用以其整体结合到本文中。
[0002]政府支持
本技术在国立卫生研究院授予的基金R37-AG012279和F32-AG034809的美国政府支持下作出。政府在本技术中具有一定的权利。
[0003]发明背景
在美国大约7，000，000夫妇患有不育，然而，每年仅进行约150，000个体外受精(IVF)周期并且这些有限的数目反映一些夫妇在同一年中参加该程序两次。有需要的那些和寻找不育的解决方案的那些之间的巨大下降(也就是说小于2%的不育夫妇实际上经受辅助生殖)是由于普遍高的不育治疗费用之外的因素。值得注意地，许多妇女不被认为是IVF的“良好候选人”，这是因为她们将不能响应为了取卵用于抑制然后过度刺激卵巢的当前激素注射方案而产生卵。不被认为是IVF的良好候选人的妇女的实例包括在其卵巢中保留严重减少的未成熟卵细胞(卵母细胞)群的处于高龄产妇年龄(advanced maternal ages)的妇女或由于多种原因包括，但不限于，遗传原因、免疫(自身免疫)异常或先前暴露于损伤卵巢的细胞毒治疗而显示卵巢早衰(POF)/过早的卵巢功能不全(POI)的妇女(例如进行癌症治疗的年轻女孩和育龄妇女)。
[0004]卵巢衰竭，以及导致的绝经，由于卵巢卵泡丧失而发生，每一卵巢卵泡由称为颗粒细胞的支持性体细胞围绕的单个卵母细胞组成。除了用作卵巢中主要的内分泌生产结构之夕卜，还需要卵泡来支持被封入的卵母细胞的发育和成熟。无颗粒细胞支持，新形成的卵细胞将会迅速死亡。卵泡丧失下产类固醇的卵巢颗粒细胞出现生育力的丧失和减小的产类固醇激素能力，后者导致对妇女健康的深远的有害作用，其不仅影响生殖器官和组织还影响骨骼、脑和心血管系统，等等。净结果为骨密度和认知功能随年龄下降，以及心血管疾病(CVDs)增加，其为全世界妇女死亡的主要原因。
[0005]发明概述
在一个方面，本技术提供用于多能细胞向颗粒细胞和/或颗粒前体细胞定向分化的方法，所述方法包括:在将多能细胞定向至分化为颗粒细胞和/或颗粒前体细胞的培养条件中培养多能细胞，其中所述培养条件包括缺乏MEFs和LIF以及存在GSK抑制剂。
[0006]在一些实施方案中，所述培养条件进一步包括存在骨形态发生蛋白(BMP4)和/或视黄酸(RA)。
[0007]在一些实施方案中，多能细胞包含颗粒细胞特异性受体，其中所述颗粒细胞特异性受体的表达指示为颗粒细胞或颗粒细胞前体的细胞。
[0008]在一些实施方案中，所述GSK-3抑制剂选自SB216763、B10、CHIR99021、氯化锂(LiCl)、马来酰亚胺衍生物、星形孢菌素、吲哚衍生物、paullone衍生物、嘧啶和氟嘧啶衍生物、噁二唑衍生物、噻唑衍生物、杂环衍生物及其组合。
[0009]在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多能细胞与用于颗粒细胞特化的信号传导通路的生长因子或激活剂接触。
[0010]在一些实施方案中，所述用于颗粒细胞特化的信号传导通路的生长因子或激活剂为bFGF、Jaggedl或Jagged2的一种或多种。
[0011]在另一个方面，本技术提供用于多能细胞向颗粒细胞和/或颗粒前体细胞定向分化的方法，所述方法包括:在将多能细胞定向为颗粒细胞和/或颗粒前体细胞的培养条件中培养多能细胞，其中所述条件包括缺乏MEFs和LIF以及存在GSK抑制剂，其中所述多能细胞经工程改造以包含一个或多个可诱导的颗粒细胞-特异性基因；诱导一个或多个卵巢颗粒细胞-特异性基因表达;和形成人造颗粒细胞。
[0012]在一些实施方案中，所述方法还包括在骨形态发生蛋白(BMP4)和/或视黄酸(RA)存在下培养多能细胞。
[0013]在一些实施方案中，所述多能细胞包含颗粒细胞特异性受体，其中所述颗粒细胞特异性受体的表达指示为颗粒细胞或颗粒细胞前体的细胞。
[0014]在一些实施方案中，所述一个或多个可诱导的颗粒细胞-特异性基因选自叉头框L2(forkhead box L2) (Foxl2)、无翅型MMTV整合位点家族成员4 (WNT4)、Nr5al、Dax_l、ATP-结合盒亚家族9 (Abca9)、乙酰辅酶A酰基转移酶2 (线粒体3_氧代酰基(oxoacyl)-辅酶A硫解酶;Acaa2)、主动脉平滑肌肌动蛋白a2 (Acta2)、具有I型凝血酶基序的解联蛋白-样和金属肽酶(reprolysin-样)17 (Adamtsl7)、ADAMTS_样2 (Adamtsl2)、AF4/FMR2家族成员I (Affl)、表达序列AI314831 (AI314831)、醛-酮还原酶家族I成员C14 (Akrlcl4)、醛-酮还原酶家族I %1^112和成员0样(410'1(31)。
[0015]在另一个方面，本技术提供离体人工卵巢环境，所述人工卵巢环境包括:人造颗粒细胞，其中所述人造颗粒细胞使用上述方法的任一产生；卵母细胞前体细胞;和卵巢组织。在一些实施方案中，所述人造颗粒细胞、所述卵母细胞前体细胞和卵巢组织为自体的。
[0016]在另一个方面，本技术提供用于制造成熟卵泡和成熟卵母细胞的方法，所述方法包括:使用用于制备颗粒细胞和/或颗粒前体细胞的上述方法的任一使多能细胞定向分化为颗粒细胞和/或颗粒前体细胞(人造颗粒细胞)；使人造颗粒细胞与卵母细胞前体细胞和卵巢组织组合;和在适合形成成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件下培养人造颗粒细胞与卵母细胞前体细胞和卵巢组织的组合。
[0017]在一些实施方案中，所述适合形成成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件包括存在卵泡刺激激素(FSH)和/或促黄体激素(LH)。
[0018]在另一个方面，本技术提供有需要的受试者的卵巢组织中卵泡和未成熟卵母细胞的生长和成熟，其包括使卵巢组织与颗粒细胞和/或颗粒前体细胞(人造颗粒细胞)接触，其中所述人造颗粒细胞使用前述方法的任一产生。
[0019]在一些实施方案中，人造颗粒细胞与卵巢组织在体内接触。
[0020]在一些实施方案中，将人造颗粒细胞直接注射入受试者的卵巢组织中。
[0021]在一些实施方案中，所述有需要的受试者患有一种或多种以下问题，所述问题选自受孕困难、处于不育治疗中、处于体外受精中、治疗过癌症和经受过细胞毒治疗。
[0022]在另一个方面，本技术提供用于增加有需要的受试者中的一种或多种卵巢衍生的激素或生长因子的水平的方法，所述方法包括:使多能细胞定向分化为颗粒细胞和/或颗粒前体细胞(人造颗粒细胞)，其中所述人造颗粒细胞使用上述方法的任一产生;基于颗粒细胞特异性受体的表达分离富集的人造颗粒细胞群;和给予受试者有效量的富集的人造颗粒细胞群，其中所述颗粒细胞或颗粒细胞前体分泌一种或多种卵巢衍生的激素和生长因子，并且其中与给予富集的人造颗粒细胞群之前的受试者相比给予人造颗粒细胞之后受试者显示提高的一种或多种卵巢衍生的激素或生长因子的水平。
[0023]在一些实施方案中，所述方法还包括刺激人造颗粒细胞以分泌卵巢衍生的激素。
[0024]在一些实施方案中，所述卵巢衍生的激素选自:雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和孕酮。
[0025]在一些实施方案中，所述颗粒细胞或颗粒细胞前体用卵泡-刺激激素(FSH)、8-溴腺苷3’，5’_环单磷酸酯(8-br-cAMP)和促黄体激素(LH)刺激以分泌卵巢衍生的激素。
[0026]在一些实施方案中，所述人造颗粒细胞群为受试者自体的。在一些实施方案中，所述受试者为人类。
[0027]在另一个方面，本技术提供用于产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的离体方法，所述方法包括:组合人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织;和在足以产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件下培养人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织的组合，其中所述人造颗粒细胞使用上述方法的任一产生并且其中所述人造颗粒细胞、所述卵母细胞前体细胞和所述卵巢组织为自体的。
[0028]在一些实施方案中，所述卵母细胞前体细胞衍生自多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞(OSCs)。在一些实施方案中，所述卵母细胞前体细胞为原始生殖细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞。
[0029]在一些实施方案中，所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞经遗传修饰以校正基因缺陷。在一些实施方案中所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞使用选自电穿孔、直接注射编码mRNA、基于脂质的转染、逆转录病毒转导、腺病毒转导、慢病毒转导、CRISPR/Cas9、TALENs、锌指核酸酶(ZFNs)、经工程改造的大范围核酸酶和定点突变的一种或多种技术遗传修饰。
[0030]在一些实施方案中，本发明提供用于为诊断有遗传疾病或病症的受试者开发遗传修饰的成熟卵母细胞的方法，包括:遗传修饰来自受试者的多能细胞或卵母细胞前体细胞(例如，雌性生殖系干细胞或卵原干细胞s)以校正基因缺陷；在足以产生卵母细胞前体细胞的条件下培养所述经遗传修饰的多能细胞;在无或有人造颗粒细胞下组合遗传修饰的卵母细胞前体细胞与卵巢组织，其中，若使用，人造颗粒细胞使用上述方法的任一产生并且其中人造颗粒细胞，若使用，和卵巢组织为受试者自体的；和在足以产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件下培养卵母细胞前体细胞和卵巢组织，在无或有人造颗粒细胞下，的组合，其中所述成熟卵母细胞不携带遗传疾病。
