专利名称：一种能够降解石油的醋酸钙不动杆菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体地说一种能够降解石油的醋酸钙不动杆菌的应用。
背景技术：
随着社会的发展，人们对石油的需求量也不断加大，与此同时由于各种途径造成的石油污染也日趋严重。目前，石油及其炼制品在开采、炼制、贮运和使用过程中进入海洋环境而造成的污染，已经成为世界各国的一种最为严重的海洋污染。进入海洋环境的石油及其炼制品主要来自以下途径①经流域或直接向海洋注入的各种含油的废水海上油船漏油事故和排放；③海底油田开采溢漏及井喷事故；④逸入大气中的石油烃沉降及海底 自然溢油等。目前经由各种途径进入海洋的石油烃总量约600万吨/年，排入中国沿海的石油烃总量约10万吨/年。石油污染对海洋造成的危害主要有以下几个方面I)石油中的多环芳烃类的有毒有害物质，可以直接对海洋生物产生毒性；2)石油形成的油膜覆盖海面，减少水气中氧气的交换和光照强度，导致水生生物饿死或者缺氧致死；3)石油具有较强的黏性，一旦沾染到动物体表，就难以处理并对动物产生毒害，因此，使一些海鸟和海洋脊椎动物受害；4)石油中含有难降解的持续有机污染物和重金属等，可在海洋环境中长期存留并通过生物体富集，危害渔业安全和人类的健康，飘到海边陆地的石油还能污染土壤。5)石油污染无疑加剧了近海的荒漠化，加速了某些物种的灭绝。微生物可以分解石油等有机污染物。石油污染物的微生物修复技术，是利用微生物的代谢将存在于环境中的石油污染物降解成二氧化碳和水或转化成为无害物质的工程技术。早在上个世纪80年代，对石油污染物的微生物修复技术就开始研究，并逐渐在实际中应用。1989年美国Exxon公司和美国环保局联合实施的微生物修复Alaska威廉王子海湾石油污染，是应用微生物进行环境中石油污染修复的一个极为成功的例子，也是现代微生物修复技术发展的开端。在石油污染物微生物修复技术中，具有石油分解能力的微生物的筛选是利用微生物技术进行石油污染物微生物修复技术研发的前提和工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用自身代谢能够降解石油的醋酸钙不动杆菌及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种能够降解石油的醋酸钙不动杆菌的应用，其特征在于所述醋酸钙不动杆菌为醋酸I丐不动杆菌T32,分类学命名乙酸I丐不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus,其可作为石油的降解菌株。该菌于2010年11月06日被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏，编号为CGMCC No. 4311，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。所述醋酸钙不动杆菌能够利用石油作为唯一的碳源在最小培养基中生长和繁殖，能够显著降解所在环境中石油的浓度。所述醋酸钙不动杆菌T32，可以利用其自身的代谢过程，降低环境中石油的浓度，主要包括以下步骤(I) T32种子培养从平板上选取一环菌落接入LB培养基，摇瓶装液量为摇瓶体积的30%，培养温度为28 30°C，培养转速180 200rpm/min，培养时间为10_16h。(2)T32降解石油的摇瓶实验将步骤(I)中的Τ32种子液按lX107CFU/ml的起始浓度接种于含有石油的最小培养基中进行培养，以未接种T32种子液的含有石油的最小培养基作为未被细菌降解的石油的对照。(3)T32降解96孔板中的石油称取200mg的石油溶解于2ml的有机溶剂正己烷 中，配置成终浓度为100mg/ml的石油溶液。取100 μ I的石油溶液加入到无菌的96孔板中，放置在室温静置使正己烷全部挥发干净。将过夜培养的醋酸钙不动杆菌菌液加入到最小培养基中使菌液的终浓度达到I. 0X107CFU/ml。将100 μ I的上述菌液加入到含有石油的96孔板中，在28 30°C培养箱中培养。7天后观察降解结果，并对未经过细菌降解和经过细菌降解的石油进行紫外光吸收值和气相色谱的测定。步骤(2)中所述最小培养基的配方为每升水中加入1360mg磷酸二氢钾，1780mg磷酸氢二钠，500. 08mg硫酸镁,500mg氯化铵,O. Img氢氧化招,O. 05mg 二氧化锡,O. 05mg碘化钾，O. 05mg氯化锂,0. 05mg硼酸,0. Img硫酸锌,O. Olmg氯化钴,O. Olmg硫酸镍,O. 05mg氯化钡和O. 05mg钥酸铵，pH, 7. 2±0· I。