专利名称：ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法
技术领域：
本发明涉及一种激活素A(ActA)促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，特别是涉及一种将12. 5dpc (交配后的天数)减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成生发泡(GV)期卵母细胞并诱导成熟，利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，获得早期发育的体外受精后代的方法。属于生殖医学的生物医学技术领域。
背景技术：
在先前的研究中，来源于小鼠减数分裂前的生殖细胞不能恢复减数分裂并发育到MII期。在雌性小鼠胚胎中，13. 5dpc生殖细胞经历了进一步的DNA复制，并且进入第一次减数分裂的前期。然而，来源于胎儿生殖细胞的卵母细胞体外生长仅仅能进入到第一次减数分裂的双线期，并停滞在这一时期。研究人员发现，小鼠11. 5 12. 5dpc的生殖嵴分离获得的PGCs在没有体细胞的支持下不能存活，而是快速的凋亡，而利用小鼠胎儿肺细胞与生殖细胞聚合后体外培养，生殖细胞可以像在卵巢里的发育进程一样进入第一次减数分裂。如果进入雌性生殖嵴的生殖细胞数量过少，颗粒细胞的分化可以被启动，但是很快就失去了分化能力，卵母细胞也随后死亡或数量减少。卵母细胞与颗粒细胞间的的互作是双向的，这种互作调控了这两种类型细胞的发育，它不仅是卵母细胞发育必需的，也是卵泡发育所必需的，从原始卵泡的形成到成熟卵泡的排卵始终都有互作的存在。最近，科学家建立了一种生殖细胞与体细胞的共培养方法，并结合KITL、bFGF和LIF等因子的作用，可以使从雌性胎鼠生殖嵴中分离出来的PGC体外发育到卵母细胞第一次减数分裂的双线期，但这种卵母细胞不能成熟和受精。Obata和Niwa等利用12. 5dpc胎鼠完整的卵巢进行体外培养观山但获得的卵母细胞不能完成第二次减数分裂。可能是多种因素制约了卵母细胞的体外发生。一种原因可能是卵母细胞核、质发育不同步，而核质同步发育成熟又是卵母细胞恢复减数分裂成熟必需的。另一方面，卵泡颗粒细胞与卵母细胞间的间隙连接也影响着卵母细胞的发育，间隙连接形成不完全会阻碍卵母细胞的减数分裂恢复。还有一种原因就是体外发育的卵母细胞不能达到最大直径的80%，而这是卵母细胞成熟发育所需的。利用生殖细胞体外培养的方法难以克服这些问题，因为至今对卵母细胞生长、卵泡内颗粒细胞与卵母细胞间隙连接的形成、卵母细胞的减数分裂启动等调控机理知之甚少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法。为了实现上述发明目的，本发明利用机械法分离12. 5dpc雌性胎鼠生殖嵴，体外培养胎鼠生殖嵴后收集卵母细胞，将12. 5dpc减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成GV期卵母细胞并诱导成熟，得到成熟的卵母细胞；并利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，可获得早期发育的体外受精后代。所述胎鼠生殖嵴的分离按照如下步骤操作胎鼠卵巢来源于12. 5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以见栓为0.5dpc。出生后小鼠的卵巢来源于12 14dpp的小鼠。利用机械分离法从胎鼠体内分离出卵巢，并转移到磷酸盐缓冲液(PBS)+10% FCS的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与卵巢连接在一起的中肾组织，在新鲜培养液(密理博高糖培养基(α-MEM) ；5%胎牛血清(FCS) ；丙酮酸钠；青链霉素；IOmIU促卵泡素(FSH)) 中将卵巢洗3次。所述胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作生殖嵴分离出来培养的当天定为 0天。分离出的12. 5dpc胎鼠生殖嵴，一分为二，并在培养液中贴壁培养观天。组织在37°C、 5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，换液时观察卵母细胞的发育情况等。此处所用的培养基分为两种培养液，培养液的配方如下培养液培养液A包含密理博高糖培养基(α -MEM) ； 10%胎牛血清(FCS) ； 1 %丙酮酸钠；青链霉素；IOmIU促卵泡素(FSH) ；lOOng/ml激活素A(ActA)；培养液B包含 α-MEM FCS 胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物(ITS-mix) ；1 %丙酮酸钠；1 %青链霉素；100mIU/ml FSH ； lng/ml 上皮生长因子(EGF) ； 100ng/ml ActA0所述卵母细胞的收集按照如下步骤操作收集添加ActA体外培养到28天的小鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，0. 