[0031]在一些实施方案中，所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞使用选自电穿孔、直接注射编码mRNA、基于脂质的转染、逆转录病毒转导、腺病毒转导、慢病毒转导、CRISPR/Cas9、TALENs、锌指核酸酶(ZFNs)、经工程改造的大范围核酸酶和定点突变的一种或多种技术遗传修饰。
[0032]在另一个方面，本技术提供在体外受精中使用的离体产生成熟卵母细胞的方法，所述方法包括组合人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织；和在足以产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件下培养人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织的组合，其中所述人造颗粒细胞使用上述方法的任一产生并且其中所述人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织为自体的。
[0033]在一些实施方案中，所述卵母细胞前体细胞衍生自多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞。在一些实施方案中，所述卵母细胞前体细胞为原始生殖细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞。在一些实施方案中，所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞经遗传修饰以校正基因缺陷。在一些实施方案中，所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞使用选自电穿孔、直接注射编码mRNA、基于脂质的转染、逆转录病毒转导、腺病毒转导、慢病毒转导、CRISPR/Cas9、TALENs、锌指核酸酶(ZFNs)、经工程改造的大范围核酸酶和定点突变的一种或多种技术遗传修饰。
[0034]在一些实施方案中，所述方法还包括冷冻所述成熟卵母细胞。
[0035]附图简述
图1A为显示卵原干细胞(OSCs)在老龄小鼠卵巢中存留的图。使用抗-Ddx4抗体与荧光-激活细胞分选(FACS)偶联从C57B1/6小鼠卵巢分离生殖系干细胞(也称为卵原干细胞或OSCs) (Woods 和 Tilly, Nature Protocols, 8:966-88 (2013))，其中小鼠在3、6、10、15和20个月的年龄范围内。
[0036]图1B显示在从图1A的3-月龄和20-月龄雌性小鼠卵巢分离的OSCs的培养物中产生的未成熟卵母细胞的实例(对于方案，参见Woods和Tilly，Nature Protocols, 8:966-88(2013))，证实来自老龄雌性的OSCs仍能够形成卵母细胞，尽管事实上其卵巢缺乏卵母细胞。
[0037]图2A-D为显示老龄小鼠的OSCs丧失支持原始卵泡形成的能力的图。分别在自杀基因激活和灭活后检验了具有可诱导的“自杀基因”(单纯疱疹病毒胸苷激酶或HSVtk)的2-11个月范围内的转基因小鼠丧失和重获其卵母细胞保留(reserves)的能力，所述“自杀基因”仅在HSVtk前药更昔洛韦(GCV)存在下特异性中断OSC向卵母细胞分化。
[0038]图3为显示富集颗粒细胞的幼龄小鼠卵巢体细胞的卵巢内移植增加不再能够使用其内源OSCs产生新卵母细胞和卵泡(参见图2)的受体老龄小鼠(即，10-月大小鼠)中的原始卵泡池的图。每对柱的左侧柱为老龄模拟-移植的对照小鼠，每对柱的右侧柱为接受幼龄卵巢组织-衍生细胞移植的老龄小鼠。反应代表可新形成的卵母细胞的最早阶段的原始卵泡数目(柱所包围的)的柱在图的中心被放大(enhanced)。
[0039]图4A为显示OSCs从绝经前(22-47岁)和绝经后(53和58岁)生命期二者期间的妇女的产率的图表，证实OSCs在老龄人卵巢中仍然存在。
[0040]图4B为从培养的自绝经后(53岁)人卵巢皮质组织片段分离的OCSs体外产生的未成熟卵母细胞的图片。
[0041 ] 图5A为显示FACS-纯化的阳性细胞(2 x 13细胞/孔)的雌二醇产生的图，其在胚胎干细胞培养物中自发分化，在培养物中维持多达3天(FSH，100 ng/ml; 8-br-cAMP, I mM)。数据为3个独立培养物的平均值土 SEM (*，与溶媒对照相比P < 0.05)。
[0042] 图5B为显示FACS-纯化的阳性细胞(2 x 13细胞/孔)的孕酮产生的图，其在胚胎干细胞培养物中自发分化，在培养物中维持多达3天(FSH，100 ng/ml; 8-br-cAMP, I mM)。数据为3个独立培养物的平均值土 SEM (*，与溶媒对照相比P < 0.05)。
[0043]图6A为显示注射从分化12天后的ESC培养物分离的DsRed-表达细胞之前的野生型新生卵巢的图像。
[0044]图6B为显示注射从分化12天后的ESC培养物分离的DsRed-表达细胞之后的野生型新生卵巢的图像。
[0045]图6C为显示移植8天后卵巢间质(stroma)中存在DsRed-表达细胞的图像(左)；通过双重免疫荧光，这些细胞经常与未成熟卵母细胞相关联，其通过卵母细胞标志Dazl的表达鉴定(绿色;右侧面板)。
[0046]图6D为显示移植14天时DsRed-表达细胞仅存在于生长卵泡的颗粒细胞层中的图像。
[0047]图7A显示在离体培养2周的人卵巢皮质条中通过光学显微术可视化生长中的卵泡(直径大约250微米;箭头)。
[0048]图7B显示离体培养14天后通过DDX4免疫荧光评估人卵巢皮质组织中的卵母细胞，其显示许多原始和初级卵泡(左)和若干多层卵泡(右)。
[0049]图8A为描绘颗粒/卵丘细胞复合体中包含的卵母细胞体外成熟至完全成熟的中期II卵的速率的图，其中所述颗粒/卵丘细胞-卵母细胞复合体初始从成年牛卵巢皮质片段中存在的未成熟窦前阶段(直径〈2 mm)卵泡，或更成熟的早期窦阶段(直径〉3 mm)卵泡收集(每组分析的卵母细胞的数目在各自的条上方显示)。
[0050]图SB显示成功地从自直径小于2mm的卵泡收集的颗粒细胞-卵母细胞复合体彻底体外成熟的完全成熟中期II卵的图像，其中伸出的第一极体可见(箭头)。
[0051 ]发明详述
上文引入和下文更详细讨论的各种概念可以以许多方式的任一实现，因为所描述的概念不限于任何具体的实现方式。具体实现和应用的实例主要为说明性目的而提供。
[0052]如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”或“所述”包括复数指示物，除非内容另有明确指示。例如，提及“一个细胞”包括两个或多个细胞的组合，等。
[0053]如本文所使用的，“约”将由本领域技术人员所理解并且将根据其使用的上下文而在一定程度上不同。如果使用了本领域技术人员不清楚的术语，给定其所使用的上下文，“约”将指至多该具体术语的正或负10%。
[0054]如本文所使用的，“给予”受试者剂、药物、化合物或细胞包括将剂、药物、化合物或细胞引入或递送至受试者以执行其预期功能的任何途径。给予可通过任何合适的途径实施，包括，例如，局部注射(例如，导管给予或直接卵巢内注射)、全身性注射、静脉内注射、子宫内注射、口服、鼻内和胃肠外给予。给予包括自身给予和由另一给予。
[0055]如本文所使用的，“分化”指谱系定型的发育过程。“谱系”是指细胞发育的途径，其中前体或“祖”细胞经历渐进的生理变化以成为具有特征功能的特定细胞类型(例如，神经细胞、肌肉细胞或颗粒细胞)。分化按阶段发生，借此细胞逐渐变得更特化直至达到它们完全成熟，其也称为“终末分化” ο “终末分化细胞”为已经定型为特定谱系并且达到分化的最终阶段的细胞(即，完全成熟的细胞)。卵母细胞为终末分化细胞类型的一个实例。
[0056]如本文所使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”指适合达到期需作用的量，例如，将例如，提高有需要的受试者中卵巢衍生的激素和生长因子水平或支持卵母细胞前体细胞分化为卵母细胞的颗粒细胞，例如，人造颗粒细胞的量。举例来说，而非限制，在一些实施方案中，治疗有效量的颗粒细胞为升高受试者的卵巢衍生的激素和/或生长因子水平所需要的颗粒细胞的量。在激素治疗应用的背景中，在一些实施方案中，给予受试者的颗粒细胞或颗粒细胞前体的量将取决于受试者的病况或疾病状态，例如，绝经的受试者或做过子宫切除术的受试者，以及取决于受试者的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和药物耐受性。技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。
[0057]如本文所使用的，术语“富集的群”指纯化或半纯化的细胞群，例如颗粒细胞或颗粒细胞前体(例如，人造颗粒细胞)。在一些实施方案中，特定的颗粒细胞或颗粒细胞前体群通过从分化多能细胞的群分选颗粒细胞或颗粒细胞前体，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)、磁辅助细胞分选(MACS)或本领域已知的用于从一般细胞群分离特定细胞群的其它细胞纯化策略来富集。以举例而非限制的方式，在一些实施方案中，富集的颗粒细胞或颗粒细胞前体群为已经通过FACS从分化多能细胞分离的纯化或半纯化的颗粒细胞或颗粒细胞前体群。
[0058]如本文所使用的，“卵泡”指包含体(无或由膜-间质的颗粒)细胞围绕的单个卵母细胞的卵巢结构。每一完全成形的卵泡被包封在完整的基膜中。尽管这些新形成的卵泡中的一些几乎立即开始生长，但其大部分保持在静止期直至它们退化或一些信号激活它们进入生长期。
[0059]如本文所使用的，术语“未成熟卵母细胞”指停止在前期I的初级卵母细胞。
[0060]如本文所使用的，术语“成熟卵泡”指具有活跃增殖的围绕发育中的卵母细胞的颗粒细胞的卵泡，其响应外源激素，特别地促性腺激素(卵泡-刺激激素或FSH，和促黄体激素或LH)。举例来说，而非限制，由于重新开始减数分裂之后颗粒细胞增殖、卵母细胞膨胀和/或由于充满流体的窦的发育，成熟或成熟中的卵泡尺寸增加。
