专利名称：一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法
技术领域：
本发明涉及一种ActA(Activin A，激活素A)促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，特别是涉及一种在体外培养卵母细胞时，在培养基中加入AcU，促进未成熟卵母细胞成熟的方法。属于生殖医学的生物医学技术领域。
背景技术：
哺乳动物卵巢中含有各个不同发育阶段的大量卵泡。最大的一部分是原始卵泡。 然而，雌性具有繁殖力的时期，只有一小部分卵泡生产出具有排卵能力并成熟的卵母细胞。 剩余的卵巢卵泡(>99.9%)最后闭锁。为了获得额外的雌性配子资源，致力于发展在卵泡早期发育阶段生产完全生长的具有发育能力的卵母细胞技术具有很大的意义。早期卵泡的体外发育研究对调节原始卵泡到初级卵泡的转变机制的研究是很重要的并具有临床意义， 并且可以应用于辅助生殖技术体外培养原始卵泡来生产成熟卵母细胞，用以生产有价值的家畜和濒危灭绝的野生品种。卵泡体外培养技术的建立可应用于生物学和医学等领域，可以用来弥补卵母细胞在保存过程中由于损伤导致的受精能力的丧失缺憾(环境因素、放疗、化疗)；为患癌症的年轻女性在癌症治疗时保存她们的生育能力带来新的希望；并为治疗性克隆和卵巢不孕症病人提供优质的卵母细胞，创造巨大的社会和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，该方法通过在卵母细胞和颗粒细胞的共培养时，在培养基中加入AcU来促进未成熟卵母细胞的体外成熟，为开发卵母细胞资源应用于生物医学提供了很好的技术手段。为了实现上述发明目的，本发明的一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，收集腔前颗粒细胞放入提前备好的生长液滴中，在培养箱中过夜培养，做成颗粒细胞层；将收集的55 65 μ m之间的卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上，在培养基中添加浓度为lOOng/ml的ActA共培养，实现未成熟卵母细胞的体外成熟。本发明方法包括下列具体操作步骤第一步、腔前颗粒细胞的收集和培养用出生后12 14天的小鼠，取出卵巢后，用消化酶消化成裸卵及颗粒细胞，收集颗粒细胞放入备好的生长液滴中培养M小时，培养条件是每个液滴100μ 1，37°C，5% CO2, 饱和湿度的培养箱里，制成颗粒细胞层；所述消化酶是含有0. 25%胰酶，0. 2%胶原酶IV和0. 02% DNAse-I (DNA消化酶I， 购自sigma公司)的消化酶。所述生长液的配制α -MEM(密理博高糖培养基，HyClone公司)；BSA(牛血清白蛋白，Roche公司)3mg/ml ；脂肪酸(Fetuin) lmg/ml ；1% ITS-mix(胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物，HyClone公司)；FSH(促卵泡素，HyClone公司)10mIU/ml ；EGF(表皮生长因子，HyClone公司)5ng/ml ； 丙酮酸钠；青霉素和链霉素。第二步、12 14dpp卵母细胞的收集和培养机械法分离出生后12 14天小鼠卵巢后，体视镜下刺碎并用消化酶消化，口吸管取出卵母细胞，然后挑出直径在阳 65 μ m之间的卵母细胞，在生长培养液中培养，培养条件是37°C，5% CO2、饱和湿度的培养箱里，每隔2天换半液；以每个液滴20个卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上培养，在培养基中添加浓度为lOOng/ml的ActA ；所述消化酶是含有0. 25%胰酶，0. 2%胶原酶IV和0. 02% DNAse-I的消化酶。卵母细胞生长培养液的配制α-MEM FCS(胎牛血清)；1% ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ；EGF 5ng/ml ；ActA 100ng/ml ； 丙酮酸钠；青霉素和链霉素。