专利名称：一种猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法
技术领域：
本发明涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，属于兽用疫苗领域。
背景技术：
猪传染性胃肠炎病毒(porcinetransmissible gastroenteritis virus, TGEV)为冠状病毒科、冠状病毒属的成员。TGEV可感染所有年龄的猪，尤其是引起两周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率，是目前在世界范围内广泛存在的一种猪高度接触性烈性肠道传染病，常常在猪场反复发生和流行，给养猪业带来极大危害(Pensaert M B.Disease ofSwine.Seventh edition.1owa State University Press.USA.1992，305-338)。在众多学者的研究及临床探讨中发现用药物对猪传染性胃肠炎效果并不十分明，能够控制该病的关键是采用疫苗的预防，因此国内外学者对该病疫苗方面进行了大量的研究，目前国内还在广泛延用灭活苗、弱毒苗或基因工程苗，然而关于疫苗生产工艺方面还存在着许多需要改进的地方。目前国内兽用细胞疫苗的生产基本采用方瓶和滚瓶技术，这些技术在规模化生产病毒时劳动强度大、需要厂房面积大、生产出的抗原批间差异大，对标准化生产的质量控制很难操作。目前我国兽用疫苗市场中由于批间差异问题和病毒效价不高引起的质量不稳定的问题时有发生。在细胞疫苗生产行业中大规模生产动物细胞和病毒是疫苗产业化生产的前提。提高病毒效价和产量，是提升疫苗产业化生产工艺的必由之路。目前，国内采用的转瓶生产工艺得到的TGEV的病毒效价在107_°TCID50/ml左右，还没有解决猪传染性胃肠炎疫苗研究过程中存在的猪传染性胃肠炎病毒效价低和病毒产量难以放大的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种工艺合理、病毒产量和效价高的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，它既能解决传统的转瓶培养模式在病毒生产中存在的病毒产量低，病毒滴度不高，批间差异大的缺点，又能实现病毒的连续生产，并通过优化参数实现了高滴度多次收获病毒液，大大提高了病毒的产量。技术方案—种猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，包括如下步骤:I)在潮汐式生物反应器中，接种制苗用细胞至生物反应器内的微载体上，进行细胞的吸附培养；2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养；3)将猪传染性胃肠炎病毒接种到扩增培养的接种制苗用细胞上，进行病毒的吸附
培养；4)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养；5)在接种制苗用细胞CPE达到70%以上时，收获病毒液。
优选地，本发明所述微载体由选自聚酯、明胶或多糖的一种或几种制成。优选地，本发明所述微载体的添加量为5.5 10g/L。优选地，本发明在步骤I)中以2.0X107 3.6X107cells/g载体的细胞密度接种细胞。更优选地，本发明在步骤I)中以3.0X IO7载体的细胞密度接种细胞。优选地，本发明在步骤2)中的细胞扩增培养达到3.0父108 4.5父10*^118/^载体的细胞密度时进行步骤3)所述的病毒接种。更优选地，本发明在步骤2)中的细胞扩增培养达到3.5X108cells/g载体的细胞密度时进行步骤3)所述的病毒接种。优选地，本发明步骤3)中所述猪传染性胃肠炎病病毒接种的感染复数为0.01 0.1。优选地，本发明步骤I)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩增培养使用DMEM细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用1.5%(V/V)牛血清的DMEM细胞培养液，其中所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。优选地，本发明在步骤I)-步骤4)中载体罐中生长液的液面上下行速度均为
0.5 50L/分钟,液面在载体上下端点停滞时间为O 150s,培养程序运行I 24h。更优选地，本发明在步骤I)-步骤4)中载体罐中生长液的液面上下行速度均为2L/分钟，步骤I)和步骤3)液面在载体上下端点停滞时间为60s，步骤2)和步骤4)液面在载体上下端点停滞时间为30s，其中，步骤I)和步骤2)的细胞吸附和细胞培养程序运行时间为12h ;步骤3)和步骤4)中所述的病毒吸附和病毒培养程序的运行时间4h。优选地，本发明在步骤I)至步骤4)的培养过程中控制温度37°C，pH调节7.0