[0061]如本文所使用的，术语“成熟卵母细胞”(也称为卵)指停止在减数分裂的中期II的能够在精子穿入之后受精或通过加入钙离子载体激活孤雌生殖的卵母细胞。
[0062]如本文所使用的，术语“颗粒刺激剂”指刺激颗粒细胞或颗粒细胞前体分泌卵巢衍生的激素，例如，雌二醇或孕酮，和生长因子的任何化合物、激素、肽、药物或其它剂。举例来说，而非限制，在一些实施方案中，颗粒刺激剂包括但不限于卵泡刺激激素(FSH)和8-溴腺苷3，，5 环单磷酸酯(8-br-cAMP)。
[0063]如本文所使用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”可为个体生物、脊椎动物、哺乳动物或人。
[0064]如本文所使用的，术语“人工颗粒”指至少部分上从多能细胞的定向分化体外产生的颗粒细胞和/或颗粒前体细胞。
[0065]通常(General)
研究显示小鼠胚胎干细胞(ESCs)和诱导的多潜能干细胞(iPSCs)可分化为能够受精、胚胎发生和分娩可存活后代的卵母细胞，虽然是以低频率。Hayashi等人，Science 338:971-975 (2012)。这些研究还证明在分化的ESCs或iPSCs的培养物中自发出现的并且与胎儿生殖腺中的内源原始生殖细胞(PGCs)类似的原始生殖细胞(PGC)-样细胞(PGCLCs)需要与发育匹配的胚胎卵巢体细胞相互作用以实现它们在体内的全部潜能。为了提供卵子发生、卵泡发生和最终从PGCLCs形成卵所必需的微环境提示，需要发育匹配的卵巢体细胞源。
[0066]小鼠ESCs体外形成的卵泡样结构包含单个卵母细胞-样细胞，其可生长至直径70μπι大，被一层或多层紧密附着的一定程度上与卵巢颗粒细胞类似的体细胞围绕。Hubner等A, Science 300: 1251-1256 (2003)。类似于卵巢中正常卵泡形成期间所观察到的，ESC-衍生的卵泡样结构中的体细胞经由胞间桥与它们包封的生殖细胞连接，这可用于促进正常卵泡发育所需的细胞与细胞相互作用。另外，增加的类固醇生成途径基因的表达，以及雌激素分泌入培养基，伴随体外卵泡样结构从ESC形成而发生。尽管这些观察共同支持以下观念:体外-衍生的卵泡样结构的体细胞具有与内源颗粒细胞超结构和功能上相似的特征，从分化ESCs分离和表征这些细胞是困难的。
[0067]卵巢衰竭和由此导致的绝经由于卵巢卵泡的丧失而发生，所述卵泡是卵巢中主要的内分泌产生结构。卵泡丧失下，产类固醇的卵巢颗粒细胞出现减小的产类固醇激素的能力，导致对妇女健康的深远的有害作用，这不仅影响生殖器官和组织还影响骨骼、脑和心血管系统。净结果为骨密度和认知功能随年龄下降，以及心血管疾病(CVDs)增加，其为全世界妇女死亡的主要原因。当前，使用绝经期激素治疗(MHT，先前称为激素替代治疗，或HRT)来暂时抵消伴随绝经的一些症状，但MHT带来许多证据充分的警告和健康风险。因此，可以与下丘脑生殖腺轴合作工作的从干细胞产生产类固醇的卵巢颗粒细胞的策略可填充当前对卵巢衰竭和绝经的管理的关键空白。
[0068]已经发表了在体外重演卵巢-样环境的尝试。使用3-维(3-D)体外成熟(IVM)培养系统，已经证明组合三种卵泡亚型(例如，膜、颗粒和卵母细胞)创建支持人卵母细胞成熟的“人工”卵巢-或卵泡-样环境。在小鼠、大鼠和灵长类中报道了相似的卵泡培养策略，其中离体卵泡发育导致卵母细胞成熟。然后，在MHT中的潜在效用最近才被探索。借鉴先前对卵巢卵泡培养物使用3-D藻酸盐包封的工作，一些数据表明从小鼠卵巢获得的膜和颗粒细胞的多层共培养物可以在体外维持至少一个月。在这段时间，包封的共培养物以与天然卵泡相似的能力发挥功能，这通过雌二醇和孕酮的合成以及促性腺激素刺激后抑制素的分泌证明。考虑到MHT最明显的缺点是缺乏下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴所有组分之间的通讯，促进内分泌功能的基于细胞或组织的策略具有真正避开该问题的潜能。然而，当前可用于这种治疗的细胞源有限，因为需要这种治疗的患者具有很少甚至没有颗粒或膜细胞。
[0069]本技术提供一种改善的用于通过使用产生颗粒和/或颗粒前体细胞的基于多能细胞的方法重演人工卵巢环境的方法。一般而言，本技术涉及用于多能细胞向颗粒和/或颗粒前体细胞定向分化的方法。另外，本技术涉及通过多能细胞的定向分化产生的颗粒和/或颗粒前体细胞的用途。
[0070]用于多能细胞向颗粒细胞和/或颗粒前体细胞定向分化的方法
在一些实施方案中，用于多能细胞向颗粒和/或颗粒前体细胞(后文“人造颗粒细胞”)定向分化的方法包括在适合多能细胞向人造颗粒细胞分化的条件中培养多能细胞。
[0071]在一些实施方案中，适合多能细胞向人造颗粒细胞分化的条件包括但不限于，通过差异性贴壁从有丝分裂-失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层分离多能细胞(例如，胚胎干细胞)并在白血病抑制因子(LIF)缺乏下培养多能细胞。在一些实施方案中，从MEF饲养层取下后将多能细胞以单层铺板在明胶-包覆的板上。在一些实施方案中，多能细胞在LIF缺乏下用15% FBS培养。
[0072]另外，或替代地，在一些实施方案中，用于多能细胞向人造颗粒细胞分化的合适条件包括，但不限于，将多能细胞与中胚层-指定剂(specifying agents)例如糖原合成酶激酶-3 (GSK3)抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP4; 1-1,000 ng/ml)、视黄酸(RA; 0.001-10 μ
Μ)或其组合接触。
[0073]举例来说，而非限制，在一些实施方案中，GSK_3抑制剂包括，但不限于，SB216763(1-20 μΜ)、ΒΙ0 (0.1-10 μΜ )、CHIR99021 (0.1-10 μΜ )、氯化锂(LiCl)、马来酰亚胺衍生物、星形孢菌素、吲哚衍生物、paul lone衍生物、嘧啶和氟嘧啶衍生物、噁二唑衍生物、噻唑衍生物和杂环衍生物。
[0074]在一些实施方案中，使所述多能细胞与用于颗粒细胞特化的信号传导通路的生长因子或激活剂接触以定向多能细胞向人造颗粒细胞分化。用于颗粒细胞特化的信号传导通路的生长因子或激活剂包括，但不限于bFGF或Notch信号传导通路的激活剂，例如Jaggedl或Jagged2。
[0075]在一些实施方案中，用于多能细胞向人造颗粒细胞定向分化的方法为分步方法，包括:
步骤I)在MEFs和LIF缺乏以及至少一种GSK-3抑制剂存在下培养单层多能细胞;和步骤2)向培养基中添加BMP4和/或RA。
[0076]在一些实施方案中，所述多能细胞在步骤I中培养约I小时-48小时、约4小时-44小时、约8小时-40小时、约12小时-36小时、约16小时-32小时、约20小时-28小时或约22小时-26小时。在一些实施方案中，所述多能细胞在步骤I中培养约24小时。
[0077]在一些实施方案中，所述多能细胞在步骤2中用BMP4和/或RA孵育约I小时-48小时、约4小时-44小时、约8小时-40小时、约12小时-36小时、约16小时-32小时、约20小时-28小时或约22小时-26小时。在一些实施方案中所述多能细胞在步骤2中用BMP4和/或RA孵育约24小时。
[0078]在一些实施方案中，所述多能细胞经工程改造以表达一个或多个指定颗粒细胞和/或颗粒细胞前体的基因。在一些实施方案中，所述一种基因或多种基因为可诱导的。在一些实施方案中，指定颗粒细胞和/或颗粒细胞前体的一种基因或多种基因的诱导定向多能细胞向人造颗粒细胞分化。
[0079]举例来说，而非限制，在一些实施方案中，指定颗粒细胞和/或颗粒细胞前体(例如，为用于和/或引起向这些细胞分化的生物标志)的基因包括，但不限于，叉头框L2(Foxl2)、无翅型MMTV整合位点家族成员4 (WNT4)、Nr5al、Dax_l、ATP_结合盒亚家族9(Abca9)、乙酰辅酶A酰基转移酶2 (线粒体3_氧代酰基-辅酶A硫解酶;Acaa2)、主动脉平滑肌肌动蛋白a2 (Acta2)、具有I型凝血酶基序的解联蛋白-样和金属肽酶(reprolysin-样)17 (Adamtsl7)、ADAMTS-样 2 (Adamtsl2)、AF4/FMR2 家族成员 I (Affl)、表达序列 AI314831(AI314831)、醛-酮还原酶家族I成员C14 (Akrlcl4)、醛-酮还原酶家族I Notch2和成员C-样(Akrlcl) ο
[0080]可通过本领域已知的任何方法实现多能细胞的工程改造以包含一个或多个指定颗粒细胞和/或颗粒细胞前体的基因。举例来说，而非限制，在一些实施方案中，通过使用选自电穿孔、病毒转导、阳离子脂质体转染、基于多组分脂质的转染、磷酸钙、DEAE-葡聚糖和直接递送的技术将所述一个或多个指定颗粒细胞和/或颗粒细胞前体的基因插入多能细胞中。
[0081]在一些实施方案中，多能细胞经工程改造以包含至少一个颗粒细胞特异性基因报道分子，其中颗粒细胞特异性基因报道分子的表达指示为颗粒细胞或颗粒细胞前体的细胞。
[0082]在一些实施方案中，所述颗粒细胞特异性报道分子包括在颗粒细胞-特异性基因调节控制下的荧光报道分子。在一些实施方案中，控制颗粒细胞特异性报道的颗粒细胞-特异性基因为在多能细胞中可诱导表达的同一基因。
[0083]卵巢颗粒细胞-特异性基因包括，但不限于，叉头框L2(Foxl2)、无翅型MMTV整合位点家族成员4 (WNT4)、Nr5al、Dax-l、ATP-结合盒亚家族9 (Abca9)、乙酰辅酶A酰基转移酶2 (线粒体3-氧代酰基-辅酶A硫解酶;Acaa2)、主动脉平滑肌肌动蛋白a2 (Acta2)、具有I型凝血酶基序的解联蛋白-样和金属肽酶(reprolysin-样)17 (Adamts 17)、ADAMTS_样2(Adamtsl2)、AF4/FMR2 家族成员 I (Affl)、表达序列 AI314831 (AI314831)、醛-酮还原酶家族I成员C14 (Akrlcl4)、醛-酮还原酶家族I 1'101:(3112和成员0样(厶10'1(31)。
[0084]荧光报道分子包括，但不限于，Discosoma sp.红(DsRed)、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和橙色荧光蛋白(OFP)。