25%胰酶(Gibco-BRL)，0. 2%胶原酶IV(Gibco-BRL)和 0. 02% DNAse-I (Sigma)消化，37°C处理lOmin。加入胶原酶等体积的胎牛血清终止消化，洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液(PBS)中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞，根据试验需要将收集的卵母细胞进行分类。所述卵母细胞的培养及成熟诱导按照如下步骤操作使用口吸管吸出卵母细胞， 然后挑出直径在75 μ m以上的卵母细胞，每个液滴20个卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上(12 14dpp腔前卵泡颗粒细胞收集后放入提前做好的培养液滴中。6cm培养皿，每个液滴100 μ 1，37°C，5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜)，进行共培养。此处培养卵母细胞分为对照组和实验组，对照组和实验组培养液的配方如下对照组培养液α-MEM ； 10% FCS ； 1 % ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ；EGF 5ng/ml ；1% 丙酮酸钠；青链霉素。实验组培养液α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ；EGF 5ng/ml ；ActA 100ng/ml ； 丙酮酸钠；青链霉素。共培养7天后，取出卵母细胞，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前做好的成熟培养液培养滴中(6cm培养皿，每个液滴ΙΟΟμ 1，37°C，5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜)，在37°C，5% CO2，饱和湿度的培养箱里培养18h，统计卵母细胞成熟的比例。成熟培养液的配方如下成熟培养液α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 100mIU/ml ；EGF lng/ml ； 丙
酮酸钠；青链霉素。本发明方法建立了 ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，将从理论上探索原始生殖细胞的体外发生与卵泡的体外发育的细胞分子机制，并为卵巢性不孕症病人提供优质的卵母细胞，创造巨大的社会和经济价值。
图1为12. 5dpc胎鼠生殖嵴的分离显微图。图2为小鼠卵巢卵母细胞的体外发生过程显微图。图3为卵母细胞数量和直径统计图。图4为体外发生的卵巢卵母细胞的成熟显微图。图5为来源于12. 5dpc胎鼠卵巢卵母细胞体外培养得到的卵母细胞质量的检测图。图6为小鼠不同时期卵母细胞纺锤体的检测图。图7为胎鼠卵巢卵母细胞发育成熟后支持胚胎发育到期图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明方法做进一步阐述。实施例1、(一 )材料与方法1胎鼠生殖嵴的分离胎鼠卵巢来源于12. 5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以见栓为0. 5dpc。出生后小鼠的卵巢来源于12 14dpp的小鼠。利用机械分离法从胎鼠体内分离出卵巢，并转移到磷酸盐缓冲液(PBS，pH = 7. 2)+10%胎牛血清(FCS)的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与卵巢连接在一起的中肾组织，在新鲜培养液(密理博高糖培养基(α-ΜΕΜ， HyClone公司)；5%胎牛血清(FCS，HyClone公司)；丙酮酸钠(HyClone公司)；青链霉素；10mIU/ml的促卵泡素(FSH，sigma公司)中将卵巢洗3次。2胎鼠生殖嵴的体外培养生殖嵴分离出来培养的当天定为O天。分离出的12. 5dpc胎鼠生殖嵴，一分为二， 并在培养液中贴壁培养观天。组织在37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，换液时观察卵母细胞的发育情况等。试验分为两组，对照组和试验组，两个组除了培养液成分不同之外其它的均相同。对照组培养液培养液A包含密理博高糖培养基(α -MEM, HyClone公司)；10 %胎牛血清(FCS, HyClone公司)；丙酮酸钠；青链霉素；IOmIU促卵泡素(FSH，sigma公司)。培养液B包含α -MEM ；5% FCS ；胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物(ITS-mix) ；1% 丙酮酸钠；青链霉素；100mIU/ml FSH ;lng/ml上皮生长因子(EGF，sigma公司)。