7.5，二氧化碳浓度为3% 5%的条件下进行。本发明的另一目的在于提供上述方法获得的猪传染性胃肠炎病毒培养液。由上可以看出，本发明的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，体现了连续培养和规模化生产动物细胞和病毒的趋势，与传统的摇瓶培养工艺相比，至少具有以下优
占-
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(I)毒价高:传统的转瓶工艺生产的猪传染性胃肠炎病毒效价仅为IO7 tlTCID5ci/ml，而本发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术高密度培养生产的病毒效价可以达到108_5TCID5tZml，其毒价要高出传统方法30倍。(2)生产规模大、单批次产量高:目前国内采用搅拌式悬浮培养工艺培养动物细胞，单台生物反应器最大规模不超过100L ;而本发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术培养动物细胞，单台生物反应器规模达500L，最大可达1000L，单台规模提高5-10倍。(3)连续式封闭式生产、收获病毒:本发明的方法可以全封闭生产，自动换液，连续收获方式收集病毒液，减少了污染的机率，产品质量均一稳定，批间差异小；本发明方法细胞接种量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。本发明方法解决了传统 工艺仅能控制温度和转速，本发明方法，可直接线性放大用于生产。(4)本发明方法具有细胞接种量低，控制容易，且病毒感染效率高，而且也解决了传统转瓶大规模生产时单批产量不高、批间差异大、产品质量不稳定、劳动强度大、生产成本闻等问题。(5)操作方便、操作空间小:本发明方法中采用的载体为网状的聚酯纤维，具有亲水性和生物无害性，Ig载体约占15ml的空间，可提供2400cm2的贴壁面积，在同样的空间内极大的增大了细胞的贴壁面积，增加了细胞生长的密度，细胞数可达到1.0X 109/g以上，其效能为传统转瓶培养系统的数十倍，可以节省许多成本及人力。本发明500L工作体积仅需20m2的操作区域，仅需2人就可完成全部操作，而传统工艺需要2000个大方瓶或转瓶，最少需要600m2的操作区域，最少需要100人才能完成。采用本发明方法，解决了传统转瓶生产时劳动强度大、生产成本高等问题。(6)工艺参数控制精确:本发明运用潮汐式微载体悬浮培养技术生产时可控参数有温度、PH值、溶氧量、二氧化碳浓度、载体浓度，可实现在线监测的参数有葡萄糖、乳酸和铵离子浓度，批次质量稳定，而传统转瓶培养工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异大。本发明方法利用生物反应器，解决抗原浓度低、生产成本高、劳动强度大的问题，而且能连续培养、占地小、生产规模大、无搅拌式悬浮培养时对细胞形成的剪切力、无气泡产生、对细胞伤害小。
·图1为本发明实施例1中使用的潮汐式生物反应器示意图，其中，各个标记分别为I进料桶、2收料桶、3·自动馈料仪、4pH/D0监控器、5恒温振荡箱、6培养液袋、7电脑控制器、8载体罐、9载体、10恒温培养舱、11进/取样管。
具体实施例方式本发明的方法对于所用的设备、装置或仪器没有特殊要求，其可在各种类型的潮汐式生物反应器中进行。虽然本申请具体实施例中采用的潮汐式生物反应器是购自赛宇细胞科技股份有限公司的TideCell生物反应器，其他潮汐式生物反应器(无论大小)也能适用于本发明的方法。因猪传染性胃肠炎病毒能在多种组织细胞上增殖，但对不同的细胞具有不同的敏感性，如ST细胞、PK-15细胞等。本发明的较佳实施方案中，选择使用的是猪睾丸细胞(ST细胞)。本发明实施例中采用的潮汐式生物反应器结构如图1所示。其中，各个标记分别为I进料桶、2收料桶、3自动馈料仪、4pH/D0监控器、5恒温振荡箱、6培养液袋、7电脑控制器、8载体罐、9载体、10恒温培养舱、11进/取样管。较佳地，本发明实施例中采用了依据潮汐原理而设计的高密度细胞培养系统，即TideCell潮汐式生物反应器，该生物反应器的各部分功能及工作原理如下:载体罐放置于恒温培养舱中，恒温培养舱为载体罐提供一个恒温的环境。载体罐是细胞培养与病毒增殖的场所，细胞贴附生长在载体罐内部的载体上，当培养液袋内的培养液泵入载体罐时，载体罐内的培养液液面上升并淹没细胞，向细胞供给养分，并将细胞的新陈代谢产物从细胞上去除。当载体罐内的培养液泵入培养液袋时，载体罐中的培养液液面随之下降，细胞露出，进行通风供氧。间歇淹没与暴露载体床的培养方式使载体上的细胞能够得到足够的营养和氧气，同时产生的代谢废物能够有效地被排出去。