[0085]在一些实施方案中，所述颗粒细胞特异性报道分子为在颗粒细胞-特异性基因调节控制下的非荧光报道分子。非-荧光报道分子包括，但不限于，荧光素酶和半乳糖苷酶。
[0086]颗粒细胞特异性报道分子可通过本领域已知的任何方法工程改造。举例来说，而非限制，在一些实施方案中，通过鉴定颗粒细胞特异性基因启动子、确定基因启动子的保守区、使用PCR从基因组DNA分离保守区和将保守区克隆入包含荧光标志的载体来工程改造颗粒细胞特异性报道分子。
[0087]可通过本领域已知的任何方法实现多能细胞的工程改造以包含颗粒细胞特异性基因报道分子。举例来说，而非限制，在一些实施方案中，通过使用选自电穿孔、病毒转导、阳离子脂质体转染、基于多组分脂质的转染、磷酸钙、DEAE-葡聚糖和直接递送的技术将所述颗粒细胞特异性基因报道分子插入多能细胞中。
[0088]在一些实施方案中，用于多能细胞向人造颗粒细胞定向分化的方法包括上述适当培养条件的任一和上述经工程改造的多能细胞的组合。举例来说，而非限制，在一些实施方案中，用于多能细胞向人造颗粒细胞定向分化的方法包括在包括缺乏MEFs和LIF和存在GSK抑制剂的培养条件下培养多能细胞，其中所述多能细胞经工程改造表达一个或多个指定颗粒细胞和/或颗粒细胞前体的基因，诱导所述一个或多个指定颗粒细胞和/或颗粒细胞前体的基因表达，从而导致人造颗粒细胞形成。
[0089]在一些实施方案中，诱导多能细胞群分化后，鉴定和分离人造颗粒细胞。在一些实施方案中，通过在颗粒细胞-特异性基因控制下的荧光标志的表达鉴定人造颗粒细胞。在一些实施方案中，通过用FACS、基于抗体的免疫磁性分选(例如，磁辅助细胞分选(MACS))、差异性贴壁、克隆选择和扩充或抗生素抗性形成富集的人造颗粒细胞前体群分离人造颗粒细胞。
[0090]在一些实施方案中，使用颗粒细胞或颗粒细胞前体选择性或特异性的细胞表面标志分离人造颗粒细胞。颗粒细胞或颗粒细胞前体选择性或特异性的细胞表面标志的实例包括，但不限于抗-Mill Ierian激素受体和Notch受体(Notch2)。
[0091]在一些实施方案中，多能细胞包括，但不限于，胚胎干细胞(ESCs)、多潜能干细胞、极小胚胎样(VSEL)细胞、诱导多潜能干细胞(iPSCs)或以其它方式重新编程的体细胞、皮肤细胞、骨髓衍生细胞和外周血衍生细胞。
[0092]所述多能细胞可为任何哺乳动物多能细胞。多能细胞可来源于的哺乳动物包括，例如，农场动物，例如绵羊、猪、奶牛和马；宠物，例如狗和猫;实验室动物，例如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0093]用于卵巢组织中卵泡和未成熟卵母细胞的生长和成熟的方法
在一些实施方案中，使用人造颗粒细胞(即，通过上述方法产生的颗粒细胞和/或颗粒细胞前体)促进卵巢组织中卵泡、卵泡样结构和/或卵母细胞的生长和成熟。
[0094]在一些实施方案中，使卵巢组织与人造颗粒细胞群接触，其中人造颗粒细胞促进卵巢组织中卵泡、卵泡样结构和/或未成熟卵母细胞的生长和成熟。在一些实施方案中，与卵巢组织接触之后，人造颗粒细胞向卵巢组织中的卵泡、卵泡样结构和/或未成熟卵母细胞或卵母细胞前体细胞迀移以产生诱导卵泡和/或卵母细胞成熟的卵巢体环境。
[0095]在一些实施方案中，卵巢组织与人造颗粒细胞在体内接触。在一些实施方案中，体内给予包括，但不限于，局部注射(例如，导管给予或直接卵巢内注射)、全身性注射、静脉内注射、子宫内注射和胃肠外给予。在一些实施方案中，给予有需要的受试者所述人造颗粒。
[0096]举例来说，而非限制，在一些实施方案中，有需要的受试者为受孕困难、处于不育治疗中、处于体外受精中、治疗过癌症和经受过细胞毒治疗(例如，化学治疗或放射治疗)或其组合的受试者。
[0097]在一些实施方案中，卵巢组织与人造颗粒细胞离体接触。在一些实施方案中，离体接触包括，但不限于与完整的或离解的取出的卵巢组织聚集，和与卵巢组织共培养。在一些实施方案中，培养所述接触的离体卵巢组织，然后移植或植入受试者的卵巢或周围组织中。用于移植或植入的方法包括，但不限于，移入(engraftment)卵巢上、切开卵巢之后将组织注射或移入卵巢中和移入输卵管中。
[0098]在一些实施方案中，例如，在卵泡和/或卵母细胞生长和成熟后，将离体接触人造颗粒细胞的卵巢组织冷冻并储存。
[0099]卵巢组织可为任何哺乳动物卵巢组织。卵巢组织可来源于的哺乳动物包括，例如，农场动物，例如绵羊、猪、奶牛和马；宠物，例如狗和猫;实验室动物，例如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0100]在一些实施方案中，所述人造颗粒细胞和卵巢组织为自体的(来自同一个体)。在一些实施方案中，所述人造颗粒细胞和卵巢组织为异源的(同种异体的，来自不同个体)。
[0101]在一些实施方案中，人造颗粒细胞对卵巢组织中卵泡、卵泡样结构和/或未成熟卵母细胞或卵母细胞前体的生长和成熟的促进通过卵泡直径的增加、颗粒细胞数目的增加、类固醇激素产生的增加、卵母细胞直径的增加或其组合测量。
[0102]成熟卵泡或卵母细胞的直径因物种而异并且可由本领域技术人员鉴定，因为特定物种的成熟卵泡大小为本领域普遍知道的。举例来说，而非限制，在一些实施方案中，指示成熟或成熟中的卵泡的人卵泡的卵泡直径为大于约30 μπι的直径。或者，或此外，指示成熟或成熟中的卵泡的人卵泡的卵泡直径为约30 μπι-10,000 μπι、约50 μπι-5000 μπι、约100 μπι-2000 μπι、约200 μπι-1000 μπι、约300 μπι-900 μπι、约400 μπι-800 μπι或约500 μπι-700 μπι的直径。
[0103]举例来说，而非限制，在一些实施方案中，指示成熟或成熟中的卵母细胞的人卵母细胞的卵母细胞直径为大于约10 μπι的直径。或者，或此外，指示成熟或成熟中的卵母细胞的人卵泡中所包含的卵母细胞的直径为约10 μπ?-200 μπκ或约20 μπ?-175 μπκ或约30 μ??-150 ym、或约40 μηι-125 ym、或约50 μπι-100 ym、或约60 μηι-75 μπι的直径。
[0104]在一些实施方案中，卵巢组织中颗粒细胞数目的增加通过比较与人造颗粒细胞接触之前卵巢组织中的颗粒细胞数目和与人造颗粒细胞接触之后卵巢组织中的颗粒细胞数目来测量。或者，或此外，卵巢组织中颗粒细胞数目的增加通过将与人造颗粒细胞接触之后卵巢组织中的颗粒细胞数目和未与人造颗粒细胞接触的年龄匹配的卵巢组织比较来测量。
[0105]在一些实施方案中，与人造颗粒细胞接触的卵巢组织中颗粒细胞数目的增加测量为与，例如，与人造颗粒细胞接触之前的卵巢组织或未与人造颗粒细胞接触的年龄匹配的卵巢组织相比约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的百分比增加或这些值中任意两个之间的百分比增加。
[0106]通过人造颗粒细胞与卵巢组织接触产生的类固醇激素包括，但不限于，雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和孕酮。在一些实施方案中，与人造颗粒细胞接触的卵巢组织中产生的类固醇激素的增加测量为与，例如，与人造颗粒细胞接触之前的卵巢组织或未与人造颗粒细胞接触的年龄匹配的卵巢组织相比约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的百分比增加或这些值中任意两个之间的百分比增加。
[0107]用于产生包含成熟卵母细胞的成熟卵泡的离体和体内系统和方法离体和体内系统
在一些实施方案中，用于产生产生包含成熟卵母细胞的成熟卵泡的离体或体内人工卵巢环境的系统包括人造颗粒细胞(即，上述从多能细胞定向分化工程改造的颗粒细胞和/或颗粒前体细胞的任一)、卵母细胞前体细胞和卵巢组织。在一些实施方案中，所述人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织为自体的。在一些实施方案中，所述人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织为异源同种异体的。
[0108]在一些实施方案中，所述卵母细胞前体细胞从多能细胞或产卵母细胞的生殖系细胞工程改造。在一些实施方案中，用于产生卵母细胞前体细胞或卵母细胞的多能细胞包括，但不限于，胚胎干细胞(ESCs)、多潜能干细胞、诱导多潜能干细胞(iPSCs)或以其它方式重新编程的体细胞、极小胚胎样(VSEL)细胞、皮肤细胞、骨髓衍生细胞和外周血衍生细胞。在一些实施方案中，所述产卵母细胞的生殖系细胞包括，但不限于，原始生殖细胞、雌性生殖系干细胞(fGSCs)或卵原干细胞(OSCs)。从多能细胞或产卵母细胞的生殖系细胞工程改造卵母细胞前体可使用本领域普遍知道的任何方法进行。参见，例如,Hayashi等人，5fcie/3ce,338: 971-975 (2012) ;White等人，#aiure #ec/ici/3e 2012 18: 413-421(2012)。
[0109]在一些实施方案中，所述卵母细胞前体细胞包含至少一种遗传修饰。在一些实施方案中，所述遗传修饰发生在多能细胞中。在另一个实施方案中，所述遗传修饰发生在产卵母细胞的生殖系细胞中。不希望受理论束缚，多能细胞或产卵母细胞的生殖系细胞中的遗传修饰在整个分化中维持，因此结果是为遗传修饰的携带者的卵母细胞前体和/或最终地卵母细胞。在又一个实施方案中，所述遗传修饰发生在卵母细胞-前体细胞中。
[0110]多能细胞、产卵母细胞的生殖系细胞或卵母细胞-前体细胞的遗传修饰可通过本领域普遍使用的一种或多种技术进行。举例来说，而非限制，基因修饰技术包括，但不限于，电穿孔、直接注射编码mRNA、基于脂质的转染、逆转录病毒转导、腺病毒转导、慢病毒转导、CRISPR/Cas9、TALENs、锌指核酸酶(ZFNs)、经工程改造的大范围核酸酶和定点突变。参见，例如，Shao等人，iure Pro1cols, 9(10): 2493-2512 (2014年9月25 日)，Kato等人，Scientific Reports (2013年 11 月5日)，和Yang等人，7Vait/_re Protocols, 9(8): 1956-1968 (2014年7月24日)。