第三步、卵母细胞的成熟培养卵母细胞培养7天后，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前备好的培养液滴中(6cm培养皿，每个液滴10(^1,371^5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜)，在37°C，5% CO2，饱和湿度的培养箱里培养18h，统计卵母细胞成熟的比例。成熟培养液的配制α-MEM ；BSA 3mg/ml ；Fetuin lmg/ml ；1 % ITS-mix ；FSH 100mIU/ml ；EGF lng/ml ； 丙酮酸钠；青霉素和链霉素。本发明是一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，该方法先把收集的腔前颗粒细胞放入生长液滴中培养，制成颗粒细胞层，再将收集的直径在阳 65 μ m之间的卵母细胞放入颗粒细胞层上培养，在培养基中添加浓度为lOOng/ml的ActA，实现未成熟卵母细胞的体外成熟。裸卵与颗粒细胞共培养条件下，AcU可以促进卵母细胞进入减数分裂， 提高卵母细胞的成熟数量。在培养到3 4天时，卵母细胞的凋亡发生比例为14. 3士 1. 7% ； 共培养7天后，裸卵的直径变化为61. 79 士 3. 2 67. 27 士 3. 52 μ m ；共培养7天后，卵母细胞胞质GSH(谷胱甘肽)表达量为11. 33士 1. 38 ( μ M)。该方法操作简单，建立了小卵泡的体外发生和发育体系，有利于开发卵母细胞资源并用于生物和医学研究。
图1为12 14dpp卵母细胞体外培养生长显微图。图2为不同培养组卵母细胞直径变化情况图。图3为不同培养组卵母细胞凋亡情况图。图4为卵母细胞GSH的检测图。图5为体外培养12 14dpp卵母细胞成熟诱导后GVBD (生发泡破裂)和MII期 (第二次减数分裂中期)的卵母细胞显微图。图6为GVBD发生的比例图。图7为MII发生的比例图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明方法做进一步阐述。实施例1、第一步腔前颗粒细胞的收集和培养1、取出出生后12 14天的小鼠卵巢后，用含有0.25%胰酶，0.2%胶原酶IV和0. 02% DNAse-I (DNA消化酶I)的消化酶消化成裸卵及颗粒细胞，加入终止液(含有10%的 FCS和90%的DMEM)中止消化，颗粒细胞放入1. 5ml离心管中，1500rpm离心5min，用生长液洗两遍，放入提前备好的生长液滴中(6cm培养皿，每个液滴10(^1,371:,51% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜)进行培养Mh，制成颗粒细胞层。2、生长液的配制a-MEM;BSA 3mg/ml ；Fetuin lmg/ml ； 1 % ITS-mix ； FSH(Follicle-stimulating Hormone, FSH)10mIU/ml ；EGF(epidermal growth factor, EGF) 5ng/ml ； 丙酮酸钠；青霉素和链霉素。第二步12 14dpp卵母细胞的收集和培养1、选取出生后12 14天的小鼠，机械法分离取出卵巢后，体视镜下刺碎并用 0. 25%胰酶，0. 2%胶原酶IV和0. 02% DNAse-I消化，口吸管取出卵母细胞，然后挑出直径在55 65 μ m之间的卵母细胞；2、将收集的卵母细胞分为两部分第一部分以每个液滴20个卵母细胞放入培养 24h后的颗粒细胞层上，+/"ActA进行培养；第二部分放入提前备好的培养液滴中，+/-ActA 进行培养，培养条件是37°C，5% CO2、饱和湿度的培养箱里。每隔2天换半液。3、对照组和实验组的卵母细胞生长液如下对照组卵母细胞培养液的配制α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ； EGF 5ng/ml ； 丙酮酸钠；青霉素和链霉素。实验组卵母细胞培养液的配制α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ； EGF 5ng/ml ；ActA 100ng/ml ； 丙酮酸钠；青霉素和链霉素。