降解酶微生物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，内容为一株能有效降解黄曲霉毒素Bl(AFBl)的菌株夏抱生枝抱iCladosporium uredinicola HSK8)及其应用。
技术背景
[0002]黄曲霉毒素B1于1960年被发现。当时，在英国就是因为喂食了含黄曲霉毒素的花生柏，导致了大批火鸡暴毙。自那以后已有20多种黄曲霉毒素被分离，目前已经有18种被鉴定，其中最为常见的几种常见的是B2、Gp G2、MJPM2。B类黄曲霉毒素的命名源于其在紫外光下可发出蓝色(blue)荧光，类似的，G类黄曲霉毒素则能在紫外光下发出绿色(green)焚光，黄曲霉毒素M1、M2因其最先发现于牛奶(milk)中所以被这样命名。在各黄曲霉毒素中，数黄曲霉毒素Bl(AFBl)毒性最强。AFB1每年造成大量的粮食污染，并且对人畜的健康。黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)是寄生曲霉{Aspergillus parasiticus)和黄曲霉{Aspergillus flavus)的典型次级代谢产物，具有极强的毒性、致癌性和致畸性。除上述两种曲霉外，A nominus, A.tamarii取A/wei/ob iaazarii也报道具有合成黄曲霉毒素的能力，但以寄生曲霉和黄曲霉为主。食米储存不当，极容易发霉变黄，产生黄曲霉毒素。
[0003]生物法去除AFB1使得去除食品、饲料中的AFB1可在温和的条件下进行，而同时又不影响食品和饲料中的营养，与化学法和物理法相比，这是生物法的优点。化学法和物理法的主要缺点在于要么反应条件过于激烈、脱毒效果不理想，要么耗资大、破坏营养成分及适口性，因为这些原因，这两类方法难以得到广泛应用。
[0004]用生物法来去除AFB1自AFB1被发现初就有研究。生物法基于微生物对真菌毒素或产毒真菌的作用，这些微生物包括酵母、丝状真菌、细菌、藻类等，作用机制包括营养和空间竞争、反应、抗生等。国内报道的降解AFB1的微生物有:假蜜环菌{Armillariella tabescens)、施氏假单胞菌{Pseudomonas s tu tzeri)、嗜麦芽窄食单胞菌{stenotrophomonas sp.)等；国外报道的有 Dactylium dendroides NRRL2575、Corynebac terium rubrum、Aspergillus niger、Trichoderma viride、Mu cor ambiguus、恶臭假单胞菌(Pseudomonas /wiii/a)、红蹄红球菌 U^hodococcus、澄色黄杆菌{Flavobacterium aurantiacum)等。除此之外，近年来还出现了有关药用植物降解黄曲霉毒素的文献报道，比如-.Adhatoda vasica Nees, zimmu, Trachyspermum ammi (L.)Sprague ex Turrill。关于生物降解AFB1的文献报道越来越多，这说明生物法降解AFB的研究正蓬勃发展。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种产黄曲霉毒素解毒酶的菌株及其应用，有效解决黄曲霉毒素污染的问题。不仅如此，该株菌还能利用工农副产物或废弃物糖蜜、玉米芯粉和橙皮粉发酵产黄曲霉毒素B1降解酶，因此也大大节约了成本。
[0006]为了实现本发明，发明人通过大量试验反复进行菌种筛选研究，终于获得了一株合成黄曲霉毒素解毒酶能力较强的霉菌:夏孢生枝孢Cladosporium uredinicola HSK8，已于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC NO:M 2015181，地址为中国武汉武汉大学。
[0007]形态学特征:菌落粉状，反面黑绿色；分生孢子顶生或侧生，形成分枝的孢子链，椭圆形，淡橄榄绿色。
[0008]代谢特性:代谢过程能产生黄曲霉毒素解毒酶；较强的纤维素、半纤维素利用能力。
[0009]本发明涉及的高产黄曲霉毒素解毒酶的夏孢生枝孢Cladosporium uredinicolaHSK8是按照如下方法获得的:
(1)产黄曲霉毒素降解酶菌株的筛选
取5g采集的花生壳样品置于50ml灭菌生理盐水中，37°C、160r/min条件下振荡2h。然后取5ml菌液接种于富集培养基(富集培养基配方(g/L):香豆素1，(NH4)2S04 5，NaCl 8.5，0.1MPa灭菌20min)中，37°C、160r/min条件下培养24h。连续富集培养3次。取富集培养液稀释成不同不同稀释倍数的菌液，然后涂布于初筛平板(初筛平板培养基配方(g/L):香豆素 1，(NH4)2S04 5，KH2P04 2.5，MgS04 l，NaH2P04.12H 20 0.5，FeS04.7H 20 0.1，CaCl20.1，琼脂20，0.1MPa灭菌20min)上，30°C恒温培养7d。
[0010]取稀释涂布平板上长势较好的三株霉菌保存于试管斜面(斜面培养基(g/L):马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，115°C灭菌30min)，保藏备用。