[0111]在一些实施方案中，所述遗传修饰导致由于遗传或表观遗传改变而减少或缺失的一个或多个丢失基因(或基因产物)恢复表达和/或校正现存基因突变或缺失。在一些实施方案中，丢失基因或减少或缺失的基因，或具有突变或缺失的基因，导致损伤或其它方面的负面影响生育结果相关的一个或多个事件，其包括，但不限于，受精、胚胎形成、胚胎发育、胚胎植入、胚胎妊娠至足月和/或无造成疾病或病症发作或易感性的基因突变(例如，功能的丧失或获得)的后代出生。在一些实施方案中，遗传修饰导致期需基因表达。
[0112]在一些实施方案中，人工卵巢环境系统离体形成和维持。在一些实施方案中，人工卵巢环境系统在体内形成和维持。
[0113]用于在离体或体内系统中制造成熟卵泡和成熟卵母细胞的方法
在一些实施方案中，通过在适合产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件下组合人造颗粒细胞(通过上述方法的任一制造)、卵母细胞前体细胞(通过上述方法的任一制造)和卵巢组织制造离体人工卵巢环境。可使用任何用于制造离体人工卵巢环境或使未成熟卵泡和卵母细胞成熟为成熟卵泡和卵母细胞的已知的方法和合适条件。参见，例如，Shea和Woodruff，WO 2007/075796; Albertini^PAkkoyunlu, Methods in Enzymology 426: 107-121(2010); Jin等人，FertiI Steril 93:2633-2639 (2010); White等}^,Nature Medicine18:413-421 (2012); Telfer和MacLaughlin, Int JDev B1l 56:901-907 (2012)。
[0114]在一些实施方案中，适合产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件包括存在生长因子。可用于产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的生长因子包括，但不限于，抑制素、激活素、GDF9、BMP15、IGF-1、胰岛素、亚砸酸盐和转铁蛋白。
[0115]或者，或此外，在一些实施方案中，适合产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件包括存在激素。可用于产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的激素包括，但不限于，卵泡刺激激素(FSH)和促黄体激素(LH)。
[0116]在一些实施方案中，将离体人工卵巢环境中产生的成熟卵泡和/或成熟卵母细胞注射、转移或以其它方式递送回受试者。
[0117]在一些实施方案中，离体人工卵巢环境中产生的成熟卵母细胞经受体外受精。在一些实施方案中，将在本技术的离体人工卵巢环境中所产生的体外受精的成熟卵母细胞注射、转移或以其它方式递送回受试者
在一些实施方案中，将离体人工卵巢环境中产生的成熟卵泡和/或成熟卵母细胞冷冻以供将来使用。在一些实施方案中，将在本技术的离体人工卵巢环境中所产生的体外受精成熟卵母细胞冷冻以供将来使用。
[0118]在一些实施方案中，通过将人造颗粒细胞(通过上述方法的任一制造)和卵母细胞前体细胞(通过上述方法的任一制造)注射入受试者的卵巢组织制造体内人工卵巢环境。
[0119]在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。哺乳动物受试者包括，但不限于，农场动物，例如绵羊、猪、奶牛和马；宠物，例如狗和猫;实验室动物，例如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0120]在一些实施方案中，在上述离体或体内系统中发育的成熟卵泡和/或成熟卵母细胞的用途为可用于提高生育力。
[0121]在一些实施方案中，在上述离体或体内系统中发育的成熟卵泡和/或成熟卵母细胞的用途为可用于减少遗传疾病和/或病症的遗传和/或用于减少疾病或病症的携带者流行。
[0122]在一些实施方案中，在上述离体或体内系统中发育的成熟卵泡和/或成熟卵母细胞的用途为可用作经历体外受精的雌性受试者的一个选择。
[0123]在一些实施方案中，在上述离体或体内系统中发育的成熟卵泡和/或成熟卵母细胞的用途为可用作治疗过癌症或经受过细胞毒治疗，例如化学治疗、放射治疗或二者的雌性受试者提高体外受精的一个选择。
[0124]在一些实施方案中，遗传修饰的卵母细胞前体细胞(如上文所述)仅与卵巢组织组合并在适合产生成熟卵泡和/或成熟卵母细胞的条件下离体培养。在一些实施方案中，将成熟卵母细胞冷冻以供后续使用，例如，IVF。在一些实施方案中，成熟卵母细胞不再携带遗传缺陷或表达期需基因。
[0125]用于增加受试者中卵巢衍生激素和生长因子的方法
在一些实施方案中，给予受试者有效量的人造颗粒细胞(即，上述从多能细胞的定向分化工程改造的颗粒细胞和/或颗粒前体细胞的任一)以增加卵巢-衍生激素和生长因子。
[0126]在一些实施方案中，人造颗粒细胞分泌卵巢-衍生激素和生长因子。或者，或此外，在一些实施方案中，人造颗粒细胞经一种或多种颗粒刺激剂刺激而分泌卵巢-衍生激素和生长因子。
[0127]人造颗粒细胞分泌的卵巢-衍生激素包括，但不限于，雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和孕酮。人造颗粒细胞分泌的卵巢-衍生生长因子包括，但不限于，激活素和抑制素。
[0128]在一些实施方案中，在给予受试者之前刺激人造颗粒细胞，S卩，离体刺激人造颗粒细胞以分泌卵巢衍生激素和生长因子。在一些实施方案中，在给予受试者之后刺激人造颗粒细胞，即，体内刺激人造颗粒细胞以分泌卵巢-衍生激素和生长因子。
[0129]颗粒刺激剂包括，但不限于，卵泡-刺激激素(FSH)、8_溴腺苷3’，5 ’ -环单磷酸酯(8-br-cAMP)和促黄体激素(LH)。
[0130]在一些实施方案中，人造颗粒细胞为受试者自体的(例如，衍生自受试者自身的多能细胞)。在一些实施方案中，人造颗粒细胞为受试者异源的(例如，衍生自另一个体的多能细胞)。
[0131 ]在一些实施方案中，受试者患有卵巢-衍生激素和生长因子分泌减少或缺乏。在一些实施方案中，卵巢-衍生激素和生长因子分泌减少或缺乏因绝经、卵巢切除术、子宫切除术、卵巢早衰、原发性卵巢功能不全、化学治疗-诱导的卵巢衰竭和/或特纳综合征所致。
[0132]在一些实施方案中，有需要的受试者中卵巢-衍生激素和生长因子的增加基于给予人造颗粒细胞之前受试者中的卵巢-衍生激素和生长因子水平与给予人造颗粒细胞之后受试者中的卵巢-衍生激素和生长因子水平之间的比较。
[0133]在一些实施方案中，受试者中卵巢-衍生激素和生长因子的增加基于同与受治疗的受试者性别和年龄匹配的并且未给予颗粒细胞或颗粒细胞前体的受试者中的卵巢-衍生激素和生长因子水平相比的给予人造颗粒细胞之后受试者中的卵巢-衍生激素和生长因子水平。
[0134]在一些实施方案中，给予颗粒细胞或颗粒细胞前体的受试者中产生的卵巢-衍生激素和生长因子的增加测量为与，例如，与人造颗粒细胞接触之前的受试者或未给予人造颗粒细胞的性别和年龄匹配的受试者相比约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的百分比增加或这些值中任意两个之间的百分比增加。
[0135]临床前试验和临床试验期间可通过医师和临床医师熟悉的方法确定人造颗粒细胞的有效量。可通过许多用于给予细胞的周知方法中的任一种给予有需要的受试者可用在本方法中的有效量的人造颗粒细胞。剂量和/或用量方案将取决于正在治疗的病况的特性，例如，受试者处于绝经期或是受试者做过子宫切除术，受试者，和受试者的历史。
[0136]可使用本领域技术人员已知的用于给予细胞作为疗法的任何方法。在一些实施方案中，人造颗粒细胞通过，例如，局部注射(例如，导管给予或直接卵巢内注射)、全身性注射、静脉内注射、子宫内注射和胃肠外给予来给予受试者。举例来说，而非限制，在一些实施方案中，将人造颗粒细胞前体直接注射入卵巢组织或卵巢中。
[0137]在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。哺乳动物受试者包括，但不限于，农场动物，例如绵羊、猪、奶牛和马；宠物，例如狗和猫;实验室动物，例如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些实施方案中，所述哺乳动物为人。
实施例
[0138]本实施例为本技术的使用的非限制性实现。
[0139]实施例1.老龄小鼠的卵巢中余留卵原干细胞(OSCs)
该实施例显示老龄(即，10个月或更大)小鼠的卵巢中余留卵原干细胞，本发明卵母细胞前体细胞的一个源。
[0140]材料与方法
用于流式细胞术的卵巢离解和制备oods^l ，Nature Protocols 8:966-988(2013)。将C57B1/6小鼠安乐死，摘除卵巢(每个年龄组4个卵巢)并放置在玻璃解剖盘中2ml 800 U/ml的IV型胶原酶中。将卵巢在胶原酶溶液中细细地切碎并在37 °C放置15分钟，温和地连续搅拌以产生单细胞悬液。用Hank缓冲盐水(HBSS)洗涤单细胞悬液，然后离心(300X g) 5分钟。丢弃上清液并将细胞沉淀重悬在由补充有正常山羊血清和牛血清白蛋白的HBSS组成的封闭溶液中。细胞悬液在封闭溶液中孵育30分钟。封闭后，向细胞悬液中加入兔抗-DDX4抗体(生殖细胞谱系特异性抗体)，并将细胞与抗体一起孵育30分钟。然后用HBSS洗涤细胞悬液，接着离心(300 X g) 5分钟。然后用荧光-缀合的(例如别藻蓝蛋白(APC)或异硫氰酸荧光素(FITC))山羊抗-兔二抗孵育细胞为流式细胞术做准备。用HBSS洗涤细胞悬液接着离心(300 X g) 5分钟以去除过量荧光-缀合的二抗。将标记的细胞悬液装载到流式细胞分析仪上，并通过荧光测定DDX4-阳性部分(OSCs)。记录阳性事件，并表述为总的活细胞群的%产率。