第三步卵母细胞的成熟培养1、共培养及单独培养的卵母细胞培养7d后，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放人提前做好的培养液滴中(6cm培养皿，每个液滴100 μ 1 37°C,5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜)，在37°C，5% CO2，饱和湿度的培养箱里培养18h，统计卵母细胞成熟的比例。2、成熟培养液的配制α -MEM ；BSA 3mg/ml ；Fetuin lmg/ml ；1 % ITS-mix ；FSH 100mIU/ml ；EGF lng/ml ； 丙酮酸钠；青霉素和链霉素。本实施例中，颗粒细胞取自于12 14天小鼠卵巢腔前卵泡，提前一天培养颗粒细胞层，采用的是液滴培养。颗粒细胞培养一天后加入20个直径在55 65 μ m的卵母细胞。图1中1和2表示来源于12 14dpp小鼠60 70 μ m之间的卵母细胞单独在生长培养液中(-/+ActA)培养0天、4天和7天，并进行成熟诱导16 18小时的生长状况；图1 中3和4表示60 70μπι之间的小鼠裸卵与12 14天小鼠颗粒细胞(-/+ActA)共培养0 天、4天和7天，并进行成熟诱导16 18小时的生长状况。卵母细胞单独培养试验(DOs)， 如图1中1和2。图3所示，在培养的过程中是否添加ActA对卵母细胞生长的影响不大， 22. 3士2. 2%和24. 3士2. 7% (-/+ActA)的卵母细胞发生了凋亡(P > 0. 05)。共培养试验 (D0s+PAGCs)，如图1中3和4所示，生长在颗粒细胞上的卵母细胞生长状况很好，在培养到 3 4天时，颗粒细胞可以覆盖卵母细胞，在这种状况下，卵母细胞的凋亡发生比例很低，分别是25. 5士2. 和14. 3士 1. 7% (-/+ActA)。因此，我们可以得到，没有颗粒细胞存在的条件下，ActA不能对卵母细胞的生长产生影响。为了进一步研究ActA对卵母细胞的生长发育的影响，我们通过两个方面进行检测，一是卵母细胞的直径，二是GSH的表达量。图2说明卵母细胞体外培养的过程中，未添加和添加ActA试验组培养7天后直径的变化情况。裸卵的直径变化分别为 63. 27 士 3. 12 61. 03 士 2. 87 μ m 和 63. 42 士 3. 72 61. 36 士 4. 04 μ m ；共培养的直径变化分别为 61. 54士4. 03 66. 37士3. 05 μ m 禾口 61. 79士3. 2 67. 27士3. 52 μ m。以上数据说明卵母细胞单独培养的过程中，两组卵母细胞直径都变小，与颗粒细胞共培养的卵母细胞，添加 ActA的试验组直径增大5. 48士 1. 2 μ m,未添加ActA试验组增大4. 83士0. 9 μ m(P < 0. 05)。 图4表示出生后14和21天小鼠卵母细胞、卵母细胞单独培养(-/+ActA) 7天和卵母细胞与颗粒细胞共培养(_/+ActA)7天后的卵母细胞胞质GSH(谷胱甘肽)的表达量，分别是 6. 95 士 0. 97，14. 28 士 0. 87，8. 07 士 0. 47，7. 95 士 0. 55，9. 8 士 1. 32 和 11. 33 士 1. 38 ( μ M)。* 代表差异显著P < 0. 05，**代表差异极显著P < 0. 01。卵母细胞与颗粒细胞共培养实验中， 添加ActA，GSH表达量显著升高，但还是低于体内21天的水平。为了检测AcU对卵母细胞的细胞核成熟的影响，我们对体外培养的卵母细胞进行成熟诱导，检测卵母细胞成熟的比例。图5为卵母细胞所处于GVBD期和MII期的示意图。裸卵培养过程中，不添加与添加ActA培养7天后，GVBD发生比例分别是16. 1 士 2. 2% 和15 士 1.7% (图6所示)，MII发生比例分别3. 7 士 2. 5%和4. 9 士 1.6% (图7所示)。与出生后12 14天小鼠卵巢颗粒细胞不添加和添加ActA共培养7天后卵母细胞发生GVBD 的比例分别是 20. 5士3. 禾口 24. 5士4. 5% (P < 0. 05)，MII 的比例分别 20. 5士4. 禾口 27. 6士3. 3% (P < 0. 05)。此数据说明小鼠卵母细胞可以自发地恢复减数分裂，但没有颗粒细胞存在的条件下，卵母细胞发生GVBD和MII期的比例没有差异，而裸卵与颗粒细胞共培养条件下，ActA可以促进卵母细胞进入减数分裂，提高卵母细胞的成熟数量。以上试验结果表明，没有颗粒细胞存在的条件下，ActA无法对卵母细胞的生长和发育产生影响，ActA作用于卵母细胞途径是必须要作用于颗粒细胞，然后再作用于卵母细胞。本发明已经试验实施了多次，试验的结果是成功的，实现了发明的目的。