步骤(3)中所述的紫外检测石油含量的方法为将细菌降解前后的石油溶解在正己烷中，以正己烷作为参比，在225nm下测定其吸收值。石油的降解率=(降解前的光吸收值-降解后的光吸收值)/降解前的光吸收值X 100%。步骤(3)中所述的气相色谱检测石油含量的方法为气相色谱仪瓦里安CP-3800气相色谱仪(美国)，FID检测器。色谱柱DB-5 ;柱长30m ；内径O. 32mm ;气相色谱条件载气(氮气)流速2 ml/min ;空气流速300ml/min ;氢气流速30ml/min,尾吹气流速28ml/min。分流进样,分流比I : 5 ;进样量lul。柱温程序40°C保持O. 5min,以15°C /min的速率升至290°C，保持5min。进样口温度300°C ;检测器温度300°C。与现有技术相比，本发明的积极效果是本发明所得的能够降解环境中石油的细菌，能利用自身的代谢过程降低石油的浓度，所述菌株醋酸I丐不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) T32, 2010年11月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 4311。该菌株可降解环境中的石油，具有降解速度快、费用低、操作步骤简单等优点，为清除环境中的石油污染提供了较好的思路。
图I为本发明实施例提供的醋酸钙不动杆菌T32的16S rDNA的序列。图2为本发明实施例提供的实验室摇瓶实验确定醋酸钙不动杆菌T32降解石油的效果图。
图3为本发明实施例提供的96孔板中醋酸钙不动杆菌T32降解石油效果图。图4为本发明实施例提供的气相色谱测定降解前后石油组成成分变化。其中(a)细菌降解前正己烷溶解的石油组分的气相色谱分析；(b)细菌降解后正己烷溶解的石油组分的气相色谱分析。
具体实施例方式本发明的具有石油降解能力的醋酸钙不动杆菌的筛选过程简述如下本发明提供一株具有石油降解能力的菌株，从烟台海岸带水域中分离得到，该菌对石油的降解率可到80%，经16S rDNA鉴定该菌株为醋酸钙不动杆菌(参见图I)。该菌 于2010年11月06日被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏，编号为 CGMCC No. 4311。实施例I :具有石油降解能力的醋酸钙不动杆菌T32的筛选。将来自烟台附近不同海域的海水和底泥样品100 μ I涂布到LB培养基中，长出的单克隆菌株接到含有石油(10mg/ml)的最小培养基中进行培养(最小培养基的配方为每升水中加入1360mg磷酸二氢钾，1780mg磷酸氢二钠，500. 08mg硫酸镁,500mg氯化铵,O. Img氢氧化招，O. 05mg 二氧化锡,O. 05mg碘化钾,0. 05mg氯化锂,0. 05mg硼酸,0. Img硫酸锌，
O.Olmg氯化钴，O. Olmg硫酸镍，O. 05mg氯化钡和O. 05mg钥酸铵，pH，7.2±0. I。)，筛选到能够以石油作为唯一碳源生长，并降解石油的菌株T32。利用8F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACG ACTT)为引物，以T32菌液作为PCR反应的模板，扩增其16SrDNA并进行鉴定。PCR的条件为94°C变性4min，94°C变性30s，57°C退火lmin，72°C延伸lmin，从第二步开始，30个循环。PCR产物由北京诺赛基因进行测序。DNA测序片段见图I。该669bp的核苷酸序列在NCBI数据库中的序列比对结果表明，T32与NCBI数据库中醋酸钙不动杆菌PSB29，LUH 9144, RUH 2203和LUH 5820具有100%的同源性，因此该菌鉴定为醋酸钙不动杆菌。醋酸钙不动杆菌T32的16S rDNA基因在NCBI数据库中的基因序列号为HQ902142。醋酸钙不动杆菌T32为革兰氏阴性菌，对营养无特殊要求，在普通培养基上生长良好。在平板上培养24h后菌落呈圆形突起，表面光滑，边缘整齐，不透明，有黏液，无运动能力，能够以石油为唯一碳源进行生长并且能够降解石油。实施例2 :实验室摇瓶实验测定醋酸钙不动杆菌T32降解石油的效果。称取500mg的石油溶解于5ml的有机溶剂正己烧中，配置成终浓度为100mg/ml的石油溶液。分别取500μ I的石油溶液加入到无菌的试管中，放置在室温静置使正己烷全部挥发干净。将过夜培养的醋酸钙不动杆菌菌液加入到最小培养基(最小培养基的成分见实施例I)中使菌液的终浓度达到1.0X107CFU/ml。并将5ml的上述菌液加入到含有石油的试管中，并以未接种T32种子液的含有石油的最小培养基作为未被细菌降解的石油的对照，在28 30°C的摇床中培养7天。肉眼观察并记录实验结果，实验结果见图2。所述醋酸钙不动杆菌的过夜培养从平板上选取一环菌落接入LB培养基，摇瓶装液量为整个摇瓶体积的30%，培养温度为28 30°C，培养转速180 200rpm/min，培养时间为 10-16h。实验结果分析表明，经过石油降解菌醋酸钙不动杆菌T32降解后，石油分散度明显增加，流动性增强，粘度下降(图2)。