[0141]OSCs 游潜养杀烊。Woods 和 Ti I ly, Nature Protocols 8:966-988 (2013)。收集阳性DDX4-阳性细胞部分并放置在有利于卵原干细胞生长的培养条件中，所述培养条件包括小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层和补充有10%胎牛血清(FBS)、I mM丙酮酸钠、I mM非必须氨基酸、IX-浓缩的抗生素溶液、0.1 mM β-巯基乙醇、IX-浓缩的Ν-2补充剂、13单位/mlLIFao ng/ml表皮生长因子、I ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和40 ng/ml胶质细胞-衍生神经营养因子(GDNF)的生长培养基。通过收集培养上清和基于显微术检测卵母细胞监测OSCs向未成熟卵母细胞的自发分化。Woods和Tilly，Nature Protocols 8:966-988(2013)。
[0142]结果
如图1A中所示，卵原干细胞(OSCs)在老龄小鼠卵巢中存留，甚至在20个月大时包含卵母细胞的卵泡池完全衰竭后。图1B显示一旦从卵巢组织取出并离体培养，来自老龄雌性的OSCs保留形成未成熟卵母细胞的能力(与来自年轻雌性的OSCs相似)。这些结果显示卵原干细胞在高龄小鼠中存留并且来自老龄小鼠的细胞仍可形成未成熟卵母细胞。
[0143]实施例2.高龄小鼠中卵原干细胞(OSCs)向卵母细胞的分化减少该实施例显示高龄小鼠中的OSCs不再能促成新的卵母细胞和卵泡形成。
[0144]材料与方法
动物和处理表达由减数分裂定型基因的启动子驱动的受视黄酸基因8 (StraS;)刺激的绿色焚光蛋白(GFP)的转基因pStra8_Gfp小鼠如Imudia等人，Fertil Steril, 100:1451-1458 (2013)所描述而产生。具有受Stra8启动子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)表达的转基因小鼠通过用编码GFP-融合HSVtk的cDNA置换pStra8-Gfp构建体中的GFP-编码序列，然后将构建体送至Genoway用于产生转基因系而产生，如Imudia等人，Fertil Steril, 100: 1451-1458 (2013)所描述的。对于比较研究，平行使用来自繁殖群落的转基因同胞和野生型以排除背景品种对结果的任何潜在作用。对于处理，将HSVtk前药，更昔洛韦(GCV; Roche)以10 mg/ml溶解在无菌水中，然后在无菌IX-浓缩磷酸缓冲盐水(PBS)中稀释用于每日给剂(10 mg/kg持续21天，腹膜内注射)。对照动物平行注射溶媒(PBS)0
[0145]妙母激PBS或GCV注射开始之前，用GCV每日给剂21天后和停止GCV处理21天后，从标明年龄的小鼠收集卵巢，固定，石蜡包埋，并连续切片用于基于组织形态测定法定量包含卵母细胞的原始卵泡的数目，如(Jones和Krohn, J Endocrinol, 21:469-495(1961); Johnson 等人，Nature，428: 145-150 (2004);以及 Wang 和Ti I Iy，CellCycle, 9:339-349 (2010))中所详述的。以全盲的方式评估所有样品，用第二个观察者随机选择的载玻片独立地确认重现性。在所有情况下，观察者之间的计数变化小于7%。
[0146]结果
如图2A-B和2D中所显示的，年轻的成年小鼠，S卩，2-3个月大，和中年成年小鼠，S卩，5-6个月大，因GCV处理21天而暂时中断OSC向新卵母细胞分化导致因卵母细胞输入失败所致的减少的原始卵泡存留。然而，停止GCV处理的21天中原始卵泡池恢复回对照(PBS，溶媒)水平。GCV暴露和移除可逆地中断卵子发生的能力随雌性年龄而逐渐丧失(参见图2A-D)。高龄小鼠，即，I O-11个月大，变得对GCV处理完全不起反应(ref rac tory )(图2C，2D)，表明到了这一年龄OSCs不再能为卵泡的卵巢池贡献新的卵母细胞。
[0147]在小鼠中，不迟于10-11个月大，OSCs支持新卵母细胞和卵泡产生的能力完全丧失。然而，如实施例1中所显示的，在这一(以及远远超出的)年龄卵巢中仍然存在OSCs，表明老龄小鼠卵巢，在约实足生命期的一半时(about halfway through chronologicallifespan)，不能为OSCs提供新卵母细胞和卵泡形成所需的所有“因子”。
[0148]实施例3幼年小鼠卵巢组织-衍生细胞的移植拯救老龄小鼠中的卵母细胞和卵泡形成
该实施例显示来自幼年小鼠的高度富集颗粒细胞或其前体的分散的卵巢组织，可支持卵泡重新形成并增加老龄动物中存在的原始卵泡的数目。
[0149]材料与方法
用于注射的组织的制备。hk劫年CblRl/& (野生型)供体小鼠收集卵巢组织，使用IV型胶原酶以温和搅拌裂解为单细胞悬液。用HBSS洗涤分散的卵巢组织，接着离心(300 X g) 5分钟以去除胶原酶。然后重悬细胞沉淀并装载到微量移液器中准备卵巢内注射。
[0150]//y桌片注與含有由其中删除近侧增强子的经修饰的Pou5fl (也称为0ct4)启动子驱动的生殖系-特异性绿色荧光蛋白转基因(APE-0ct4-GFP)的10个月大的雌性小鼠麻醉并手术暴露卵巢，包括暂时移除卵巢囊。将包含野生型供体细胞悬液的微量移液器放置到暴露的卵巢中，注射包含卵巢体细胞的细胞悬液。然后复位卵巢囊，并让卵巢安放入体腔。钉上(s tap I ed)或缝合手术部位，并让受体小鼠恢复I周。
[0151]卵母细胞计数卵巢内移植I周后，将小鼠安乐死，收集卵巢并固定在4%的多聚甲醛中。将卵巢石蜡包埋，连续切片，安装在载玻片上并在二甲苯中脱蜡，接着分级的乙醇系列中水合。通过让载玻片在柠檬酸钠(pH 6.0)中煮沸5 min进行抗原恢复，接着在TNK缓冲液(0.1 M Tris, 0.55 M NaCl, 0.1 mM KCl, 1% 山羊血清，0.5% 牛血清白蛋白和0.1%Triton-X/PBS)中封闭，并然后用抗-GFP抗体接着二抗和用于信号检测的色原孵育。视觉检查每一切片的卵泡中所包含的GFP-阳性卵母细胞的存在并通过计数定量非-闭锁静止(原始)、早期生长(小，窦前)和窦卵泡。卵泡数目的比较在接受供体卵巢组织的动物和接受模拟注射的对照动物之间进行。
[0152]结果
如图3中所示，接受包含大量体颗粒细胞的来自年轻供体的离解的卵巢组织-衍生细胞卵巢内移植的生育上老龄的(reproductively aged)雌性小鼠(每对柱中的右侧柱)，在移植I周内与非移植对照(每对柱中的左侧柱)相比受体原始卵泡池增加将近2倍。
[0153]这些结果表明从富含卵泡体颗粒细胞的源移植的卵巢体细胞与内源OSCs—起工作使老龄卵巢中能够重新形成卵泡。这些数据，与表明在老龄卵巢中存留OSCs，而没有颗粒细胞的证据组合，表明卵巢颗粒细胞或其前体的可用性代表OSC形成新卵母细胞和卵泡的关键限速步骤。因此，本技术的人造颗粒细胞可用于拯救或诱导卵泡形成。
[0154]实施例4卵原干细胞(OSCs)在近绝经期和绝经后的人卵巢中存留
该实施例显示近绝经期和绝经后妇女的卵巢中存在OSCs并且来自绝经后人卵巢的OSCs保留离体形成卵母细胞的能力。
[0155]材料与方法
屑f薇式激溆木游鹿鬆游歡备。将来自去-识别的年龄在22-58岁的女性患者的卵巢皮质放置在400 U/ml IV型胶原酶中用于在机械组织离解器(实例包括GentleMACS或其它用于一致机械分散的装置)中使用以产生单细胞悬液。用Hank缓冲盐水溶液(HBSS)洗涤单细胞悬液，接着离心(300 X g) 5分钟。丢弃上清液并将细胞沉淀重悬在由补充有正常山羊血清和牛血清白蛋白的HBSS组成的封闭溶液中。细胞悬液在封闭溶液中孵育30分钟。封闭后，向细胞悬液中加入兔抗-DDX4抗体(生殖细胞谱系特异性抗体)，并将细胞与抗体一起孵育30分钟。然后用HBSS洗涤细胞悬液，接着离心(300 X g) 5分钟。然后用荧光-缀合的(例如别藻蓝蛋白(APC)或异硫氰酸荧光素(FITC))山羊抗-兔二抗孵育细胞为流式细胞术做准备。用HBSS洗涤细胞悬液接着离心(300 X g) 5分钟以去除过量荧光-缀合的二抗。将标记的细胞悬液装载到流式细胞分析仪上，并通过荧光测定DDX4-阳性部分(OSCs)。记录阳性事件，并表述为总的活细胞群的％产率。Woods和Tilly，Nature Protocols 8:966-988(2013)。
[0156]0?&游潜养杀烊。收集流式细胞术之后获得的DDX4-阳性细胞部分并放置在有利于卵原干细胞生长的培养条件中，所述培养条件包括小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层和补充有10%胎牛血清(FBS )、I mM丙酮酸钠、I mM非必需氨基酸、IX-浓缩的抗生素溶液、0.1mM β_巯基乙醇、IX-浓缩的N-2补充剂、13单位/ml LIFUO ng/ml表皮生长因子、I ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和40 ng/ml胶质细胞-衍生神经营养因子(GDNF)的生长培养基。通过收集培养上清液和基于显微术检测卵母细胞监测人OSCs向未成熟卵母细胞的自发分化。Woods和Tilly，Nature Protocols 8:966-988 (2013)。
[0157]结果
如图4A-B所显示的，OSCs在高龄妇女的卵巢中存留，甚至在绝经后的生命中包含卵母细胞的卵泡池完全衰竭后(参见图4A)。从绝经后人卵巢取出并在体外培养的OSCs仍可分化成未成熟卵母细胞(参见图4B)。
[0158]这些结果显示来自老年人卵巢的OSCs仍可在体外制造卵母细胞，但老年妇女的卵巢内环境不能支持新的卵母细胞和卵泡从这些细胞形成。因此，向已经不能支持新卵母细胞和卵泡产生的人卵巢组织中引入纯化的OSCs将不能产生新的未成熟卵母细胞或卵泡。这些结果显示本技术的人造颗粒将可用于在人类中支持和形成新的卵母细胞和卵泡。
