一种具有广谱农药降解特性的聚多曲霉的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株具有广谱农药降解特性的真菌聚多 曲霉PA F-2。
【背景技术】
[0002] 农药的广泛使用，在给农业生产带来快速高效的作物产量的同时，也给水体、土壤 和大气环境造成了严重的污染，还增加了农产品的产品安全问题。目前常用的农药修复方 法是炉窑焚烧、热脱附和化学处理等方法，但存在费用高，修复困难，容易造成二次污染等 情况。利用水体和土壤中能够将有机农药作为能源物质，并将其降解为无毒或者低毒化合 物的生物(主要为微生物)所建立的生物修复法，被公认为是一种高效、安全、无污染和廉价 的修复方式，同时，因为微生物在环境中的种类丰富多样、分布广泛、适应性强、易驯化易突 变等特点，在当前的农药生物修复中具有较好的优势。
[0003] 我国当前工业场地中常常存在复合型农药污染，且农药种类多元化，而当前研究 得到的高效农药降解微生物多为特异性的，即只对一种农药或者一类农药(如有机磷类或 者菊酯类农药)发生降解作用，在复合农药污染的工业场地土壤修复中存在明显的缺陷。同 时，只具有特异性农药降解的微生物在复合农药污染场地中，由于对其它多种有毒有机农 药缺乏耐受性，因而无法实现对农药的高效降解。同时，有机农药多具有对映体，这些具有 手性对映体结构的有机物在环境中常常会产生选择性环境行为，在环境中的消解和归宿会 产生很大差异，并且生物活性也往往存在差异。具有广谱农药降解特性的微生物，既可以对 多种农药保持耐受性，还能同时以多种农药为能源物质，对多种农药进行降解作用，然而这 方面的报道很少。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种从湖北省蕲州镇蕲农化工有限公司新厂区周边 植物根际、非根际土样和水样中筛选得到，对多种有机磷类、有机氯类、菊酯类和苯氧类等 农药具有高耐受性和高效降解性的真菌:聚多曲霉(Aspergillus sydowii)PA F-2,该菌于 2015年9月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC N0.M2015513。
[0005]该菌株的生物学特征主要有:该菌在液体和固体发酵培养基中的生长周期较长。 液体发酵培养基摇床振荡培养48小时内达到对数生长期，培养5天内达到稳定期，发酵液澄 清，真菌菌丝形成绿色或深绿色球状;在固体PDA培养基上，该菌菌落大小不规则，边缘为白 色绒毛状，成熟菌落中心显绿色，气生菌丝和基生菌丝发达，易挑取。菌落为不规则圆形，表 面粗糙，扁平隆起，无光泽;半湿润，易挑起;不透明白色，边缘为绿色环形;菌落较大，边缘 不整齐。在光学显微镜下观察，菌丝较细呈网状，直径约为〇.15μπι;孢子颜色为褐色，形状为 圆形，直径约为O.lOwii;孢子梗细长，直径均匀，分枝明显，叉状锐角分枝，分枝不相对称。
[0006] 从菌株聚多曲霉PA F-2的纯培养物中提取基因组DNA，运用rDNA内转录间隔区 (ITS)序列特定的引物ITS1/ITS4,通过PCR扩增，得到543bp长度的扩增产物，扩增产物经测 序公司进行序列测定，其序列如SEQ ID NO. 1所示。将序列与GenBank中的序列进行BLAST比 对，结果表明该菌株与聚多曲霉（Aspergillus sydowii)同源性很高，其相似度达到 99.6%。同时结合生理生化测试和形态结构观察结果分析，该菌株确定为聚多曲霉 (Aspergillus sydowii)。
[0007] 该菌株的广谱农药降解特性:在固体平板检测实验中，该菌株PA F-2能在以13种 当前常见的农药及中间合成物，有机磷:敌百虫、草甘膦、敌敌畏;有机氯:百草枯;菊酯类： 高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯;酰胺类:乙草胺;芳氧苯氧羧酸酯类:精喹禾 灵;苯氧类:2，4-D，苯氧基苯甲酸;苯环类:邻氯苯酚;作为固体培养基唯一碳源、唯一氮源 或者磷源(含有氮元素的农药作为唯一氮源，含有磷元素的农药作为唯一磷源）以及唯一碳 氮源或者碳磷源的培养基上正常生长，且生物量高，生长速率非常快。
[0008] 在液体摇瓶实验中，该菌株在以苯氧类农药2,4-D、有机磷类农药敌百虫、菊酯类 农药高效氯氰菊酯为惟一碳源的培养基中，生长速率非常快，降解率高。在培养48小时内完 全降解2,4-D，培养5天内完全降解高效氯氰菊酯，14天内对敌百虫的降解率超过80%。
[0009] 因此，本发明的第二个目的是提供聚多曲霉PA F-2在降解农药方面的应用，这13 种农药是有机磷:敌百虫、草甘膦、敌敌畏;有机氯:百草枯;菊酯类:高效氯氰菊酯、溴氰菊 酯、甲氰菊酯、联苯菊酯；酰胺类：乙草胺;芳氧苯氧羧酸酯类:精喹禾灵;苯氧类:2，4-D，苯 氧基苯甲酸;苯环类:邻氯苯酚。
[0010]由于目前国内外在广谱农药降解微生物的研究非常少，因此本发明筛选出的能降 解13种农药的聚多曲霉PA F-2在农药污染的水体环境治理、土壤环境治理以及当前工业场 地复合农药污染的综合治理中具有非常高的应用价值。
【附图说明】
[0011]图1是聚多曲霉PA F-2在光学显微镜下的孢子和孢子梗图；
[0012]图2是聚多曲霉PA F-2在rDNA内转录间隔区（ITS)无根系统发育树中位置图；
[0013] 图3是聚多曲霉PA F-2在以有机氯农药百草枯、有机磷农药敌百虫及敌敌畏和菊 酯类农药高效氯氰菊酯为能源物质的固体平板上的生长情况图；
[0014] 图4是响应球面分析方法分析聚多曲霉PA F-2在不同温度和pH值条件下的敌百虫 降解率图。
[0015]对于保藏真菌的生物学特性说明：
[0016] 该真菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0.M2015513。地址：中 国.武汉.武汉大学，拉丁学名:Aspergillus sydowii，中文名称为：聚多曲霉，该菌于2015 年9月7日保藏。
【具体实施方式】
[0017] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0018] 【实施例1】广谱农药降解菌的筛选
[0019] 实验土样和水样均采自于湖北省蕲州镇蕲农化工有限公司新厂区周边植物根际 和非根际土样，水样也采自于该厂区的5个排水口，土样和水样采集后，回实验室立即放于-20 °C保存，以杀死土壤中的昆虫和植物组织以及一些病毒。处理10小时之后，于4°C解冻，多 余的土样置于4°C冰箱保存。取10g 土样或者10mL水样，加入100mL灭菌的液体富集培养基 (含无菌玻璃珠）（富集培养基成分：蛋白胨10g/L，NaC11.0g/L，KH 2P031.0g/L，pH = 7)， 150rpm振荡7天。培养1周后，取富集培养基中的培养液10mL，分别加入含有50mg/L敌百虫 (TR)、马拉硫磷(MA)、百草枯(PA)、林丹(Lin)和高效氯氰菊酯(β-CP)的富集培养基中，再于 相同温度和振荡条件下培养1周。依次方式，按照浓度50，100，200，400和500mg/L驯化，