试验组培养液培养液A包含α -MEM ； 10%胎牛血清(FCS，HyClone公司)； 丙酮酸钠；青链霉素；IOmIU促卵泡素(FSH，sigma公司)；100ng/ml ActA0培养液B 包含α-ΜΕΜ;5%胎牛血清(FCS，，HyClone公司)；1 %胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物 (ITS-mix) ； 丙酮酸钠；青链霉素；100mIU/ml促卵泡素(FSH，sigma公司)；lng/ml上皮生长因子(EGF，sigma 公司)；100ng/ml ActA0天根生化科技(北京)有限公司3卵母细胞的收集收集未添加和添加AcU体外培养到观天的小鼠卵巢，并撕成碎小的组织块， 0.25% 胰酶(Gibco-BRL)，0· 2% 胶原酶 IV(Gibco-BRL)和 0. 02 % DNAse-I (Sigma)消化，37°C处理lOmin。加入与胶原酶等体积的胎牛血清终止消化，洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在PBS中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞，根据试验需要将收集的卵母细胞进行分类。4卵母细胞的培养及成熟诱导使用口吸管吸出卵母细胞，然后挑出直径在75μπι以上的卵母细胞，每个液滴20 个卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上(12 14dpp腔前卵泡颗粒细胞收集后放入提前做好的培养液滴中。6cm培养皿，每个液滴100 μ 1,37°C,5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜)，进行共培养。处培养卵母细胞分为对照组和实验组，对照组和实验组培养液的配方如下对照组培养液α-MEM ； 10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ；EGF 5ng/ml ；1% 丙酮酸钠；青链霉素。实验组培养液α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ；EGF 5ng/ml ；ActA 100ng/ml ； 丙酮酸钠；青链霉素。共培养7天后，取出卵母细胞，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前做好的成熟培养液培养滴中(6cm培养皿，每个液滴ΙΟΟμ 1，37°C，5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜)，在37°C，5% CO2，饱和湿度的培养箱里培养18h，统计卵母细胞成熟的比例。成熟培养液的配方如下成熟培养液α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 100mIU/ml ；EGF lng/ml ； 丙
酮酸钠；青链霉素。5卵母细胞细胞质谷胱甘肽GSH分析卵母细胞细胞质谷胱甘肽GSH的分析采用上海碧云天生物技术有限公司生产的总谷胱甘肽检测试剂盒，具体实验步骤和方法可参考其说明书。收集体外培养^d的小鼠卵母细胞(+/-ActA)，14dpp和21dpp小鼠卵母细胞作为对照，进行GSH的检测。收集新鲜的细胞，PBS洗涤细胞一次，离心收集细胞，吸尽上清。加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂溶液，充分Vortex(细胞沉淀的体积可以根据细胞沉淀的重量进行估算。收集细胞前后分别对离心管进行称重，从而就可以计算出细胞沉淀的重量。IOmg细胞沉淀的体积可以粗略地看做10 μ 1)。然后利用液氮和37°C水浴对样品进行两次快速的冻融。4°C或冰浴放置5min。4°C，IOOOOrpm离心lOmin。取上清用于总谷胱甘肽的测定。具体步骤如下(1)参考表1，本实验利用96孔板，参照碧云天的总谷胱甘肽检测试剂盒(Total Glutathione Assay kit)依次加入样品或标准品，混勻。加入150 μ 1总谷胱甘肽检测工作液后，混勻，室温孵育5min。(2)加入 5O 微升 0. 16mg/ml NADPH 溶液，混勻。(3)立即用酶标仪测定A412，每5分钟测定一次或实时测定，共测定25分钟，测得 5个数据。(为了简化实验步骤，可以在加入NADPH溶液混勻后25分钟，仅测定一次A412)。表IGSH的检测体系
权利要求
1.一种ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于利用机械法分离12. 5dpc雌性胎鼠生殖嵴，体外培养胎鼠生殖嵴后收集卵母细胞，将12. 5dpc减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成生发泡期卵母细胞并诱导成熟，得到成熟的卵母细胞；并利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，获得早期发育的体外受精后代。