实施例3 96孔板中醋酸钙不动杆菌T32降解石油的效果。称取200mg的石油溶解于2ml的有机溶剂正己烷中，配置成终浓度为100mg/ml的石油溶液。取100 μ I的石油溶液加入到无菌的96孔板中，放置在室温静置使正己烷全部挥发干净。将过夜培养的醋酸钙不动杆菌菌液加入到最小培养基中使菌液的终浓度达到I. OX 107CFU/ml。将100 μ I的上述菌液加入到含有石油的96孔板中，在28 30°C培养箱中培养7天。肉眼观察并记录实验结果，实验结果见图3。将细菌降解后的石油和未经细菌降解的石油重新溶解在正己烷溶液中，测定石油溶液在225nm处的吸光值,通过计算如下的计算石油的降解率=(降解前的光吸收值-降解后的光吸收值)/降解前的光吸收值X100%，计算醋酸钙不动杆菌T32降解石油的效率。通过气相色谱测定醋酸钙不动杆菌T32对不同的石油组分的降解程度，测定结果见图4。气相色谱仪瓦里安CP-3800气相色谱仪(美国)，FID检测器。色谱柱DB_5 ;柱 长30m ;内径O. 32mm ;气相色谱条件载气(氮气)流速2ml/min ;空气流速300ml/min ;氢气流速30ml/min,尾吹气流速28ml/min。分流进样,分流比I : 5 ;进样量lul。柱温程序40°C保持O. 5min,以15°C /min的速率升至290°C，保持5min。进样口温度300°C ;检测器温度300°C。实验结果分析96孔板中的石油经过石油降解菌醋酸钙不动杆菌T32的降解，大部分的石油组分已经被降解，滞留在96孔板中的石油数量上明显减少(图3)。将96孔板中的石油重新溶解在正己烷中，测定未经过细菌降解(C)和经过醋酸钙不动杆菌降解(T32)的石油在紫外区吸光度的变化，通过计算公式得到的石油降解率为80%。气相色谱测定表明，石油烃的某些组分能够明显被醋酸钙不动杆菌T32降解(图4)。
权利要求
1.一种能够降解石油的醋酸钙不动杆菌的应用，其特征在于所述醋酸钙不动杆菌为醋酸I丐不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)T32,其可作为石油的降解菌株。
2.按权利要求I所述的能够降解石油的醋酸钙不动杆菌的应用，其特征在于所述醋酸钙不动杆菌能够利用石油作为唯一的碳源在最小培养基中生长和繁殖，能够显著降解所在环境中石油的浓度。
3.按权利要求I或2所述的能够降解石油的醋酸钙不动杆菌的应用，其特征在于称取200mg的石油溶解于2ml的有机溶剂正己烷中，配置成终浓度为100mg/ml的石油溶液，取100 μ I的石油溶液加入到无菌的96孔板中，放置在室温静置使正己烷全部挥发干净，将过夜培养的醋酸钙不动杆菌菌液加入到最小培养基中使菌液的终浓度达到I. OX IO7CFU/ml，将100 μ I的上述菌液加入到含有石油的96孔板中，在28 30°C培养箱中培养。
4.按权利要求3所述的能够降解石油的醋酸钙不动杆菌的应用，其特征在于所述菌株加入到含有石油的培养基中培养后，通过紫外和气相色谱检测菌株对石油的降解效果。
全文摘要
本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体地说一种能够降解石油的醋酸钙不动杆菌的其应用。所述能够降解石油的醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus T32，已于2010年11月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；编号为CGMCC No.4311。所述醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus T32能够利用石油作为唯一的碳源生长，并在生长过程中将石油降解。本发明的优点利用醋酸钙不动杆菌T32自身的代谢过程降解石油具有降解速度快、过程操作简单、费用低廉等优点。
文档编号C12N1/20GK102676418SQ201110341710
公开日2012年9月19日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者刘萍, 张卫卫, 徐冬雪, 殷堃, 牛宗亮, 陈令新 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所