载体罐的盖子上装有数根管道，这些管道的作用包括:人工手动方式向载体罐内注入液体(如接种细胞悬液等)或排出载体罐内的液体；由电脑控制器控制向载体罐注入气体，气体通常是压缩空气、氧气及CO2三种的混合物，三种气体在混合物中的比例可以自动调节控制，以适应细胞培养需要。电脑控制器可自动控制混合气体向载体罐内的注入与排出，并为潮汐提供动力。培养液袋用以盛装培养液，并通过两条管道与载体罐底部相通，两条管道分别为液体灌流通道，通过与载体罐之间的液体流动，从而完成潮汐过程。培养液在潮汐过程中的灌流速度可通过电脑控制器进行调整。培养液的换液量是指在一次潮汐过程中，泵入或泵出载体罐的液体量，换液量的大小决定了载体罐内液面顶部和底部所处的位置。在培养液袋与载体罐之间相连通的管道上设有进/取样管，可使用无菌注射器通过进/取样管对培养液进行取样，用以检测其中的葡萄糖含量及病毒含量等指标。葡萄糖的添加:若葡萄糖低于规定标准，则根据葡萄糖测定仪测定培养液中剩余葡萄糖的含量，及培养液的总体积计算出需补加的葡萄糖量，利用无菌注射器抽取配制的葡萄糖溶液从进/取样管中注射到载体罐与培养液袋之间的导管中，葡萄糖溶液随着载体罐的换液得以从导管进入培养液袋并做进一步混匀。恒温振荡箱通过加热与振荡，来维持培养液袋内培养液温度的恒定及成分的匀质性。pH/DO监控器可以监测培养液袋内培养液的酸碱度(pH值)及溶氧(DO)，并通过注入碱性溶液(NaOH或NaHCO3溶液)将培养液的pH值控制在合适范围内。收料桶及进料桶均通过自动馈料仪与培养液袋相连，培养液袋内的培养液需要进行收获时，可通过自动馈料仪进入收料桶，而进料桶内的培养液则可以通过自动馈料仪对培养液袋进行补充。在本发明实施例中，所用的生物反应器的载体罐体积为2 100L，电脑控制器可以调节控制多种参数，如潮汐过程中载 体罐内培养液的潮汐速率及频率、恒温培养舱的温度、溶氧、CO2浓度等。本实施例中所使用的微载体为聚酯纤维。宽5mm，长10mm，Ig载体约占15ml的空间，提供2，400cm2的贴壁面积，可提供1.0X IO9以上数量的细胞生长。本领域细胞培养常用的其他材质制作的载体如:聚酯纤维载体、明胶载体、聚酰胺载体、聚乙烯醇载体、聚苯乙烯载体、聚丙烯载体、聚氨酯载体、碳氟聚合物载体以及陶瓷载体等，均可使用本发明之方法生产猪传染性胃肠炎病毒。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1潮汐式微载体悬浮生物反应器大规模生产猪传染性胃肠炎病毒1.病毒与细胞株用于制备猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎(TGE)华毒弱毒(H)疫苗株(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC-V200609)，经过致病性测试，该毒株病毒不具有致病性。以对该病毒株具有良好敏感性的细胞系猪睾丸(ST)细胞系，作为制苗用细胞系，藉以感染并大量繁殖猪传染性胃肠炎病毒。2.制备方法(I)将制苗用细胞系猪睾丸细胞系(ST)接种到加有DMEM液体培养基(包括5%牛血清、终浓度为IOOiu的双抗、pH值为7.2)与聚酯纤维的载体罐内；微载体用量为每500ml培养液添加5.5g微载体，细胞初始接种量为3.0X 107Cells/g微载体。(2)于37°C、5% CO2培养环境下，细胞贴附12h，使上述制苗用细胞与微载体混合均匀，并使细胞贴附在微载体上。贴附程序参数为:UP (上升速度，下同):2000mL/min，hold(停留时间，下同)lmin、Down(下降速度):2000mL/min hold(停留时间)30s,设定最大换液量9000mL ;12h后切换为细胞培养程序，细胞培养程序参数为:up:2000mL/min holdlmin> Down:2000mL/min, holdlmin,设定最大换液量 9000mL。(3)于37°C、5% CO2培养环境下，使细胞在上述微载体上生长4天，直到细胞数达到3.5X108Cells/g微载体，更换新的DMEM培养液并加入1.5%牛血清；将猪传染性胃肠炎(TGE)华毒弱毒(H)疫苗株以DMEM液体培养基(含1.5%牛血清)制成病毒悬浮液(接种浓度为0.01M.0.1.)，接种于上述细胞上，使其吸附到上述细胞上。病毒吸附程序参数为:up:2000mL/min hold lmin、Down:2000mL/min, hold 30s,设定最大换液量9000mL ;4h后切换为病毒培养程序,病毒培养程序参数为:up:1400mL/min, hold lmin, DownHOOmT,/mi n , hold lmin,设定最大换液量 9000mL。(4)于37°C、5% CO2培养环境下继续培养；每隔2天收获病毒液，连续收获3次并置于4°C保存。收获的病毒液混合并进行以下检验:
(a)纯净性检验:按《中华人民共和国兽药典》2005年版附录的相关规定进行检验，完全符合，对猪安全无副作用，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。(b)病毒含量测定:将病毒用含1.5%牛血清细胞维持液作10倍梯度系列稀释，从IO-1到10Λ每个稀释度接种8个孔，同时设立阴性不接毒对照，放入5% CO2温箱中37°C培养48-72h，显微镜下观察病变的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID5tl,每1.0ml含病毒≥ IO8-5TCID500以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)在潮汐式生物反应器中，接种制苗用细胞至生物反应器内的微载体上，进行细胞的吸附培养； 2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养； 3)将猪传染性胃肠炎病毒接种到扩增培养的接种制苗用细胞上，进行病毒的吸附培养; 4)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养； 5)在接种制苗用细胞CPE达到70%以上时，收获病毒液。
2.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述微载体由选自聚酯、明胶或多糖的一种或几种制成。
3.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述微载体的添加量为5.5 10g/L。
4.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤I)中以2.0父107 3.6父10\6118/^载体的细胞密度接种细胞。
5.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤I)中以3.0X IO7载体的细胞密度接种 细胞。
6.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤2)中的细胞扩增培养达到3.0X IO8 4.5X 108cells/g载体的细胞密度时进行步骤3)所述的病毒接种。
7.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤2)中的细胞扩增培养达到3.5X108cells/g载体的细胞密度时进行步骤3)所述的病毒接种。
8.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，步骤3)中所述猪传染性胃肠炎病病毒接种的感染复数为0.01 0.1。
9.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，步骤I)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩增培养使用DMEM细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用1.5% (V/V)牛血清的DMEM细胞培养液，其中所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
10.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤I) -步骤4)中载体罐中生长液的液面上下行速度均为0.5 50L/分钟，液面在载体上下端点停滞时间为O 150s，培养程序运行I 24h。
11.根据权利要求10所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤I)-步骤4)中载体罐中生长液的液面上下行速度均为2L/分钟，步骤I)和步骤3)液面在载体上下端点停滞时间为60s，步骤2)和步骤4)液面在载体上下端点停滞时间为30s，其中，步骤I)和步骤2)的细胞吸附和细胞培养程序运行时间为12h;步骤3)和步骤4)中所述的病毒吸附和病毒培养程序的运行时间4h。
12.根据权利要求1中所述的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤I)至步骤4)的培养过程中控制温度37°C，pH调节7.0 7.5，二氧化碳浓度为3% 5%的条件下进行。
13.根据权利要求1-12任一项 的方法获得的猪传染性胃肠炎病毒培养液。
全文摘要
本发明提供了一种猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，包括如下步骤在潮汐式生物反应器中，接种细胞至微载体进行细胞的吸附培养和扩增培养；接种猪传染性胃肠炎病毒进行病毒的吸附培养；而后进行病毒的增殖培养；在细胞CPE达到70％以上时，收获病毒液。本发明的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，体现了连续培养和规模化生产动物细胞和病毒的趋势，与传统的摇瓶培养工艺相比，抗原效价提高30倍以上，而且产品质量均一；生产工艺简化，操作简单，提高了生产效率，降低了生产成本。
文档编号C12N7/00GK103087993SQ20111034096
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司