2.根据权利要求1所述的AcU促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法， 其特征在于胎鼠生殖嵴的分离按照如下步骤操作胎鼠卵巢来源于12. 5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以见栓为0. 5dpc,出生后小鼠的卵巢来源于12 14dpp的小鼠，利用机械分离法从胎鼠体内分离出卵巢，并转移到磷酸盐缓冲液+10%胎牛血清的操作液中，在操作液中洗3 次，并利用手术镊子去掉与卵巢连接在一起的中肾组织，在由密理博高糖培养基；5%胎牛血清；丙酮酸钠；青链霉素；IOmIU促卵泡素配制成的新鲜培养液中将卵巢洗3次。
3.根据权利要求1所述的AcU促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法， 其特征在于胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作生殖嵴分离出来培养的当天定为0 天，分离出的12. 5dpc胎鼠生殖嵴，一分为二，并在培养液中贴壁培养观天，组织在37°C、 5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，培养液A包含密理博高糖培养基； 10%胎牛血清；丙酮酸钠；青链霉素；IOmIU促卵泡素；lOOng/ml ActA ；培养液B包含密理博高糖培养基；5%胎牛血清；胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；丙酮酸钠；青链霉素；100mIU/ml促卵泡素；lng/ml上皮生长因子；100ng/ml ActA0
4.根据权利要求1所述的AcU促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法， 其特征在于卵母细胞的收集按照如下步骤操作收集添加ActA体外培养到观天的小鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，0. 25%胰酶，0. 2%胶原酶IV和0. 02% DNAse-I消化，37°C处理 IOmin,加入胶原酶等体积的胎牛血清终止消化，洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞。
5.根据权利要求1所述的AcU促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法， 其特征在于卵母细胞的培养及成熟诱导按照如下步骤操作使用口吸管吸出卵母细胞，然后挑出直径在75 μ m以上的卵母细胞，每个液滴20个卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上，12 14dpp腔前卵泡颗粒细胞收集后放入提前做好的培养液滴中，培养液配方密理博高糖培养基；10%胎牛血清；胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素10mIU/ml ； 上皮生长因子5ng/ml ；ActA 100ng/ml ； 丙酮酸钠；青链霉素；6cm培养皿，每个液滴 100μ 1,37°C,5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜；共培养7天后，取出卵母细胞，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前做好的成熟培养液培养滴中，6cm培养皿，每个液滴100 μ 1,37°C,5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜，在37°C ,5% CO2,饱和湿度的培养箱里培养18小时，统计卵母细胞成熟的比例；成熟培养液的配方为密理博高糖培养基；10%胎牛血清；胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素100mIU/ml ；上皮生长因子lng/ml ； 丙酮酸钠；青链霉素。
全文摘要
本发明涉及一种ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法。利用机械法分离12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴，体外培养胎鼠生殖嵴后收集卵母细胞，将12.5dpc减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成GV期卵母细胞并诱导成熟，得到成熟的卵母细胞；并利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，可获得早期发育的体外受精后代。本发明方法建立了ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，简便易行，从理论上探索原始生殖细胞的体外发生与卵泡的体外发育的细胞分子机制，并为卵巢性不孕症病人提供优质的卵母细胞，创造巨大的社会和经济价值。
文档编号C12N5/075GK102363765SQ20111034175
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者张志鹏, 张西锋, 李兰, 沈伟 申请人:青岛农业大学