权利要求
1.一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于按照如下步骤操作第一步、腔前颗粒细胞的收集和培养用出生后12 14天的小鼠，取出卵巢后，用消化酶消化成裸卵及颗粒细胞，收集颗粒细胞放入备好的生长液滴中培养M小时，培养条件是每个液滴100μ 1，37°C，5% CO2、饱和湿度的培养箱里，制成颗粒细胞层；第二步、12 14dpp卵母细胞的收集和培养机械法分离出生后12 14天小鼠卵巢后，体视镜下刺碎并用消化酶消化，口吸管取出卵母细胞，然后挑出直径在阳 65 μ m之间的卵母细胞，在生长培养液中培养，培养条件是37°C，5% CO2、饱和湿度的培养箱里，每隔2天换半液；以每个液滴20个卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上培养，在培养基中添加浓度为lOOng/ml的ActA ； 第三步、卵母细胞的成熟培养卵母细胞培养7天后，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前备好的培养液滴中，6cm培养皿，每个液滴10(^1,371^5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜，在37°C，5 % CO2,饱和湿度的培养箱里培养18h，统计卵母细胞成熟的比例；其中，第一步中生长液的配制密理博高糖培养基；牛血清白蛋白3mg/ml ；脂肪酸lmg/ml ； 胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素10mIU/ml ；表皮生长因子5ng/ ml ；丙酮酸钠；青霉素和链霉素；第二步中卵母细胞生长培养液的配制密理博高糖培养基；10%胎牛血清；胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素10mIU/ml ；表皮生长因子5ng/ml ；ActA 100ng/ml ；丙酮酸钠；青霉素和链霉素；第三步中成熟培养液的配制密理博高糖培养基；牛血清白蛋白3mg/ml ；脂肪酸lmg/ml ；胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素100mIU/ml ；表皮生长因子lng/ml ；丙酮酸钠；青霉素和链毒素。
2.根据权利要求1所述的一种AcU促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于所述消化酶含有0. 25%胰酶，0. 2%胶原酶IV和0. 02% DNA消化酶I。
全文摘要
本发明涉及一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法。收集腔前颗粒细胞放入生长液滴中，在培养箱中过夜培养，做成颗粒细胞层；将收集的55～65μm之间的卵母细胞放入颗粒细胞层上，在培养基中添加浓度为100ng/ml的ActA共培养，实现未成熟卵母细胞的体外成熟。裸卵与颗粒细胞共培养条件下，ActA可以促进卵母细胞进入减数分裂，提高卵母细胞的成熟数量。在培养到3～4天时，卵母细胞的凋亡发生比例为14.3±1.7％；共培养7天后，裸卵的直径变化为61.79±3.2～67.27±3.52μm；卵母细胞胞质GSH表达量为11.33±1.38(μM)。该方法操作简单，建立了小卵泡的体外发生和发育体系，有利于开发卵母细胞资源并用于生物和医学研究。
文档编号C12N5/075GK102363766SQ20111034175
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者张志鹏, 张西锋, 李兰, 沈伟 申请人:青岛农业大学