[0011]通过摇瓶发酵(发酵培养基(g/L):蔗糖30，NaN03 2.0，Κ2ΗΡ04.3Η20 1.0,KC1 0.5，MgS04 0.5，FeS04.7H20 0.01，0.1MPa 灭菌 20min)，培养 48h 后取样品进行 AFB1 降解率测定。
[0012]通过计算，初筛得到的三株霉菌中，夏孢生枝孢(Cladosporiwn uredinicolaHSK8)对AFB1的降解能力最强40.68%，该菌在中国典型微生物保藏中心的专利保藏编号为CCTCC NO:M 2015181。故选用 CCTCC NO:M 2015181 作为下一步实验菌株。
[0013](2) CCTCC NO:M 2015181 发酵条件的优化
采用单因素试验考察CCTCC NO:M 2015181的发酵温度、初始pH、发酵周期、接种量、装液量对木聚糖酶产量的影响。
[0014]发酵培养基为初始培养基(蔗糖30g/L，NaN03 2.0g/L，Κ2ΗΡ04.3H20 1.0g/L，KC10.5g/L，MgS04 0.5g/L，FeS04.7H20 0.01g/L，0.1MPa 灭菌 20min)。初始发酵条件为:白然pH,接种量 10%，装液量 50 ml/250 ml，28 °C，180r/min 摇瓶发酵 48h。
[0015]a.发酵温度对AFB1降解率的影响
以10%的接种量将Cladosporium uredinicola HSK8种子液转接于发酵培养基中，分别于 25，28，31，34，37，40° C 进行培养 48h。转速 180r/min，装液量 50mL/250mL。以此研究发酵温度对AFB1降解率的影响。
[0016]b.装液量对AFB1降解率的影响
以10%的接种量将种子转接于发酵培养基中28。C、180 r/min条件下培养48h，发酵培养基的装液量梯度为(mL/250mL):25，50，75，100，125。以此研究装液量对AFB1降解率的影响。
[0017]c.接种量对AFB1降解率的影响接种量(v/v)梯度分别为:1%，3%，6%，9%，12%，15%。通过此接种量的不同来研究接种量对AFB1降解率的影响。发酵温度28° C，转180r/min，装液75 mL/250mL，培养时间48h。
[0018]d.发酵周期对AFB1降解率的影响
在最优发酵条件下，分别发酵24、48、72、96、120、144h。以此考察发酵周期对AFB1降解率的影响。
[0019]e.初始发酵液pH对AFB1降解率的影响
在上面最优的条件下，研究初始pH对AFB1降解率的影响。初始pH梯度设为:5.0,5.5，
6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0。
[0020](3) CCTCC M NO: 2015181 发酵培养基优化
a.碳源的优化
为了研究碳源对AFB1降解率的影响，使用了下列碳源:蔗糖，葡萄糖，α -乳糖，糖蜜，可溶性淀粉，D-甘露醇，羧甲基纤维素钠，玉米芯粉，玉米粉，橙皮粉，D-山梨醇。
[0021]b.碳源添加量的优化
根据上面实验选择糖蜜作为碳源，然后对其添加量进行研究，添加量梯度如下:0.5%，1%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%。
[0022](4)AFB1降解率的测定
发酵液经10000r/min、4°C离心lOmin，取上清液(950uL)与AFB1 (50uL，终浓度lug/mL)混合，37°C下暗处反应24h。反应混合液用等体积(lmL)的二氯甲烷旋涡振荡萃取3次，萃取液于50°C下真空干燥。之后用lmL色谱甲醇溶解残余物，并用有机相滤膜(0.22μπι)过滤，混匀进样。以灭菌发酵培养基作为对照。色谱条件如下:液相色谱:岛津LC-20AD ;色谱柱:C18 (0DS-3,150mmX4.6mm, 5mm);流动相:甲醇:乙腈:水=1:3:6，流速:lmL/min ；进样量:20 μ L ;柱温:30°C ;检测波长:370nmo
图1是夏孢生枝孢Cladosporium uredinicola HSK8发酵温度优选的试验图。
图2是装液量对Cladosporium uredinicola HSK8降解AFB1的影响图。
图3是Cladosporium uredinicola HSK8接种量对AFB1降解率的影响图。
图4是Cladosporium uredinicola HSK8发酵周期对AFB1降解率的影响图。
图 5 是 Cladosporium uredinicola HSK8 发酵 36h 时对 AFB1 降解效果图。
图6是初始pH对AFB1降解率的影响图。
图7是Cladosporium uredinicola HSK8的发酵培养基碳源优化图。
图8是Cladosporium uredinicola HSK8碳源添加量的优化图。
【具体实施方式】
[0023]以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明