[0159]实施例5从多能细胞衍生的颗粒细胞产生卵巢类固醇激素
该实施例显示从多能细胞分化的颗粒细胞产生形成成熟卵泡和支持未成熟卵母细胞成熟所需的卵巢类固醇激素。
[0160]材料与方法
为了鉴定和跟踪分化ESC培养物中的卵巢体细胞，绘制了早期颗粒细胞标志，Foxl2,在分化ESC培养物中的表达。绘图显示FoWJ?基因在第5天激活。使用Genome Vista鉴定了FOX12S因启动子的739 bp区域。从小鼠基因组DNA分离该区域并克隆入pDsRed2-1载体(Clontech, Mountain View, CA,)或包含DsRed的完整开放阅读框的pLenti6慢病毒构建体(Gateway Lentiviral System; Invitrogen)，因此创建在基因启动子控制下的DsRed表达载体。
[0161 ] 使用小鼠颗粒细胞作为阳性对照和293细胞(Invitrogen)作为阴性对照验证启动子活性和特异性。为了验证FoWJ?基因启动子-驱动的DsRed表达，将未分化的Tg0G2 ESCs用Fo;^2-pDsRed2-l构建体经由电穿孔稳定转染，接着克隆选择和扩大。或者，ESCs在分化开始之后使用转染/7OZ以-DsRed慢病毒构建体(pLenti6-Fo;r以-DsRed)的293细胞所产生的病毒上清液病毒转导。通过荧光显微术分析细胞的DsRed表达并通过荧光激活细胞分选(FACS)分呙。
[0162]对于FACS，通过0.25%胰蛋白酶-EDTA (分化第1天之前)或手动刮除从板上移除分化的ESCs。细胞然后在温和分散下用800 U/ml IV型胶原酶(Worthington，Lakewood,NJ)孵育15分钟，接着用0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育10分钟以获得单细胞悬液(分化第10天之后)。用于FACS的细胞通过重悬在Ix-浓缩的包含0.1%FBS的磷酸缓冲盐水(PBS)中并过滤(35-μπι孔径)而制备。使用FACS Aria流式细胞分析仪(BD B1sciences, San Jose, CA)分析和分选细胞。
[0163]测量来自已经再铺板并在PBS (溶媒)、100 ng/ml卵泡刺激激素(FSH; NIDDK,NIH, Bethesda, MD)或I mM 8_溴腺苷_3’，5’_环单磷酸酯(8_br_ cAMP; Sigma-Aldrich)存在下培养24、48或72小时的FACS-纯化的Foj^tDsRed-阳性细胞的培养基中的雌二醇和孕酮浓度。芳构化至雌激素所必需的雄激素底物通过所有培养物中热灭活的15% FBS的存在提供，其包含0.92 pg/ml雄激素((检验的56批FBS的平均值)。雌二醇ELISA来自Alpco(Salem, NH)，孕酮ELISA来自DRG国际(Mountainside，NJ)。所有的测定均按照制造商的指南进行。
[0164]结果
ESC分化第12天分离的DsRed-阳性细胞次培养之后对类固醇产生的评估显示在培养基中存在雌二醇和孕酮二者(图5A-5B)。另外，用FSH或8-br- cAMP处理导致雌二醇产生的显著增加，证实了这些细胞中与类固醇产生偶联的cAMP-介导的信号传导和功能性FSH受体的存在。然而，仅8-br- cAMP能够显著提高孕酮产生(图5B)。
[0?05]这些结果显示允许多能干细胞培养物自发分化导致小量表达细胞自发出现。这些细胞表现出内源颗粒细胞在发育卵巢卵泡中的两个主要功能属性:FSH-响应性和类固醇产生能力。这些结果表明本技术的人造颗粒细胞包含发育卵巢卵泡的功能属性。因此，本技术的人造颗粒可用于离体或体内形成卵泡，其帮助产生成熟卵泡和卵母细胞。
[0166]实施例6颗粒细胞的卵巢内移植
该实施例显示从多能细胞衍生的颗粒细胞向新生(neo-natal)卵巢中的未成熟卵母细胞和发育中的卵泡迀移。
[0167]材料与方法
下列实验中使用野生型C57BL/6雌性小鼠(Char I e s River Laboratories,Wilmington, MA, USA)。
[0168]F0JrM-DsRed-表达ESCs分化12天之后，使用FACS分离DsRed-阳性细胞(对于形成FojrM-DsRed-表达ESCs的描述参见实施例5)。对于每个实验，使用Pneumatic PicoPump(World Precis1n Instruments, Sarasota, FL)将200-500 DsRed-阳性细胞微注射入单个新生(产后2-4天)野生型小鼠卵巢中(图6A-6B)。然后将注射的卵巢移植至6周大的卵巢切除的野生型雌性小鼠的肾囊下。移植8天和2周后，取出移入的卵巢并在4%多聚甲醛(PFA)中固定用于分析。
[0169]将固定的卵巢石蜡包埋，连续切片，安装在载玻片上并在二甲苯中脱蜡，接着在分级的乙醇系列中水合。通过让载玻片在柠檬酸钠(pH 6.0)中煮沸5 min进行抗原恢复，接着在TNK缓冲液(0.1 M Tris, 0.55 M NaCl, 0.1 mM KCl, 1%山羊血清，0.5%牛血清白蛋白和0.1 % Triton-X/PBS)中封闭，用期需的一抗(1: 100稀释)4 °C孵育过夜，荧光-缀合的二抗(1:250稀释，Alexa Fluor-488或-568 ; Invitrogen) 20°C孵育I小时。使用的一抗为来自Serotec的小鼠抗-Dazl抗体(MCA2336 ; Raleigh, NC)和来自Abcam的用于检测DsRed的兔抗-RFP抗体(ab62341; Cambridge, MA)。荧光图像分析使用Nikon Eclipse TE2000-S倒置焚光显微镜和SPOT成像软件(Diagnostic Instruments)进行。
[0170]结果
在注射从分化12天后的ESC培养物分离的/^dZ-DsRed-表达细胞之前野生型新生卵巢显示无DsRed (图6A)。在注射从分化12天后的ESC培养物分离的F0WJ?-DSRed-表达细胞后，野生型新生卵巢显示DsRed (图6B)。
[0171 ]移植8天时，发现DsRed-表达细胞遍布于注射卵巢的间质。许多这些细胞被观察到与未成熟卵母细胞紧紧相邻，如对DsRed和卵母细胞标志Dazl (在无精症-样中缺失)双重免疫荧光染色所指示的(图6C)。移植14天时，DsRed-表达细胞在间质中不再观察到而是仅在生长卵泡的颗粒层中专有地检测到(图6D)。
[0172]这些结果显示颗粒细胞和颗粒细胞前体自然向发育中的卵泡或未成熟卵母细胞迀移。因此，本技术的人造颗粒可用于促进卵泡、卵泡样结构和未成熟卵母细胞的生长和成熟。
[0173]实施例7离体人卵巢皮质条支持卵泡发育
该实施例显示微薄(microthin)卵巢皮质条在体外可维持卵泡形成、生长和成熟。
[0174]材料与方法
皮廣"条潜养。将年轻成年人卵巢组织切成微薄条(2 mm X 2 mm X I mm)并在无血清培养基中37°C孵育多达21天以观察原始卵泡形成和随后激活至第一生长(初级)阶段，接着生长和成熟至多层(次级)阶段。
[0175]妙/—分#。收集皮质条并在4%多聚甲醛中固定。将固定的条石蜡包埋，连续切片，安装在载玻片上并在二甲苯中脱蜡，接着在分级的乙醇系列中水合。通过让载玻片在柠檬酸钠(pH 6.0)中煮沸5 min进行抗原恢复，接着在TNK缓冲液(0.1 M Tris, 0.55 MNaCl, 0.1mMKCl，1%山羊血清，0.5%牛血清白蛋白和0.1% Triton-X/PBS)中封闭，然后用卵母细胞特异性抗体(对于本实施例，我们使用抗-DDX4)接着荧光-缀合(例如异硫氰酸荧光素(FITC)) 二抗孵育以允许鉴定卵母细胞。
[0176]结果
如图7A中所示，可通过光学显微术在离体培养两周的人卵巢皮质条中可视化生长中的卵泡。如图7B中所示，离体培养14天后通过DDX4免疫荧光对卵巢皮质组织中卵母细胞的评估显示许多原始和初级卵泡。右侧面板，培养的人卵巢皮质组织中检测到若干多层(通过围绕位于中央的卵母细胞的多层颗粒细胞指示)或次级卵泡。
[0177]结果显示，未成熟卵母细胞和卵泡的发育，如围绕生长中的卵母细胞的积极扩展的颗粒细胞层所指示，受离体年轻成年卵巢环境支持。
[0178]实施例8未成熟卵母细胞在体外向有能力受精阶段的成熟
该实施例显示从成年牛卵巢皮质条中所包含的窦前和早期窦阶段卵泡收集的颗粒/卵丘细胞复合体中包含的未成熟卵母细胞离体可成熟至发育的中期II (MII)阶段。
[0179]材料与方法
从直径小于2 mm (未成熟，窦前阶段)或直径大于3 mm (更成熟，早期窦阶段)的卵泡收集牛颗粒细胞/卵丘细胞-卵母细胞复合体并放置入成熟培养基中38.5°C持续21-24小时以诱导体外成熟(IVM)。通过视觉检查第一极体伸出评估向中期II (MII)阶段(完全成熟的卵)的成熟。
[0180]结果
如图8A中所显示的，卵母细胞能够成熟至中期II，如通过第一极体的伸出(极体伸出用箭头突出显示)所测定的。发现卵母细胞分别以77.8%和68.8%的比率从〈2 mm和>3 mm的卵泡直径组成熟至发育的MII期(卵阶段)(图SB)。
[0181]这些结果显示通过从卵巢皮质条中存在的非常小的窦前阶段卵泡分离的颗粒-卵母细胞复合体的体外成熟可以以非常高的成功程度获得完全成熟的MII卵。
[0182]等价物
本技术不限制于此申请中所描述的具体实施方案，所述实施方案意在作为本技术个别方面的单个的说明。可对本技术作出许多修饰和变更而不脱离其精神和范围，如对本领域技术人员将显而易见的。除了本文列举的那些之外，本技术范围内的功能上等价的方法和装置对于本领域技术人员而言将从前述说明显而易见。这样的修饰和变更意在落入所附权利要求的范围内。本技术仅受所附权利要求的条款，连同这些权利要求所具有的权利的等价物的全部范围限制。应理解的是本技术不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，这些毫无疑问可以不同。还应理解的是本文所使用的术语仅为了说明具体实施方案的目的，并且不意在限制。
【主权项】
1.用于多能细胞向颗粒细胞和/或颗粒前体细胞定向分化的方法，包括:在将所述多能细胞定向至分化为颗粒细胞和/或颗粒前体细胞的培养条件中培养多能细胞，其中所述培养条件包括缺乏MEFs和LIF，不存在或存在GSK抑制剂。2.权利要求1的方法，其中所述培养条件进一步包括存在骨形态发生蛋白(BMP4)和/或视黄酸(RA)。3.权利要求1的方法，其中所述多能细胞包含颗粒细胞特异性受体，其中所述颗粒细胞特异性受体的表达指示为颗粒细胞或颗粒细胞前体的细胞。4.权利要求1的方法，其中所述GSK-3抑制剂选自SB216763、B10、CHIR99021、氯化锂(LiCl)、马来酰亚胺衍生物、星形孢菌素、吲哚衍生物、paullone衍生物、嘧啶和氟嘧啶衍生物、噁二唑衍生物、噻唑衍生物、杂环衍生物及其组合。5.权利要求1的方法，进一步包括使所述多能细胞与用于颗粒细胞特化的信号传导通路的激活剂或生长因子接触。6.权利要求5的方法，其中所述用于颗粒细胞特化的信号传导通路的激活剂或生长因子为bFGF、Jaggedl或Jagged2的一种或多种。7.用于多能细胞向颗粒细胞和/或颗粒前体细胞定向分化的方法，包括: 在将所述多能细胞定向为颗粒细胞和/或颗粒前体细胞的培养条件中培养多能细胞，其中所述条件包括缺乏MEFs和LIF，不存在或存在GSK抑制剂，其中所述多能细胞经工程改造以包含一个或多个可诱导的颗粒细胞-特异性基因； 诱导所述一个或多个卵巢颗粒细胞-特异性基因表达;和 形成人造颗粒细胞。8.权利要求7的方法，进一步包括在骨形态发生蛋白(BMP4)和/或视黄酸(RA)存在下培养所述多能细胞。9.权利要求7的方法，其中所述多能细胞包含颗粒细胞特异性受体，其中所述颗粒细胞特异性受体的表达指示为颗粒细胞或颗粒细胞前体的细胞。10.权利要求7的方法，其中所述一个或多个可诱导的颗粒细胞-特异性基因选自叉头框L2 (Foxl2)、无翅型MMTV整合位点家族成员4 (WNT4)、Nr5al、Dax_l、ATP_结合盒亚家族9(Abca9)、乙酰辅酶A酰基转移酶2 (线粒体3_氧代酰基-辅酶A硫解酶;Acaa2)、主动脉平滑肌肌动蛋白a2 (Acta2)、具有I型凝血酶基序的解联蛋白-样和金属肽酶(reprolysin-样)17 (Adamtsl7)、ADAMTS-样 2 (Adamtsl2)、AF4/FMR2 家族成员 I (Affl)、表达序列 AI314831(AI314831)、醛-酮还原酶家族I成员C14 (Akrlcl4)、醛-酮还原酶家族I Notch2和成员C-样(Akrlcl) ο11.一种离体人工卵巢环境，包括: 人造颗粒细胞，其中所述人造颗粒细胞使用权利要求1-10中任一项的方法产生； 卵母细胞前体细胞;和 卵巢组织。12.权利要求11的离体人工卵巢环境，其中所述人造颗粒细胞、所述卵母细胞前体细胞和卵巢组织为自体的。13.制造成熟卵泡和成熟卵母细胞的方法，包括: 使用权利要求1-10中任一项的方法使多能细胞定向分化为颗粒细胞和/或颗粒前体细胞(人造颗粒细胞); 使所述人造颗粒细胞与卵母细胞前体细胞和卵巢组织组合;和 在适合形成所述成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件下培养人造颗粒细胞与卵母细胞前体细胞和卵巢组织的组合。14.权利要求13的方法，其中所述适合形成成熟卵泡和成熟卵母细胞的培养条件包括存在卵泡刺激激素(FSH)和/或促黄体激素(LH)。15.用于在有需要的受试者中生长和成熟卵巢组织中的卵泡和未成熟卵母细胞的方法，包括使卵巢组织与人造颗粒细胞接触，其中所述人造颗粒细胞由权利要求1-10中任一项的方法制备。16.权利要求15的方法，其中所述人造颗粒细胞与所述卵巢组织在体内接触。17.权利要求16的方法，其中将所述人造颗粒细胞直接注射入所述受试者的卵巢组织中。18.权利要求15的方法，其中所述有需要的受试者患有一种或多种以下问题，所述问题选自受孕困难、处于不育治疗中、处于体外受精中、治疗过癌症和经受过细胞毒治疗。19.用于增加有需要的受试者中的一种或多种卵巢衍生的激素和生长因子的水平的方法，所述方法包括: 使用权利要求1-10中任一项的方法使多能细胞定向分化为颗粒细胞和/或颗粒前体细胞(人造颗粒细胞); 基于颗粒细胞特异性受体的表达分离富集的人造颗粒细胞群;和 给予所述受试者有效量的富集的人造颗粒细胞群，其中所述颗粒细胞或颗粒细胞前体分泌一种或多种卵巢衍生的激素和生长因子，并且其中与给予富集的人造颗粒细胞群之前的受试者相比给予所述人造颗粒细胞之后所述受试者显示提高的一种或多种卵巢衍生的激素和生长因子的水平。20.权利要求19的方法，进一步包括刺激所述人造颗粒细胞以分泌卵巢衍生的激素和生长因子。21.权利要求19-21的任何方法，其中所述卵巢衍生的激素选自:雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和孕酮。22.权利要求21的方法，其中所述颗粒细胞或颗粒细胞前体用卵泡-刺激激素(FSH)、8_溴腺苷3’，5’_环单磷酸酯(8-br-cAMP)和促黄体激素(LH)刺激以分泌卵巢衍生的激素和生长因子。23.权利要求22的方法，其中所述人造颗粒细胞群为所述受试者自体的。24.权利要求23的方法，其中所述受试者为人类。25.用于产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的离体方法，包括: 组合人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织;和 在足以产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件下培养人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织的组合，其中所述人造颗粒细胞由权利要求1-10中任一项的方法制备并且其中所述人造颗粒细胞、所述卵母细胞前体细胞和所述卵巢组织为自体的。26.权利要求25的方法，其中所述卵母细胞前体细胞衍生自多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞(OSCs)。27.权利要求25的方法，其中所述卵母细胞前体细胞为原始生殖细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞。28.权利要求26的方法，其中所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞经遗传修饰以校正基因缺陷或表达期需基因。29.权利要求28的方法，其中所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞使用选自电穿孔、直接注射编码mRNA、基于脂质的转染、逆转录病毒转导、腺病毒转导、慢病毒转导、CRISPR/Cas9、TALENs、锌指核酸酶(ZFNs)、经工程改造的大范围核酸酶和定点突变的一种或多种技术遗传修饰。30.用于为诊断有遗传疾病的受试者开发遗传修饰的成熟卵母细胞的方法，包括: 遗传修饰来自受试者的多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞以校正基因缺陷； 在足以产生卵母细胞前体细胞的条件下培养所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞； 组合所述卵母细胞前体细胞与人造颗粒细胞和卵巢组织，其中所述人造颗粒细胞由权利要求1-10中任一项的方法制备并且其中所述人造颗粒细胞和卵巢组织为所述受试者自体的;和 在足以产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件下培养人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织的组合，其中所述成熟卵母细胞不携带所述遗传疾病。31.权利要求30的方法，其中所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞使用选自电穿孔、直接注射编码mRNA、基于脂质的转染、逆转录病毒转导、腺病毒转导、慢病毒转导、CRISPR/Cas9、TALENs、锌指核酸酶(ZFNs)、经工程改造的大范围核酸酶和定点突变的一种或多种技术遗传修饰。32.用于离体产生成熟卵母细胞的方法，包括: 组合人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织;和 在足以产生成熟卵泡和成熟卵母细胞的条件下培养人造颗粒细胞、卵母细胞前体细胞和卵巢组织的组合，其中所述人造颗粒细胞由权利要求1-10中任一项的方法制备并且其中所述人造颗粒细胞、所述卵母细胞前体细胞和所述卵巢组织为自体的。33.权利要求32的方法，其中所述卵母细胞前体细胞衍生自多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞。34.权利要求32的方法，其中所述卵母细胞前体细胞为原始生殖细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞。35.权利要求33的方法，其中所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞经遗传修饰以校正基因缺陷或表达期需基因。36.权利要求35的方法，其中所述多能细胞、雌性生殖系干细胞或卵原干细胞使用选自电穿孔、直接注射编码mRNA、基于脂质的转染、逆转录病毒转导、腺病毒转导、慢病毒转导、CRISPR/Cas9、TALENs、锌指核酸酶(ZFNs)、经工程改造的大范围核酸酶和定点突变的一种或多种技术遗传修饰。37.权利要求32的方法，进一步包括冷冻所述成熟卵母细胞。
【文档编号】C12N5/02GK105916977SQ201480066902
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年10月7日
【发明人】J.L.蒂利, D.C.伍兹
【申请人】东北大学